Spektrofotometer

SPEKTROMETER : INSTRUMENNYA MEMAKAI CELAH

YANG TETAP PADA BIDANG YG FOKAL

SPEKTROFOTOMETER : SPEKTROMETER
YG DILENGKAPI DGN DETEKTOR YG
BERSIFAT FOTOELEKTRIK
SPEKTROFOTOMETRI : PENGUKURAN
INTERAKSI (HUBUNGAN) ANTARA
RADIASI ELEKTROMAGNETIK DGN
MOLEKUL/ATOM DARI SUATU BAHAN
KIMIA

PADA PRINSIPNYA INTERAKSI REM DGN MOLEKUL AKAN

MENGHASILKAN SATU ATAU DUA MACAM DARI TIGA KEJADIAN
YANG MUNGKIN TERJADI

HAMBURAN

(SCATTERING)
ABSORPSI (ABSORPTION)
EMISI (EMISION)

RADIASI
ELEKTROMAGNETIK
Al Hasan 400 SM : benda tampak oleh
panca indera mata karena benda tsb
memantulkan cahaya/sinar (An Noor)
Sir Isaac Newton : cahaya merupakan
zarrah (partikel yg sangat kecil) yg
dipancarkan keseluruh penjuru dgn
kecepatan yg tinggi (teori korposkuler)

 Max Planck : cahaya merupakan suatu

paket yg diskrik yg disebut foton
James Clark Maxwell : cahaya secara fisik
merupakan gelombang elektromagnetik,
artinya mempunyai vektor listrik dan
vektor magnet yg keduanya saling tegak
lurus dgn arah rambatan

Panjang Gelombang
Komponen listrik
Panjang gelombang

Arah
rambat
Panjang gelombang

Komponen magnet

Merupakan anggota teknik analisis

spektroskopik yg memakai sumber
radiasi elektromagnetik ultra violet dekat
(190 380 nm) dan sinar tampak (380
780 nm)

Keuntungan metode spektro UV-Cahaya

Tampak
1. Dapat digunakan untuk analisis
suatu zat dlm jumlah yg cukup kecil
2. Pengerjaannya cepat, sederhana dan
murah
3. Bersifat non destruktif
4. Metode analisis yg dikembangkan
umumnya cukup peka dan teliti serta
mudah dalam menginterprestasikan
hasil yang diperoleh.

Gambar Spektrum UV-Vis

Semua gugus atau gugusan atom yg

mengabsorpsi radiasi UV-Vis disebut sbg
kromofor.
Gugus fungsionil yg mempunyai elektron
bebas spt OH; O-NH2 dan OCH3 yg
memberikan transisi (n *) disebut
gugus auksokrom.

Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor akan

mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke
panjang gelombang yg lebih panjang (pergeseran merah
= batokromik) disertai peningkatan intensitas (efek
hiperkromik).
Pergeseran batokromik juga terjadi pada dua ikatan
rangkap yang terkonjugasi -C=C-C=C-

Hukum-hukum yg berkaitan
dgn spektrofotometri
HUKUM LAMBERT
Menyatakan hubungan antara energi radiasi
dari cahaya masuk (Io) dan energi dari
cahaya yg ditransmisikan (I) sbg fungsi
dari jarak yg dilalui cahaya (b) pada
konsentrasi (c) yang tetap.
Log I/Io = - ab
Log T
= - ab
I/Io = T
Log 1/T = ab
log 1/T = A
A
= ab

HUKUM BEER
Menyatakan hubungan antara energi radiasi
dari cahaya masuk (Io) dan energi dari
cahaya yg ditransmisikan (I) sbg fungsi
dari konsentrasi (c) pada jarak yg dilalui
cahaya (b) yg tetap
Log I/Io = - ac
Log T
= - ac
c = konsentrasi
Log 1/T
= ac
A
= ac

Kombinasi kedua hukum

diatas (Hukum LAMBERTBEER)
Menyatakan hubungan antara energi radiasi
dari cahaya masuk (Io) dan energi dari
cahaya yg ditransmisikan (I) sbg fungsi
dari konsentrasi ( c ) dan jarak yg dilalui
cahaya (b)
Log I/Io
Log T
Log 1/T
A

=
=
=
=

- abc
- abc
abc
abc

dasar perh. Spektro

1. Membandingkan serapan larutan standar

dan larutan uji
* Diukur serapan lart. Standar kemudian
lart uji

serapan uji

Konsentrasi uji =
X kons. standar
serapan standar

Keuntungan:
kondisi antara larutan standar dan uji sama
Kelemahan :
tidak ada standar, tidak bisa melakukan
perhitungan dgn cara ini

2. Menggunakan Kurva Baku

Metoda ini dengan cara membuat grafik
perbandingan antara lart. standar dalam
berbagai konsentrasi terhadap absorben.
abs
A5
A4
A3
Ax
A2
A1
10

20 X 30

40

50

Konsentrasi (g/ml)

Keuntungan:
jika jumlah sampel banyak, lebih praktis
Kelemahan :
1. linieritas (lurus) dari suatu kurva baku tidak
range thd konsentrasi, krn bila konsentrasi
terlalu tinggi, kurva akan menyimpang.
2. kurva baku tsb harus sering dicek bila
digunakan spektrofotometer lain dan reagensia
dari merk lain dari yg kita uji

3. Menggunakan Daya Serap (a) Atau Serapan

Jenis (A 1%,1cm) / Koefisien Extingsi
(E1%,1cm)
DAYA SERAP (a)
adalah serapan/absorban (A) dibagi dgn hasil
perkalian kadar ( c ) dinyatakan dalam gram/liter
dan tebal lapisan/kuvet (b) dinyatakan dlm cm.
A
a=

A
c =

b.c (g/l)

a.b

SERAPAN JENIS (A 1%,1cm)

adalah serapan/absorban (A) dibagi dgn hasil
perkalian kadar ( c ) dinyatakan dalam gram/100 ml
(%) dan tebal lapisan/kuvet (b) dinyatakan dlm cm.
A
A 1%,1cm =
b.c (g/100 ml)
A
C (g/100 ml) =

c = 10a
A (1%,1cm) . b

Keuntungan:
tidak ada standar, perhitungan dpt dilakukan dgn
cara ini
Kelemahan :
harga a / A 1%,1cm dlm literatur diperoleh dgn
cara dan peralatan yg mungkin berbeda dgn
instrumen yg kita pakai (kesalahan 5%)

Pada dasarnya Spektrofotometer tdd :

1.
Sumber energi/radiasi/cahaya
Monokromator
2.
3.
Tempat cell/kuvet
4.
Detektor
Amplifier
5.
6.
Recorder/alat pembaca

SUMBER RADIASI
Untuk tujuan pengukuran absorpsi
molekuler diperlukan suatu sumber
kontinyu yg mempunyai energi tdk
mengalami perubahan tajam pada daerah
panjang gelombang yg diinginkan.
Sumber radiasi pd Spektrofotometer UVVis ada dua :

Lampu D2
(Deuterium)/Hidrogen
Lampu ini menghasilkan spektrum
kontinyu dlm daerah UV ( 190-380 nm).
Pada pengukuran dgn lampu D2
sebaiknya digunakan kuvet dari bahan
silika/quartz (kuarsa), krn kalau dipakai
bahan gelas, gelas tsb akan
mengabsorpsi sinar UV shg absorban
yg dihasilkan akan tinggi (abs kuvet +
abs zat).
Umur/life time D2 sekitar 500 jam
pemakaian

Lampu Wolfram/Tungsten
Sumber radiasi yg umum digunakan
pd daerah cahaya tampak/visible
dan IR dekat adalah lampu filamen.
Pada kondisi operasi, hasil lampu
tungsten/wolfram ini memadai dari
kira-kira 325-900 nm.
Umur/life time lampu Tungsten sekitar
1000 jam

MONOKROMATOR
Berfungsi

memisahkan radiasi cahaya putih yg

polikromatis menjadi cahaya yg monokromatis
(mendekati monokromatis)

Monokromator

terdiri dari :

a. Celah/slit
sistem celah/slit pada monokromator
ada dua :
celah masuk (inslit) dan celah keluar
(exit slit)

Fungsi Celah/slit
menentukan sifat monokromatis radiasi
yg dihasilkan
menentukan sifat resolusi panjang
gelombang

b. Kolimator
c. Alat pendispersi
d. Lensa/cermin pemusat
Yang terpenting adalah Slit dan alat pendispersi

kolimator
inslit
Sumber
radiasi

Alat
pendispersi

Lensa/
cermin
pemusat

Exit
slit
kuvet

1. Monokromator Prisma
Komponen ini terbuat dr bahan kuarsa/silika yg
bisa digunakan untuk daerah UV-Vis maupun
IR

Prisma ada dua :

1. Prisma Cornu
Apabila merupakan prisma yg utuh, shg sinar
yg terdispersi akan diteruskan/ ditransmisikan
dan diterima oleh sampel.

monokromatis
polikromatis

2. Prisma Littrow
Berupa bangunan prisma, dibagian belakang
terdapat cermin. Sehingga sinar yg terdispersi
akan dipantulkan kembali, baru diterima oleh
sampel.

2. Monokromator Grating (kisi)

Dispersi radiasi UV-Vis dapat diperoleh dgn
menjatuhkan sinar polikromatis pada grating
transmisi atau pada permukaan grating refleksi.
Lebih praktis, shg banyak digunakan

Pada umumnya spektrofotometri melibatkan

larutan, dgn demikian memerlukan suatu
wadah/sel untuk menempatkan larutan di
dalam arah sinar.
Sel/kuvet tsb harus terbuat dari bahan yg dpt
meneruskan sinar dari daerah spektrum yg
digunakan

Bahan pembuat kuvet

Kuvet dari bahan leburan silika (kuarsa)
dapat dipakai untuk analisis pada daerah
pengukuran 190-1100 nm
Kuvet dari bahan gelas dipakai pada daerah
pengukuran 380-1100 nm, karena bahan gelas
mengabsorpsi radiasi UV
Kuvet dari bahan plastik, sering digunakan untuk
pengukuran pd daerah cahaya tampak.
Kelemahan : mudah korosif dgn pelarut tertentu

Matching of Cells
Adalah pasangan kuvet yg sama dan
identik betul.
Akan sangat penting untuk :
Spektrofotometer UV-Cahaya Tampak
Double Beam.
Analisis kuantitatif

Macam-macam detektor yg biasa digunakan

dlm Spektrofotometer UV-Cahaya tampak
Fotosel
Tabung Foton Hampa
Tabung Penggandaan Foton
(Photomultiplier Tube)
Photo Diode-Array (teknologi modern)

1.
2.

Dilihat dari sistem optiknya,

Spektrofotometer UV-Cahaya Tampak
dibagi menjadi dua :
Radiasi berkas tunggal (Single Beam)
Radiasi berkas ganda (Double Beam)

Pertama kali Spektro UV-Cahaya tampak yg

diperkenalkan untuk analisis kuantitatif adalah
Spektro dgn sistem optik radiasi berkas tunggal
(Single beam). Kemudian dgn kemajuan
elektronika mulai dipopulerkan Spektro radiasi
berkas ganda (Double beam), dgn asumsi
mengambil suatu keuntungan tdk terpengaruh
penurunan intensitas radiasi dari sumber radiasi
semula (Io), sehingga :
Io It dpt dikatakan konstan pd pengukuran
Io

Salah satu kelemahan Spektro radiasi berkas

ganda adalah :
1.

Tdk mungkin kedua kuvet yg dipakai adalah

betul-betul identik (matching)

2.

Intensitas radiasi yg menuju ke kedua kuvet

tdk mungkin betul-betul sama.
Sehingga pada era terakhir ini sistem optik
Spektro UV-Vis cenderung kembali ke sistem
optik radiasi berkas tunggal, krn ketelitian &
ketepatan pengukurannya lebih baik dari
sistem optik radiasi berkas ganda.

RADIASI BERKAS TUNGGAL (SINGLE

BEAM)

Sumber
radiasi

Monokromator

Sample
Compartment

Detektor

Amplifier

Recorder

RADIASI BERKAS GANDA (DOUBLE

BEAM)
Reference
cell

Monokromator
Sumber
radiasi

Detektor
Sample
Cell

Amplifier

Recorder

Pengukuran dgn Spektrofotometer yg

berbeda dpt memberikan sedikit
variasi pada yg diukur, oleh karena
itu dlm analisis lebih baik dicari
maksimum yg sebenarnya dari
instrumen yg kita pakai
Dapat menggunakan maksimum yg
tertera pada pustaka/monografi dgn
toleransi yg diperbolehkan.

Menurut Farmakope Edisi III hal 773 :

1.

2.
3.

Untuk pengukuran pd 240-280 nm

penyimpangan yg diperbolehkan adalah 0,5
nm dari yg ditentukan.
Pada 280-320 nm tidak boleh lebih dari 1 nm
Tidak lebih dari 2 nm diatas 320 nm

Menurut Farmakope Edisi IV hal. 1066 :

Toleransi yg diperkenankan lebih kurang
1 nm untuk jangkauan 200-400 nm dan lebih
kurang 3 nm untuk jangkauan 400 600 nm
Bila yg diamati melewati batas toleransi yg
diperbolehkan spt diatas, maka perlu dilakukan
kalibrasi thd Spektrofotometer yg digunakan

Kalibrasi panjang gelombang

Untuk kalibrasi ada beberapa cara standar yg
dpt dilakukan :
Spektrum garis lampu busur uap raksa

Spektrum garis lampu hidrogen atau

deuterium

Serapan maksimum holmium perklorat LP

Yang terbaik untuk kalibrasi adalah lampu busur

uap raksa pada serapan maksimum
253,70 nm; 287,15nm; 302,25nm;313,16 nm;
334,15 nm; 365,48 nm; 404,66 nm; 435,83 nm;
546,07 nm; 576,96 nm dan 579,07 nm.
Lampu Deuterium dengan garis spektra : 486,00
nm
Salah satu yg sering digunakan adalah holmium
filter yg memberikan pita-pita serapan yg khas &
tetap pada 241,15 nm; 361,50 nm dan 536,30
nm

Serapan suatu zat menunjukkan kerapatan

optik dr zat tsb dan besarnya utk setiap
berbeda. Ketepatan pengukuran serapan
bergantung pd jml sinar yg terdeteksi jg
pada alat-alat optik yg tdp didalamnya.

Kalibrasi skala fotometrik/serapan dpt

dilakukan dgn :
1. Lart. Kalium Nitrat (KNO3) p.a 1% (b/v) dlm
air suling.
Diukur serapannya pd 302 nm, lalu dihitung
A 1%,1cm, harga yg diperoleh harus berkisar
antara 0,70 0,71
2. Lart. Kalium bikromat (K2Cr2O7) p.a
Ditimbang 30,03 mg dlm 0,01 N H2SO4 hingga
diperoleh 500 ml larutan.
Hasil yg diperoleh dibandingkan dgn standar
yg ditentukan.

Toleransi yang
diperbolehkan

Panjang gelombang
Toleransi
(nm)
maksimum
235
122,9 126,2
257
142,4 145,7
313

47,0 50,3

350

104,9 108,2

Kesalahan-kesalahan dlm Spektrofotometri UVVisible

Timbulnya kesalahan dlm pengukuran
spektrofotometri disebabkan oleh adanya
penyimpangan hukum Lambert Beer dan
dikategorikan menjadi 2 kelompok, yaitu :
1. Penyimpangan instrumental
Misalnya :
* Bila sinar masih polikromatis
* Timbulnya sinar sesatan/cahaya sampingan/
stray light
* Adanya noise yg tinggi

2. Penyimpangan kimia
Disebabkan oleh pengaruh pelarut yg
mungkin dpt menimbulkan disosiasi,
asosiasi & reaksi tertentu yg hasilnya
berbeda dgn analitnya.
Sumber-sumber kesalahan dlm pengukuran
Sumbertsb perlu diperhatikan, selain itu kesalahan
utama sering dilakukan pd teknik
pelaksanaan penyediaan larutan sampel yg
akan dianalisis

Dianjurkan agar hasil lebih teliti sebaiknya

bekerja pd pengukuran larutan dgn
konsentrasi, dimana transmitannya
berkisar 80 20 %T atau absorbannya
berkisar 0,2 0,8.
Dari kondisi ini dpt diharapkan kesalahan
hanya 22-5 %.
Ketelitian maksimum akan diperoleh bila
bekerja pd 36,8 %T atau abs 0,4343

Kesalahan utama biasanya pd konsentrasi

larutan itu sendiri
sendiri..
Pada resapan rendah intensitas sinar masuk
dan sinar keluar hampir sama sehingga
kesalahan akan menjadi besar krn yg
dideteksi adalah perbedaan dari kedua
intensitas tersebut
tersebut..
Resapan tinggi energi yg diteruskan kecil shg
sukar diukur oleh detektor

(%)
k
e
s
a
l
a
h
a
n
r
e
l
a
t

25
20
15
Abs tinggi
10

Abs rendah

5
0

20

40

60

80

0,8

0,6

0,4

0,2

100 (%T)

I
f

(Abs)