Ligasi dan Transformasi

Nadira Putri Pinasthika

1306370814

Deskripsi DNA Ligase

Enzim yang dibutuhkan untuk
memperbaiki, replikasi, dan
rekombinasi DNA

Digunakan untuk mengkatalisis formasi ikatan

fosfodiester pada ikatan tunggal yang berasal dari
pecahan ikatan ganda

Memiliki sekuens asam amino, ukuran molekul

dan sifat yang berbeda-beda tiap jenisnya.
Ada 2 jenis DNA ligase berdasarkan spesifisitas
kofaktornya, DNA ligase yang membutuhkan
NAD+ dan DNA ligase yang membutuhkan ATP

Kebutuhan Proses Ligasi

Apa yang dibutuhkan untuk proses ligasi?
1. Dua atau lebih fragmen DNA yang memiliki
ujung blunt ataupun ujung sticky
2. Larutan buffer yang mengandung ATP. Larutan
buffer biasa disiapkan pada konsentrasi tertentu
hingga konsentrasi ATP mencapai 0,25 sampai 1
mM.

3. DNA ligase T4. Reaksi pemasukkan

fragment ke dalam plasmid
(subkloning) akan membutuhkan
sekitar 0,01(untuk ujung sticky)

Mekanisme DNA Ligase

Mekanisme secara umum:
1. Aktivasi ligase dengan
membentuk sebuah protein
kovalen (AMP intermediet)
2. Bagian AMP ditransfer dari
ligase ke grup fosfat ujung 5
pada pecahan untai tunggal
3. DNA ligase mengkatalisis
proses ligasi tersebut
dengan menghilangkan AMP
bebas

Tahapan Ligasi Endo-1,4-beta-Dglukanase

Reaksi
DNA yang

Vektor
didefosf
orilasi
menggu
nakan
10 unit
alkalin
fosfatas
e

tersebut
diinkubasi
pada 37C
selama 1
jam dan
enzim akan
denaturasi
pada 65C
selama 1
jam

telah
didefosfori
Memasuk
lasi
kan
dipurifikas
vektor
i dengan
dengan
DNA
perbandi
purificatio
ngan 3:1
n kit (MBI
Fermentas
)
Reaksi tersebut diinkubasi
dalam larutan buffer DNA ligase
(50 mM Tris-HCl pada pH 7,6; 10
mM MgCl2; 1 mM ATP dan 1 mM
DTT) selama 24 jam pada suhu
28C

Transformasi DNA
Ekspresi materi genetik asing yang
masuk melalui dinding sel.
Diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun
1982, berdasarkan penelitian bahwa suatu bakteri
dapat melepaskan fragmen DNAnya ke dalam
suatu medium yang kemudian akan masuk ke
dalam sel bakteriyang lain dalam kultur tersebut.
Bakteri diubah menjadi kompeten (istilah untuk bakteri
yang siap bertransformasi), misalnya dengan
mendinginkannya pada larutan yang mengandung
kation divalen seperti Ca2+ untukmembuat dinding sel
menjadi permeable dan dapat dilalui oleh DNA plasmid.

Proses Transformasi
Molekul DNA rantai ganda berikatan pada
reseptor yang terdapat dipermukaan sel.
Perikatan ini bersifat reversible.
Pengambilan DNA donor yang bersifatirreversible.
Pada saat ini DNA donor menjadi resisten terhadap
enzim DNAase di dalammedium.
Konversi molekul DNA donor yang berupa
rantaiganda menjadi molekul rantai tunggal melalui
degradasi nukleotida terhadap salah satu rantai.
Integrasi (insersi kovalen) seluruh atau sebagian
unting tunggal DNA donor tersebut kedalam
kromosom resipien.
Segregasi danekspresi fenotipik gen donor yang
telah terintegrasi

Teknik Heat-Shock

Teknik Elektroporasi

Referensi
Sajidan. 2011. Transformasi Ekspresi Gen Asing dalam Sel Bakteri.
[http://sajidan.staff.fkip.uns.ac.id/2011/02/28/transformasi-ekspresi-genasing-dalam-sel-bakteri/] diakses pada Sabtu, 3 Oktober 2015 pukul 21.29
Sitorus, Dame Hartini Afrian. 2014. TRANSFORMASI BAKTERI DENGAN DNA
DAN EKSPRESINYA. Bogor.
[https://www.academia.edu/9702710/TRANSFORMASI_BAKTERI_DENGAN_D
NA_DAN_EKSPRESINYA] diakses pada Sabtu, 3 Oktober 2015 pukul 21.00
Ahmed, Sibtain dkk. 2003. Cloning of Endoglucanase Genefrom Trichoderma
harzianum in E.coli. Pakistan: Pakistan Journal of Life Science.
[http://www.pjlss.edu.pk/pdf_files/2003_2/122-126.pdf] diakses pada Jumat,
2 Oktober 2015 pukul 22.00
Doherty, Aidan J. dkk. 2000. Structural and Mechanistic Conservation in DNA
Ligation. Amerika: Oxford University Press
[http://nar.oxfordjournals.org/content/28/21/4051.full.pdf+html] diakses
pada Jumat, 2 Oktober 2015 pukul 21.48
Anonim. 1999. DNA Ligation.
[http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.
html] diakses pada Jumat, 2 Oktober 2015 pukul 22.17