FLUORIMETRI

SPEKTOMETRI
BERDASARKAN FLUORESENSI OLEH
MOLEKUL
 Setiap Metode Analisa Akan Dibahas
• Dasar dari metode
• Zat yang dapat dianalisa
• Instrumentasi
• Cara analisa dan
• Gangguan (interference) yang mungkin terjadi
 FLUORESENSI
• Setelah menyerap cahaya molekul akan
tereksitasi kemudian akan mengalami
relaksasi (molekul akan kembali ke ground
state) dengan memancarkan cahaya, atau
tanpa memancarkan cahaya.
• Pemancaran kembali cahaya setelah suatu zat
menyerap cahaya disebut fluoresnsi.
• Fluoresensi yang tertunda disebut
Phosporesensi.
 Diagram Energi Level Molekul

• A eksitasi
• B relaksasi tanpa radiasi
• C relaksasi dengan radiasi
Fluoresensi vs Phosporesensi
 Fluoresensi dan Konsentrasi
• Intensitas cahaya yang dipancarkan kembali
(F) akan sebanding dengan banyaknya cahaya
yang diserap.
F = K ( I0 - I ) atau F = K I0(1- (I / I0))
• Dari hukum Lambert – Beer
A = εbc dimana A = -log( I / I0 )
maka, log( I / I0 ) = - εbc
atau (I / I0) = 10 - εbc
• Kedua rumus digabung menjadi,
F = K I0 ( 1- 10 - εbc ) atau dapat ditulis
F = K I0 ( 1- e – 2,303 εbc ) dan dijadikan deret
McClaurin didapat,
F = K I0 (2,303 εbc – (2,303 εbc)2/2!+
(2,303 εbc)3/3! – (2,303 εbc)4/4! + …)
• Bila konsentrasi kecil ( c< 0,001 molar) maka
suku yang dipangkatkan akan dapat diabaikan
menjadi, F = K I0 (2,303 εbc )
• Bila I0 tetap dan K, ε, serta b yang juga tetap
maka rumus menjadi F = k c
 Zat yang bisa dianalisa dengan
Fluorimetri
• Zat yang bisa dianalisa adalah zat yang dapat
mengalami fluoresensi
• Zat Organik
Senyawa organik yang dapat mengalami flouresensi
adalah zat organik yang mempunyai ikatan rangkap
terkonjugasi.
Karbonil terkonjugasi, diena, dll.
Zat yang mempunyai gugus hidrokarbon
aromatik kecuali heterosiklik sederhana
 Contoh
Yang bisa mengalami fluoresensi
Contoh
Heterosiklik sederhana yang tidak dapat mengalami
fluoresensi
• Senyawa Anorganik
Beberapa senyawa anorganik dapat dianalisa dengan
fluorimetri dengan syarat dibuat kompleks dengan
senyawa organik yang dapat mengalami fluoresensi.
Ion Reagen panjang gelombang
(nm)
Al3+ Alizarin garnet 500
F- Komplek Al alizarin garnet 500
Cd2+ 2-(o-Hidroksiphenil) biru
benzoxazol
Li+ 8-hidroksiquinolin 580

Sn2+ flavanol 470

Zn2+ Benzoin hijau

 Instrumentasi

• Berikut ini diagram Fluorimeter

• Spektrofluorimeter
Sumber cahaya (Sama dengan
spektometri UV-Vis)
• Syarat sumber cahaya
Harus dapat menghasilkan cahaya yang
intensitasnya cukup besar di semua panjang
gelombang pada daerah uv-vis (200-780 nm)
• Lampu tungten untuk cahaya visible dan
lampu H2/D2 untuk cahaya uv.
• Lampu Xenon bisa menghasilkan cahaya dari
185-900 nm
Chopper (Sama dengan UV-Vis)
• Digunakan untuk menghalangi cahaya secara
periodik sehingga cahaya yang masuk sampel
seperti terpotong-potong. Akibatnya signal
listrik yang dihasilkan detektor akan menjadi
gelombang kotak dengan frekwensi tertentu.
Monokromator
• Digunakan untu memilih cahaya monokromatik dengan
panjang gelombang tertentu dari cahaya polikromatik.
• Ada dua monokromator yang terpasang pada
Spektrofluorimeter.
• Ada dua macam pemecah cahaya grating dan prisma.
• Monokromator Czerney-Turner : grating
• Monokromator bunsen : Prisma
Tempat Sampel
• Biasanya berbentuk silinder terbuat dari
quartz atau fused silica.
• Semua window harus terbuat dari quartz atau
fused silica.
 Detector
• Harus dipasang tegak lurus dari lintasan cahaya
eksitasi.
• Syarat : harus dapat mendeteksi cahaya di
daerah 200-900 nm walaupun intensitasnya
kecil.
• Phototube : bekerja berdasarkan efek
photolistrik.
• Photomultiplier : terdiri dari elemen
phothotube disusun berurutan.
Signal Prosessor
• Terdiri dari berbagai rangkaian elektronika yang
berfungsi antara lain:
a) Penguatan signal listrik (amplifier)
b) Filter listrik , hanya signal yang
frekwensinya sama dengan frekwensi
chopper yang dapat lolos.
c) Analoog to digital converter (ADC)
d) Averaging untuk meningkatkan signal to
noise ratio.
 Cara Analisa Dengan Fluorimeter
( = Spektrometri UV-Visible)
• Analisa Kualitatif: dengan melihat bentuk
spektrumnya. Jarang dilakukan karena kalau
bukan zat murni hampir pasti terjadi overlap
karena bentuk spektrum molekul broad
bands.
• Harus ada larutan blangko untuk mengukur I0
• Analisa kuantitatif sebaiknya dilakukan pada
panjang gelombang dengan absorbansi
tertinggi (λ max)
• Spectrum dibuat dengan menggunakan
standar tertinggi.
• Ada tiga cara analisa kuantitatif, metode satu standar, metode kurva
kalibrasi dan metode penambahan standar.
• Metode satu standar
Cukup mempunyai satu larutan standar yang harus
diukur absorbansinya.

F = kc, maka Fx = kcx dan Fs = kcs

Jadi Ax / As = cx / cs atau cx = (Fx / Fs )cs
Metode ini akan baik hanya bila harga cx
mendekati cs .

• Metode kurva kalibrasi

Harus mempunyai minimal 5 larutan standar dengan konsentrasi
yang berbeda yang kemudian diukur fluoresensinyanya. Kemudian
dibuat grafik danditentukan persamaan regresinya.
Fluoresensinyasampel di intrapolasi ke kurva kalibrasi untuk
mendapatkan konsentrasinya.
• Metode Penambahan Standar
Pada metode ini larutan sampel dipipet
minimum lima kali dengan volume yang sama
Vx dan dimasukkan ke dalam labu ukur yang
berbeda tetapi volumenya sama. Kemudian ke
dalam labu ukur tersebut dimasukkan larutan
standar dengan volume yang divariasi vs.
Selanjutnya ditambahkan pereaksi (bila
diperlukan) dan diencerkan sampai tanda
batas. Masing- masing larutan yang telah
dibuat diukur fluoresensinyanya.
Maka didapat
F = Fx + Fs
F = kc’x + kc’s
dimana,
c’x = konsentrasi sampel yang telah
diencerkan dan
c’s = konsentrasi standar yang telah
diencerkan
jadi berlaku rumus pengenceran,
c’x = cx vx / vlabu
c’s = cs vs / vlabu
sehingga,
F = (k cx vx / vlabu ) + (k cs / vlabu )vs
Dalam rumus tersebut yang berubah hanya F
karena perubahan vs , jadi bila dibuat kurva
volume standar vs melawan fluoresensi F
didapat garis lurus dengan,
Intersep = (k cx vx / vlabu ) dan
Slope = (k cs / vlabu )

(Intersep / slope) = cx vx / cs
Jadi cx = (Intersep / slope) cs / vx
Intersep dan slope bisa didapat dari
persamaan regresinya.
Contoh
Dari sampel air akan ditentukan kadar besinya.
Ke dalam lima labu ukur yang volumenya 50 ml
dimasukan masing-masing 10 ml sampel air. Kemudian
berturut- turut dimasukkan 0,00; 5,00; 10,00; 15,00
dan 20,00 ml larutan standar 11,1 ppm Fe3+, sebelum
diencerkan sampai tanda batas ditambahkan 10 ml
KCNS ke dalam masing-masing labu ukur untuk
menjadikan semua Fe menjadi (FeCNS)2+ yang
berwarna merah. Setelah diencerkan diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 574 nm dan
didapat hasilnya berturut-turut 0,240; 0,437; 0,621;
0,809 dan 1,009. Hitunglah berapa ppm kadar Fe dalam
sampel air.
Jawab

• Dengan regresi linier Volume standar melawan

absorbansi didapat
F = 0,2412 + 0,03820 vs
Jadi cx = (0,2412/0,03820) 11,1/10 ppm
cx = 7,01 ppm