1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kacang hijau merupakan tanaman legum yang cukup penting di Indonesia
dan posisinya menduduki tempat ketiga setelah kedelai dan kacang tanah. Bila
dibandingkan dengan kacang-kacangan lain, kacang hijau memiliki kelebihan
antara lain berumur genjah, lebih toleran kekeringan, dapat ditanam dilahan
kurang subur dan sekaligus bisa sebagai penyubur tanah karena mampu
bersimbiosis dengan bakteri rhizobium, budidaya mudah dan hama yang
menyerang relatif sedikit (Yugi dan Harjoso, 2012).
Pembudidayaan kacang hijau (V. radiata) masih tergolong rendah karena
sistem pertanian yang sederhana dan kurang minatnya petani untuk menanam.
Kacang hijau (V. radiata) di Indonesia menempati urutan ketiga terpenting sebagai
tanaman pangan legum, setelah kedelai dan kacang tanah. Saat ini terbatasnya
lahan pertanian membuat petani lebih memilih tanaman pangan yang lainnya
(Chusnia dkk, 2013).
Sehubungan dengan hal tersebut maka perlu dilakukan penelitian tentang
koleksi, isolasi dan purifikasi mikroba dari tanaman jenis legume agar diperoleh
biakan murni , yang dapat digunakan kembali untuk membantu tersedianya unsur
hara seperti nitrogen bagi tanaman, sehingga diharapkan mampu meningkatkan
pertumbuhan tanaman (Purwaningsih, 2008).
Bakteri Rhizobium telah lama digunakan sebagai pupuk hayati terhadap
tanaman kacang-kacangan karena dapat membentuk bintil akar sehingga dapat
mengikat nitrogen bebas. Secara umum inokulasi dilakukan dengan memberikan

biakan Rhizobium kedalam tanah agar bakteri ini berasosiasi dengan tanaman
kedelai mengikat N2 bebas dari udara (Azizah, 2011).
Cara pengambilan mikroba dari tanaman simbiosisnya adalah dengan
teknik isolasi. Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba
tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.
Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobianya berasal dari pembelahan dari
satu sel tunggal. Isolasi dapat dilakukan dengan dua metode yaitu metode cawan
tuang dan metode cawan gores (Mutiara, 2006).
Purifikasi atau disebut juaga pemurnian adalah pemisahan satu jenis
mikroorganisme patogen dari media inokulasi yang terdiri mungkin saja, dari
beberapa macam mikroorganismedalam satu media, purifikasi ini dilakukan
untuk

memudahkan

dalam

pengidentifikasian patogen

tersebut

(Semangun, 1996).
Tujuan Percobaan
Adapun tujuan percobaan ini adalah agar mahasiswa mengetahui cara
mengisolasi bakteri Rhizobium, cara purifikasi bintil akar Kacang Hijau
(Vigna radiatus L.) dan pewarnaan bakteri Rhizobium.
Kegunaan Penulisan
Adapun kegunaan penulisan ini adalah sebagai salah satu syarat untuk
dapat mengikuti praktikum di laboratorium Ekologi dan Biologi Tanah Program
Studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan
sebagai bahan informasi bagi pihak yang membutuhkan.

TINJAUAN PUSTAKA
Kacang Hijau (Vigna radiatus L.)
Dalam dunia tumbuhan tanaman ini diklasifikasikan sebagai berikut :
Divisi : Spermatophyta, Sub divisi : Angiospermae, Kelas : Dicotyledone, Ordo :
Rosales, Family : Leguminosae (Fabaceae), Genus : Vigna, Spesies :
Vigna radiate atau Phaseolus radiates (Siska, 2011).
Tanaman kacang hijau berakar tunggang. Sistem perakarannya dibagi
menjadi dua yaitu mesophytes dan xerophytes. Mesophytes mempunyai banyak
cabang akar pada permukaan tanah dan tipe pertumbuhannya menyebar,
sementara xerophytes memiliki akar cabang lebih sedikit dan memanjang ke arah
bawah (Siska, 2011).
Agar dapat tumbuh dan berproduksi dengan baik, penting memperhatikan
dan menggunakan teknik budidaya yang baik dan benar. Berikut ini syarat tumbuh
dan langkah-langkah dalam membudidayakan kacang hijau Tanah yang cocok
untuk pertumbvuhan kacang hijau adalah tanah dengan Tekstur liat berlempung
banyak mengandung bahan organik, aerasi dan drainase yang baik. Struktur tanah
gembur, dengan tingkat keasaman (pH) 5,8 - 7,0 optimal 6,7. Kacang hijau
menghendaki curah hujan optimal 50 - 200 mm/bln; dengan temperatur 25- 27 0C
dengan kelembaban udara 50 - 80% dan cukup mendapat sinar matahari
(Raihana dkk, 2006).
Bakteri Rhizobium
Bakteri rhizobium adalah salah satu contoh kelompok bakteri yang
berkemampuan sebagai penyedia hara bagi tanaman. Menurut Rahmawati (2005)
Bila bersimbiosis dengan tanaman legume, kelompok bakteri ini akan

menginfeksi akar tanaman dan membentuk bintil akar di dalamnya. Rhizobium

hanya dapat memfiksasi nitrogen atmosfer bila berada di dalam bintil akar dari
mitra legumnya. Peranan rhizobium terhadap pertumbuhan tanaman khususnya
berkaitan dengan masalah ketersediaan nitrogen bagi tanaman inangnya
(Pasaribu, 2011).
Rhizobium adalah bakteri tanah yang berbentuk batang dengan ukuran
1.2-3.0 pm dan lebar 0.5-3.0 pm. Rhizobium mempunyai kemampuan membentuk
bintil akar bila bersimbiosis dengan tanaman leguminosa. Di dalam akar tanaman
leguminosa, Rhizobium mampu menambat N2 dari atmosfir dan merubahnya
menjadi amonia (NH3), sehingga dapat dimanfaatkan oleh tanaman inang.
Sedangkan Rhizobium sendiri memperoleh karbohidrat sebagai sumber energi
dari tanaman inangnya (Heliati, 2003).
Bakteri Rhizobium hanya dapat bersimbiosis dengan tumbuh-tumbuhan
legum, dengan menginfeksi akarnya dan membentuk bintil akar di dalamnya.
Istilah simbiosis umumnya diartikan sebagai adanya kemitraan

yang saling

menguntungkan antara dua organisme. Pada simbiosis dalam bintil akar legum,
legumnya merupakan mitra yang lebih besar sedangkan Rhizobiumnya mitra yang
lebih kecil, sering disebut dengan mikrosimbion (Rao, 1994).
Penambatan nitrogen secara biologis diperkirakan menyumbang lebih dari
170 juta ton nitrogen ke biosfer per tahun, 80% di antaranya merupakan hasil
simbiosis antara bakteri Rhizobium dengan tanaman. Dalam keadaan lingkungan
yang memenuhi persyaratan tumbuh, simbiosis yang terjadi mampu memenuhi
50% atau bahkan seluruh kebutuhan nitrogen tanaman yang bersangkutan dengan
cara menambat nitrogen bebas (Purwaningsih, 2008).

Proses terjadinya nodula akar pada tanaman kacang-kacangan sehubungan

dengan hadirnya rhizobium dapat dikemukakan sebagai berikut:
a) Bakteri Rhizobium berkerumun di sekitar rambut-rambut akar di perkebunan
(secara alami) maupun pada media buatan dengan pemberian inokulan
(preparat hidup bakteri Rhizobium)
b) Sehubungan dengan berkerumunnya bakteri tersebut, rambut akar akan
mengekskresi/mengeluarkan triftopan, yang selanjutnya oleh bakteri diubah
ke indol asetat
c) Kehadiran indol asetat mengakibatkan rambut-rambut akar mengeriting
(mengerut), sedang kegiatan bakteri lebih lanjut menghasilkan enzim yang
dapat melarutkan senyawa pektat yang terdapat dalam fibril (sellulosa)
kulit/selaput rambut akar sehingga terikat
d) Bakteri Rhizobium sehubungan dengan hadirnya larutan-larutan pektat
selanjutnya akan berubah bulat, kecil-kecil, dan dapat bergerak
e) Sehubungan senyawa pektat tadi mengikat selllulosa, hal ini berpengaruh
pada selaput rambut akar, menjadi sangat tipis, mudah ditembus oleh bakteri
rhizobium
f) Bakteri masuk ke dalam rambut-rambut akar dan berkembang/berlipat ganda
dan selanjutnya masuk ke dalam akar dengan membentuk benang infeksi,
dengan demikian pada setiap sel akar didapatkan koloni-koloni bacteria
g) Proses terakhir yaitu dengan terbentuknya nodula/bintil akar
(Sutedjo dkk., 1991).

Isolasi Bakteri Rhizobium

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian

dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis,

misalnya telah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang
hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba
adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari
campuran bermacam-macam mikroba (Sutedjo, dkk.,1991).
Isolasi

bakteri

merupakan

suatu

cara

untuk

memisahkan

atau

memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur murni

atau biakan murni. Ada beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu dengan cara
goresan (streak plate), cara tuang (pour plate), cara sebar (spread plate), dan
micromanipulator (Thomas dkk, 2011).
Untuk proses identifikasi maupun isolasi jenis tertentu saja, dilakukan
proses pembuatan isolat tunggal dari isolat campuran tersebut. Isolat tunggal atau
biakan murni merupakan biakan yang asalnya dari pembelahan satu sel tunggal.
Ada beberapa metode untuk memperoleh biakan murni dari isolat campuran. Dua
di antaranya yang sering digunakan adalah teknik cawan gores dan teknik cawan
tuang. Prinsip dari kedua teknik tersebut sama, yaitu mengencerkan biakan
campuran hingga setiap individu spesies dapat dipisahkan, sehingga setiap koloni
yang terbentuk merupakan hasil dari pembelahan satu sel (Ammy, dkk., 2008).
Purifikasi Bakteri Rhizobium
Proses purifikasi adalah metode untuk mendapatkan komponen bahan
alam murni bebas dari komponen kimia lain yang tidak dibutuhkan. Untuk
tingkatan kemurnian (purity) suatu struktur senyawa tertentu, kemurnian bahan
harus 95-100% . Sedangkan ekstrak terpurifikasi harus dijelaskan bahwa ekstrak
terpurifikasi dari komponen apa sehingga tidak menimbulkan multipersepsi.

Komponen kimia dalam ekstrak yang tidak dibutuhkan seperti lipid, pigmen
(klorofil), tanin, plastisiser, dan pelumas yang dapat berasal dari alat
(Juntono, 1981).
Purifikasi dilakukan setelah kita melakukan isolasi bakteri. Koloni yang
tumbuh pada cawan isolasi diambil menggunakan jarum ose kemudian
menanamkannya pada cawan petri baru yang telah diisi dengan media agar
(kondisi media agar di cawan petri baru sudah dingin atau padat) dengan teknik
cawan gores secara kuadran (Iud, 2007).
Prinsip dari purifikasi mikroba adalah upaya mendapatkan hasil biakan
murni dari suatu mikroorganisme yang bebas dari senyawa lain (kontaminan)
media. Dalam hal ini hanya terdapat satu jenis spesies mikroorganisme dalam
media tersebut untuk memudahkan pengidentifikasian mikroorganisme tersebut
(Juntono, 1981).
Pewarnaan Bakteri
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya
sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan
zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan
inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Iskamto, 2013).
Selsel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH
lingkungannya mendekati netral. Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung
dengan muatan positif dari ion zat warna misalnya methylen blue, sehingga selnya

akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang menyebabkan adanya ikatan atau
gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Iud, 2007).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan

antara

pneumokokus

dan

bakteri

Klebsiella

pneumonia

(Iskamto, 2013).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka (Puspitasari, dkk, 2012).

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Percobaan

Percobaan dilakukan di laboratorium Biologi dan Ekologi Tanah Fakultas

Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dengan ketinggian tempat + 20 m
dpl. Percobaan ini dilakukan pada tanggal September 2014 sampai dengan selesai.
Bahan dan Alat
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Rhizobium
dari akar kacang hijau sebagai bahan percobaan isolasi, media agar digunakan
sebagai media tanaman rhizobium, air steril sebagai pembersih akar tanaman,
alcohol 96 % untuk mensterilkan alat dan bahan, CaCl2 digunakan sebagai
pengawt, kapas sebagai perantara antara CaCl2 dan bintil akar, dan air aquadest
sebagai bahan pensteril alat, K2HPO4 1,0 g / 2 L media YEM padat dan 0,5 g / 1 L
media YEM cair, MgSO4.7H2O 0,4 g/ 2 L media YEM padat dan 0,2 g/ 1 L media
YEM cair, NaCl 0,2 g / 2 L media YEM padat dan 0,1 g / 1 L media YEM cair,
Manitol 20 g/ 2 L media YEM padat dan 10 g / 1 L media YEM cair, Air Destilate
1800 untuk YEM padat dan 900 untuk YEM cair, agar 4 bungkus untuk YEM
Padat, yeast 1 g / 2 L media YEM padat dan 0,5 g / 1 L media YEM cair, cairan
violet sebagai pewarnaan bakteri, Yodium sebagai pewarnaan bakteri, dan
Safranin untuk pewarnaan bakteri
Adapun alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah petridish sebagai
media agar, tabung tempat koleksi bintil akar, cling warp untuk menyelimuti atau
melapisi petridish, aluminium foil untuk membungkus media agar streril, jarum
ose untuk inokulasi, masker sebagai pelindung mulut, bunsen sebagai pembakar,
gunting sebagi alat untuk memotong bintil akar, label sebagai penanda alat
laboratorium, autoklaf untuk sterilisasi media YEM, oven sebagai pensteril alat-

10

alat, erlenmeyer sebagai wadah media YEM, kaca preparat sabagai tempat
pengamatan pewarnaan bakteri dan kamera sebagai dokumentasi.
Prosedur Percobaan
Pembuatan Media
-

Ditimbang bahan K2HPO4 0,5 g , MgSO4.7H2O 0,2 g, NaCl 0,21 g, yeast

0,5 g, Mannitol 10 g.

Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer

Ditambahkan aquadest sebanyak 200 mL

Distirrer hingga merata

Diukur pH sampai 6,5 -6,8, jika < 6,5 ditambahkan NaOH, jika > 6,5
ditambahkan NaCl.

Dimasukkan aquadest sampai 1 Liter

Dimasak diatas kompor sampai mendidih

Dituang ke dalam Erlenmeyer 500 mL untuk dibagi dua

Disterilkan dengan autoklaf pada tekanan 121 psi

Setelah selesai dikeluarkan dam ditunggu hingga dingin

Dituangkan ke dalam petridish dalam Laminar Air Flow.

Pengkoleksian Bintil Akar

-

Disiapkan tabung ukuran + mL

Dimasukkan CaCl2 kedalam tabung isi sampai sepertiga bagian tabung

Ditutupi CaCl2 dengankapas sampai menutupi keseluruhan bagian dari

CaCl2 tersebut

Disumbat mulut dengan kapas dan aluminium foil

Diberi label pada tabung

11

Disimpan dalam freezer.

Isolasi Bakteri Rhizobium

-

Dibersihkan bintil akar dengan alcohol, kemudian aquadest, terakhir

dengan air steril

Disterilkan pinset dengan Bunsen

Dipecahkan bintil akar yang aktif dengan pinset sehingga keluar cairan
merah

Disterilkan jarum ose dengan pembakaran di Bunsen

Diambil cairan merah itu dengan jarum ose

Digoreskan cairn tersebut pada media yang telah disiapkan

Dibungkus petridish dengan cling warp

Disimpan dalam LAF agar tidak terkontaminsi

Setelah tumbuh digoresannya, dilakukan purifikasi

Purifikasi Rhizobium
-

Diambil petridish yang berisi biakan yang telah tumbuh pada goresan

Dipanaskan di atas Bunsen untuk mencegah kontaminasi

Diambil biakan yang tumbuh di goresan dengan menggunakan jarum ose

disekitar Bunsen

Digoreskan kembali pada media YEM yang baru

Dibungkus dengan cling warp dan disimpan pada LAF untuk mencegah
kontaminasi.

Pewarnaan Bakteri

12

Diambil petridish yang berisi biakan murni yang telah tumbuh pada

goresan
Disediakan kaca preparat
Diambil biakan murni dengan menggunakan jarum ose dan digoreskan

pada kaca preparat

Difiksasi pada diatas bunsen hingga kering, tapi jangan sampai mengenai

api agar bakteri tidak mati

Ditetesi cairan Violet sebanyak 2-3 tetes sampai mengenai semua goresan,

didiamkan sampai kering

Dibilas dengan aquades sampai bersih
Ditetesi dengan yodium sebanyak 2-3 tetes sampai mengenai semua

goresan, didiamkan sampai kering

Dibilas dengan aquades sampai bersih
Ditetesi safranin 2-3 tetes sampai mengenai semua goresan, didiamkan

sampai menyerap
Dibilas aquades hingga bersih
Dibilas dengan alcohol, dan didiamkan beberapa menit
Dibilas dengan aquades hingga bersih
Diamati dibawah mikroskop
Didokumentasikan hasil pengamatan

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil
Dari hasil percobaan isolasi dan purifikasi rhizobium didapati bahwa isolat
tumbuh terkontaminasi yang disajikan pada gambar 1 dan gambar 2.

13

Gambar 1. Hasil Isolasi Rhizobium

Gambar 2. Hasil Purifikasi Rhizobium

Hasil dari pewarnaan bakteri pada bakteri Rhizobium disajikan pada

gambar 3 dan gambar 4.

Gambar 3. Hasil pada Preparat

Gambar 4. Hasil pada Mikroskop

Pembahasan
Dari percobaan didapat hasil isolasi bakteri rhizobium pada media padat
YEM dengan teknik goresan terdapat tumbuhnya jamur pada isolat bakteri
rhizobium. Hal ini dikatakan bahwa dalam media biakan belum murni, karena
terdapat organism yang tidak diharapkan tumbuh pada biakan murni. Proses
penumbuhan bakteri yang tidak steril menyebabkan tumbuhnya jamur pada
biakan murni, hal ini dapat dapat terjadi karena pada saat penuangan media tidak
tepat, penggoresan yang tidak steril, dan penutupan petridish yang tidak tertutup
rapat menyebabkan organisme yang lain tumbuh pada media biakan. Dengan
tumbuhnya mikroorganisme yang tidak diharapkan maka belum bisa dikatakan
proses Isolasi. Hal ini sesuai dengan literatur Sutedjo dkk (1991) yang menyatakan

14

bahwa prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba.
Dari percobaan Purfikasi didapat hasil bahwa terjadinya kontaminan,
adanya organisme lain yang tumbuh pada media biakan murni. Tumbuhnya jamur
pada media biakan dapat disebabkan oleh operator dan cara purifikasi yang tidak
tepat menyebabkan kontaminan pada biakan murni rhizobium. Dengan adanya
kontaminasi maka belum dapat dikatakan proses purifikasi. Hal ini sesuai dengan
literatur Juntono (1981) yang menyatakan bahwa prinsip dari purifikasi mikroba
adalah upaya mendapatkan hasil biakan murni dari suatu mikroorganisme yang
bebas dari senyawa lain (kontaminan) media.
Dari percobaan pewarnaan bakteri didapat hasil bahwa pewarnaan bakteri
terlihat berwarna merah atau dapat disebut sebagai bakteri gram negatif. Hal ini
disebabkan karena pada saat bakteri gram negatif ditetesi dengan metil ungu tidak
bisa mempertahankan zat warna metil ungu setelah dicuci dengan alkohol,
sehingga akan memperlihatkan warna merah. Hal ini sesuai dengan literature
Puspitasari dkk (2012) yang menyatakan bahwa bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak.

KESIMPULAN
1. Hasil dari isolasi bakteri Rhizobium pada kelompok 7 terjadi kontaminan
karena di dapati tumbuhnya jamur pada media biakan murni
2. Hasil dari purifikasi bakteri Rhizobium dari isolasi terjadi kontaminan,
didapati adanya jamur tumbuh pada media biakan murni.

15

3. Bakteri Rhizobium pada pewarnaan bakteri ialah bakteri gram negative,

karena didapat warna merah pada pewarnaan.

DAFTAR PUSTAKA
Ammy, Yanti H., Kusnadi. 2008. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar.
Universitas Jendral Soedirman. Purwokerto
Azizah. 2011. Pengauh Tiga Inokulan Bakteri Rhizobium Terhadap Pembentukan
Bintil Akar Tanaman Kedelai (Glycine max L. Merril). Universitas
Andalas. Padang.

16

Chusnia, W., T. Surtiningsih., dan Salamun. 2013. Kajian Aplikasi Pupuk Hayati
dalam Meningkatkan Pertumbuhan dan Produksi Tanaman Kacang Hijau
(Vigna radiate L.) pada Polybag. Universitas Airlangga. Surabaya.
Heliati, I. 2003. Teknik Isolasi rhizobium alam dari tanah Balai Penelitan Ternak.
Bogor
Iskamto, B. 2011. Pewarnaan Sederhana, Negatif, Kapsul dan Gram. Sekolah
Tinggi Ilmu Kesehatan. Yogyakarta.
Juntono. 1981. Prospek Inokulasi Pada Peningkatan Produksi Kedelai dan
Leguminosa Lainnya. Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian. UGM.
Yogyakarta.
Iud, W. 2007. Mikrobiologi Umun. Malang: UMM Press.
Mutiara, T. 2006. Ilmu Pengetahuan Alam. Erangga. Jakarta
Pasaribu, H. E. 2011. Pengaruh Aplikasi Rhizobium terhadap Pertumbuhan dan
Produksi Tiga Varietas Kacang Tanah (Arachis hypogea L.). Universitas
Sumatera Utara. Medan.
Purwaningsih, S. 2008. Populasi Bakteri Rhizobium di Tanah pada Beberapa
Tanaman dari Pulau Buton, Kabupaten Muna, Provinsi Sulawesi Tenggara.
LIPI. Bogor.
Puspitasari, F. D., M. Shovitri dan N. D. Kuswytasari. 2012.Isolasi dan
Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik . Jurusan Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi
Sepuluh Nopember (ITS). Surabaya.
Rao, S. 1994. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan tanaman. Universitas
Indonesia.
Raihana, Yulia dan E. William. 2006. Pemberian Mulsa Terhadap Tujuh Varietas
Kacang Hijau dan Keharaan Tanah di Lahan Lebak Tengahan. Bul. Agron.
(34) (3) 148 152
Semangun, H. 1996,Pengantar ilmu penyakit tumbuhan. Gadjah Mada University
Press., Jogjakarta
Siska, A. 2011. Manfaat Kacang Hijau. LIPI. Bogor.
Sutedjo, M.M., A.G, Kartasapoetra dan RD.S, Sastroatmodjo. 1991. Mikrobiologi
Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.
Thomas, M., Mardiah., Mustafa., dan A. Santoso. 2011. Teknik Isolasi dan Kultur.
Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatera Utara. Medan.

17

Yugi, A. R., dan T. Harjoso. 2012. Karakter Hasil Biji Kacang Hijau pada Kondisi
Pemupukan P dan Intensitas Penyiangan Berbeda. Universitas Jenderal
Soedirman. Jawa Tengah.