BAB V

PEWARNAAN

I.

TUJUAN
Mempelajari cara-cara pewarnaan
Mengamati bentuk-bentuk bakteri dan reaksinya terhadap zat kimia

II.

PRINSIP DASAR
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu jenis zat warna, bakteri mudah bereaksi

dengan pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa), zat warna
yang digunakan umumnya bersifat alkalin. Pewarna basa yang biasa digunakan adalah metilen
blue, kristal violet, karbolfuchsin.
Pewarna negatif tidak mewarnai mikroorganismenya tetapi mewarnai latar belakangnya
menjadi hitam gelap. Pewarnaan negatif menggunakan pewarna asam seperti eosin dan nigrosin.
Hasil pewarnaan negatif mikroorganisme kelihatan transparan. Pewarna-pewarna tersebut tidak
menembus mikroorganisme. Berguna juga untuk mengamati bentuk dan susunan sel yang sukar
diwarnai.
Pewarnaan gram yang berwarna ungu disebut juga gram positif dan yang berwarna merah
disebut gram negatif. Bakteri gram negative umumnya dapat menyebabkan sakit. Prinsip
pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel mengikat warna dasar (kristal violet) setelah
pencucian dengan alcohol 96%.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu

Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu

Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Endospora dibentuk oleh bakteri-bakteri tertentu bila kondisi lingkungan tidak

memungkinkan untuk kelangsungan hidup sel vegetative bakteri. Endospore dikelilingi oleh
suatu lapisan yang kedap air (impermeabel) yang disebut selabung spora. Dua reagen pewarnaan
spora, yaitu malakit hijau (pewarna dasar) dan safranin (zat warna lain).
Kapsul adalah lapisan lendir yang terdapat di sekeliling sel yang disekresikan oleh sel
dan melingkupi dinding sel. Kapsul dapat berfungsi sebagai cadangan makanan, perlindungan
terhadap fagositosis atau perlindungan terhadap dehidrasi, kemampuan membuat kapsul bersifat
genetis tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat ditumbuhkan
bakteri. Pewarnaan kapsul cukup sulit, karena kapsul mudah larut dalam air dan dapat berubah
tempat atau tercuci (saat pencucian). Dan juga pada proses fiksasi tidak boleh dipanaskan, karena
dengan pemanasan sel akan mengkerut akan terdapat akan terdapat bagian yang kosong antara
kapsul dan sel (pengamatan menjadi keliru). Reagen yang digunakan dalam pewarnaan kapsul
adalah Kristal violet 1% sebagai pewarna dasar yang akan mewarnai kapsul dan dinding sel dan
tembaga sulfat (CuSO4. 5H2O) 20% sebagai reagen pencuci warna dasar (dekolorisasi),
kemudian akan meresap dan diikat kapsul pada saat warna dasar habis tercuci.

III.

TEORI
Mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula

dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel
bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangkaian pengecatan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan
infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat
salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk
memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi
kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl
neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan
asam (Dwidjoseputro.1998).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang
digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif
dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat
pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka
zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion
negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah
pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan
dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi
digunakan untuk :

Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
Melekatkan bakteri pada glass objek
Mematikan bakteri
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan

kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan
zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau
malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam
yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).
Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering
digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri
dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat
juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus),
buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8
(saranae) (Lay.1994).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau
nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan

tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur
24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan
gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi
dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994)
Ciri-ciri gram negatif:

Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak

mengandung asam laktat.

Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:

Struktur dindingnya tebal

Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam

prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria
karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol
fuchsin juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994)
Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan
sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat
anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal
(Sutedjo,1991).

Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan
campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna
untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan
negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap
latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda positif biasa
seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau
alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan
nigrosin dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan
metode biasa.
Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan
iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk
desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium,
pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998).
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin
digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel
darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk
deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada
juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan
biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan
safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan
sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)
Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk
mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya
(Lay,1994).
IV.

ALAT dan BAHAN

-

Mikroskop

Pembakar spirtus

Jarum inokulasi
Obyek glass
Botol semprot

Staining jar
Kristal violet
Larutan iodium
Kertas isap
Biakan bakteri 24-48 jam
Metilen blue
Kertas lensa

Minyak imersi
Nigrosin
Xilol
Tusuk gigi
Safranin
Alcohol 96%

Bak dan rak pewarna

Penangas air
Biakan murni bakteri umur 48-72 jam
Malakir hijau
Kertas saring
CuSO4. 5H2O 20%

IV.1
V.

PROSEDUR
a. Pewarnaan Sederhana
- Membuat sediaan mikroskopik dari bahan biakan berusia 24-48 jam yang akan
-

diwarnai
Menuangkan sediaan tersebut dengan metilen biru, larutan zat warna harus menutupi

seluruh permukaan sediaan

Membiarkan selama 1-3 menit
Membilas sediaan dengan air menggunakan botol semprot, air dialirkan tidak boleh

terkena sediaan langsung

Mengeringkan di udara atau dengan menggunakan kertas isap, selipkan diantara dua

kertas isap
Mengamati sediaan dibawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif 100x

yang terlebih dahulu sediaan ditetesi minyak imersi

Setelah mengamati, membersihkan lensa objektif dengan menggunakan kapas yang

telah dibasahi xylol (untuk menghapus minyak imersi)

V.1
b. Pewarnaan Negatif
- Mengambil dua objek gelas yang telah dibersihkan
- Meneteskan satu tetes nigrosin / tinta bak dekat ujung kanan salah satu objek gelas
-

tersebut
Mengambil sedikit bahan dari antara gigi atau kotoran kuku dengan tusuk gigi (bisa
juga dengan menggunakan biakan murni bakteri), suspensikan bahan tersebut dengan

zat warna
Meletakkan satu objek gelas dengan sudut 45o terhadap objek gelas lain yang
mengandung suspense zat warna, sehingga cairan menyebar pada ujung objek gelas
tersebut, mendorong objek gelas kedua menuju keujung kiri objek gelas satu sehingga

didapatkan sediaan hapus lidah

Membiarkan kering di udara, jangan dipanaskan
Meneteskan satu tetes minyak imersi di atas sediaan yang telah kering, mengamati di

bawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif 100 x

Memilih bagian olesan yang dengan jelas memeperlihatkan sel-sel yang transparan

dengan latar belakang gelap

V.2
c. Pewarnaan Gram
- Membuat sediaan mikroskopik dari biakkan berumur 48 72 jam yang akan diwarnai
- Menuangkan karbol Kristal violet pada sediaan mikroskopik dan membiarkan selama
3 menit

Membuang kelebihan zat warna pada sediaan tersebut

Menuangkan larutan lugol, membiarkan selama 45 60 detik
Memasukkan kedalam alkohol 96% dalam beaker glas, menggoyang-goyangkan

selama 1 menit
Membilas dengan air menggunakan botol semprot, mengeringkan dengan kertas hisap
Menuangkan larutan safranin, membiarkan selama 3 menit
Mencuci dengan air menggunakan botol semprot dan mengeringkan di udara
Mengamati sediaan di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif 100x,

terlebih dahulu sediaan ditetesi minyak imersi

V.3
d. Pewarnaan Endospora
- Membuat apusan tiap bakteri yang berumur 48 -72 jam menetesi dengan malakit
melalui kertas isap pada penangas air selama 5 menit. Memperhatikan apusan dengan
-

VI.
VII.

pewarna jangan sampai kering, jadi selalu ditetesi pewarna

Menetesi kelebihan warna dengan air mengalir
Mengeringkan dengan kertas isap
Mengamati dengan mikroskop pembesaran 1000x. Menggambar bentuk sel vegetatif

dan endospore
V.4
e. Pewarnaan Kapsul
- Membuat apusan dari masing-masing bakteri. Jangan difiksasi panas
- Menetesi apusan dengan Kristal violet dan membiarkan terendam selama 5 7 menit
- Mencuci kelebihan zat pewarna dengan CuSO4. 5H2O 20%
- Mengeringkan hati-hati dengan kertas isap
- Mengamati dengan mikroskop pembesaran 1000x dan menggambarkanya.
V.5
DATA PENGAMATAN
PEMBAHASAN
a. Pewarnaan sederhana
b. Pewarnaan negatif
VII.1 Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan negatif menggunakan bakteri atau

mikroorganisme yang berasal dari udara , tidak ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan
bakteri dengan bentuk spiral dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna biru gelap
dan bakteri berwarna kuning.
VII.2 Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit
diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan
negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang

tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau
nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif) (Lay.1994).
VII.3
c. Pewarnaan Gram
VII.4

Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram negatif dengan warna merah

dan memiliki bentuk spiral. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah
mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci
dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna
merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding
selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol,
safranin, dan iodine (Lay.1994).
VII.5 Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang
berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi
sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian
terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut
terbawa air.
VII.6
VII.7

VIII.
IX.

VII.8
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA