PENDAHULUAN

Kolom adalah tabung yang dikalibrasi lurus yang panjangnya antara 3 15 cm dan pada dinding
bagian dalam kadang kadang dilapisi dengan material inert seperti kaca atau PEEK
Kolom bisa terbuat dari sejenis plastik disebut cartridge atau terbuat dari stainless steel
Dimensi: diameter dalam 2-5 mm dan panjang 10-30 cm.
Kolom dapat dibeli sudah termasuk bahan isiannya, tapi juga dapat dibeli dalam keadaan kosong
lalu diisi sendiri.

LATAR BELAKANG
Kolom pada HPLC merupakan bagian yang sangat penting sebab pemisahan komponen komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.Pemilihan kolom pada HPLC merupakan langkah
yang pertama dan utama untuk penggunaan kromatografi. Kolom adalah jantung kromatografi,
Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan
yang sesuai
Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap performa kromatogram
Oleh karena itu ada beberapa hal yang harus diperhatikan :
1. Pemilihan kolom yang sesuai
2. Pemeliharaan kolom
3. Uji terhadap spesifikasi kolom( walaupun kolom tersebut merupakan kolom yamg siap
dipakai)
Kolom akan menjadi penentu keberhasilan pemisahan komponen sampel serta hasil akhir
analisis dengan HPLC,itulah sebabnya mengapa makalah ini dibuat

ISI / PEMBAHASAN
Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1.

Kolom analitik : Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50
-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2.

Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang
kolom 25 -100 cm.

Kolom biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur
yang lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.
Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan Liquid Solid Chromatography,
(LSC), Liquid Liquid Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution
Chromatography (EC)
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80 % atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 l / menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika
yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren

dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus
silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen
seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan
karena adanya kandungan air yang digunakan.

Jenis-jenis kolom HPLC

Nama kolom

Jenis adsorban

Ultrasil-Si

SiO2 (silika)

Ultrasil-octyl

Octana (C8)

Ultrasil-ODS

Octadecana (C-18)

LiChrosorb Si

SiO2 (silika)

LiChrosorb RP-2

Etana (C-2)

LiChrosorb RP-8

Octana (C8)

LiChrosorb RP-18

Octadecana (C-18)

LiChrosorb NH2

Amina

LiChrosorb CN

Cyano

Bentuk Partikel
Spherical atau irregular

Partikel spherical mengurangi tekanan dan kolom lebih awet

Ukuran Partikel
Umumnya 3-10m
Makin kecil ukuran partikel, makin tinggi efisiensi

Ukuran Pori-pori

Bervariasi antara 60-10,000

Makin besar pori-pori analit molekul besar dapat tertahan lebih lama.
Pilih 150 untuk sampel BM 2000.

KOLOM MONOLITIK
Batangan silika monolitik Kecepatan alir dapat ditingkatkan dengan resolusi yang baik, t
analisis cepat.
Boros eluen

Pori-pori besar kecepatan alir dapat ditingkatkan waktu analisis makin cepat

High Pure Silica

Spherical particles
Almost no metal impurities (< 5 ppm)
Excellent peak symmetry
Extended stability: pH range 1.5 to 10.5

irregular

spherical

monolithik

Kolom analitik
5 30 cm, 4 10 mm, paking dengan 3 10 cm,
N = 40.000 60.000 plat / meter.

jenis : C18, C8, sianopropil, penukar ion

dibuat dari

CH3

CH3

Cl Si R+ Si-OH + Si O Si R
CH3

CH3

Kolom pengaman/guard kolom:

5 cm, 4 6 mm, partikel > dari a
FUNGSI :
Menyaring kotoran
Menjenuhkan fasa diam

BAHAN ISIAN
Bahan isian kolom biasanya terbuat dari silika, untuk tujuan tertentu kadang-kadang digunakan
polymeric gelatau resin.

Kolom pada HPLC dibuat lurus ( tidak dibuat melingkar sebagaimana kolom pada kromatografi
gas ataupun bentuk U ) Hal ini dimaksudkan untuk efisiensi kolom