Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif merupakan suatu proses analisis yang bertujuan untuk menentukan
jumlah atau seberapa banyak komponen suatu senyawa.
a. Spektrofotometri UV-Vis
DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin
dan pirimidin. Pita ganda pada DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang
kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada 280 nm. Sehingga kita
dapat mengetahui kemurnian DNA dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi
dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.82.0. Serta untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :
[DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran
[RNA] = 260 x 40 x faktor pengenceran
260 = Nilai absorbansi pada 260 nm
50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per mL
40 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 40 ug untai ganda RNA per mL
b. Kuantitatif PCR / Real Time PCR
Real-time PCR merupakan teknologi terkini untuk amplifikasi DNA. Pada real-time
PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara seketika sehingga tidak
memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real-time
PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang sensitif,
spesifik dan reproducibility sehingga mengurangi kesalahan pada hasil.
Proses amplifikasi menggunakan real-time PCR memiliki prinsip yang sama dengan proses
amplifikasi PCR secara konvensional. Namun pada real-time PCR terdapat tambahan
komponen PCR yaitu probe. Probe merupakan primer yang diberi label pewarna dye terdiri
dari reporter dan peredam pewarna (quencher). Fluoresensi dari reporter hanya dilepaskan
ketika dua pewarna secara fisik terpisah melalui hibridisasi atau aktivitas nuclease. Standar
posisi label dye, yaitu quencher berada pada 3' dan reporter pada 5' probe
Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur peningkatan pewarna
(dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Karena sifat
inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika,
semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang
dihasilkan. Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi
DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang
sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang
menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau
atau stabil.
Instrument real-time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal block cycler sebagai
akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisis data.
Real-time PCR juga dapat menganalisis banyak sampel dalam waktu bersamaan
menggunakan multiwell plates.
II.
Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif merupakan suatu proses dalam mengidentifikasi keberadaan suatu
senyawa kimia dalam suatu larutan atau sampel yang tidak diketahui. Analisis kualitaif
digunakan untuk menentukan macam, jenis zat atau komponen-komponen bahan yang
dianalisa. Dalam melakukan analisa kualitatif yang dipergunakan adalah sifat-sifat atau bahan,
baik sifat fisis maupun sifat kimianya
a. Ligase Chain Reaction (LCR)
Ligase chain reaction atau reaksi berantai ligase merupakan suatu metode analisis
yang didasarkan pada kemampuan DNA ligase menghubungkan secara kovalen dua
oligonukleotida berdekatan yang dihibridisasi ke cetakan (template) yang lebih panjang
yang dapat mengikat kedua oligonukleotida. Misalnya, apabila empat oligonukleotida 20mer membentuk dua pasangan komplementer yang berdekatan diinkubasi bersama ligase
stabi-suhu dan dikenai siklus suhu serupa dengan PCR, oligonukleotida tersebut akan
menyatu untuk menghasilkan dua oligonukleotida 40-mer komplementer yang lebih
panjang bergantuk pada ada tidaknya cetakan DNA yang lebih panjang dalam reaksi.
Salah satu sifat LCR yang menguntungkan adalah kemampuannya membedakan cetakan
yang berbeda hanya satu basa di tempat ligase. Dengan menempatkan enam
oligonukleotida dalam reaksi (dua oligonukleotida yang komplementer dan umum pada
salah satu sisi mutasi, ditambah dua yang cocok dengan sekuens normal dan dua yang
cocok dengan sekuens muatan pada sisi yang berlawanan dengan sisi mutasi di ujung
yang berdekatan dengan oligonukleotida yang akan diligasikan), maka dapat dilakukan
analisis genotype terhadap mutasi basa tunggal dengan melihat ada tidaknya produk yang
mencerminkan cetakan normal dan/atau muatan
b. Hibridisasi
Hibridisasi asam nukleat merupakan salah satu metode yang sekarang digunakan
secara luas dalam biologi molekular. Metode ini merupakan metode yang sangat peka
untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA. Metode hibridisasi
ini dapat diterapkan pada beberapa keperluan, mulai dari mencari informasi letak suatu
fragmen DNA dalam genom, analisis transkripsi dan regulasinya, deteksi penyakit genetic
dan sidik jari DNA.
Proses hibridisasi ini berdasarkan pada pembentukan dupleks antara dua untai asam
nukleat yang komplemen. Ada beberapa macam hibridisasi:
1. Hibridisasi Southern, lokalisasi sekuen tertentu dalam DNA genom biasanya dilakukan
dengan teknik yang ditemukan oleh Southern (1975). Dalam hal ini DNA genom
dipotong dengan enzim restriksi endonuclease, dan fragmen yang dihasilkan
dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan elektroforesis gel agarosa. DNA kemudian
didenaturasi in situ dan dipindahkan dari gel ke membran nilon atau membrane
nitroselulosa. Posisi DNA dalam gel sama dengan posisinya pada membrane. DNA
yang menempel pada filter dihibridisasi dengan pelacak DNA berlabel radioaktif, dan
Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi dan
studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk
memodifikasi pada organisme. blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk
berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan danuntuk
mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang mengalami perubahan
f.
Staining
Metode staining digunakan untuk visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel
elektroforesis.Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini,
beberapa diantaranya adalah etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, dan
Eva Green.
1. Etidium Bromida
Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk
memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan
penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel
pada rantai DNA dan bersifat fluoresens dia bawah cahaya UV. Namun etidium
bromida bersifat karsinogen, karena itu penggunaannya harus ditangani dengan baik
2. SYBR Gold
Pewarna SYBR Gold dye digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau
RNA. SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai
lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR
Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat berikatan
dengan asam nukleat. Pewarna ini dapat juga digunakan pada gel formaldehida
3. SYBR Green
Pewarna SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial
sebagai mutagen, karena itu pewarna ini harus ditangani dengan hati-hati. SYBR
Green I lebih cocok untuk digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green
II lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA
4. SYBR Safe
SYBR Safe merupakan pewarna yang dirancang agar menjadi pewarna yang lebih
aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ni tidak
bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan
limbah. Pewarna SYBR Safe dapat digunakan dengan blue-light transillluminator yang
mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang diamati dan lebih efisien
untuk proses kloning selanjutnya
5. Eva Green
Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR
(Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel
yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil di
dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan dengan
DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki tingkat toksisitas yang rendah
g. Sequencing
Metode sequencing merupakan metode penentuan urutan nukleotida suatu fragmen
DNA tertentu (gen) atau genom. Prinsip dasar dari metode DNA sequencing menggunakan
metode PCR (Polymerase Chain Reaction). DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGTnya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan
enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan
beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing. Beberapa metode
dalam sequencing :
1. Sequencing dye terminator
Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim
disebut metode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh
proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat
reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut,
masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens,
yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah
Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena
lebih sederhana dan lebih murah. Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel
secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali
pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan universal
primer.
Hasil pembacaan
h. RT-PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan
reaksi berantai dengan
memanfaatkan aktivitas enzim polymerase. Teknik ini digunakan untuk replikasi
(memperbanyak) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme sehingga
menghasilkan DNA dalam jumlah besar dengan waktu yang singkat. Jumlah sampel yang
dibutuhkan hanya sedikit.
Terdapat beberapa macam PCR, salah satunya ada yang dapat digunakan untuk analisa
kuantitatif DN yang disebut Real-Time PCR
RT PCR atau dikenal juga sebagai Q-PCR (Quantitative Real Time Polymerase Chain
Reaction) ialah teknik amplifikasi (memperbanyak) sekaligus kuantifikasi (menghitung)
jumlah target molekul DNA hasil perbanyakan tersebut. Kuantitas yang didapat berupa
jumlah DNA hasil perbanyakan dari proses PCR atau jumlah relatif setelah dinormalisasi
terhadap input DNA atau gen-gen pernormal yang ditambahkan..
Pada PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada
akhir reaksi dan
pengamatan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses
elektroforesis. Sedangkan pada Real Time PCR, pengamatan keberadaan DNA tersebut
dapat dilakukan secara bersamaan pada saat reaksi berlangsung. Keberadaan DNA hasil
amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil fluoresensi dari probe
(penanda). Pada RT PCR tidak ada tahap elektroforesis sehingga lebih aman karena tidak
lagi digunakan gel agarose dan pemakaian senyawa karsinogenik seperti Etidium Bromida
(EtBr).
Prinsip kerja RT PCR ialah menghitung DNA yang telah diamplifikasi setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesaat sesudah setiap siklus amplifikasi
selesai. Metode kuantifikasi yang umumnya digunakan ialah
1. Penggunaan zat perwarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai
ganda (dsDNA). Contohnya SyBr Green
2. Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan
berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen. Contohnya
probe FRET (hibridisasi) dan probe TaqMan. Pada pengamatan proses PCR, sinyal
fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional saat siklus PCR
telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil
amplifikasi) yang dihasilkan
Kesimpulan
Analisis pada DNA dan RNA dapat dilakukan secara kuantitatif dan kualitatif, disesuaikan
dengan kebutuhan. Analisis kuantitatif dilakukan untuk menentukan jumlah atau kadar komponen
dalam suatu zat, sedangkan analisis kualitatif dilakukan untuk menentukan keberadaan komponen
dalam suatu zat.
Analisis kuantitatif ada metode PCR-RT (Real-time PCR) merupakan teknologi terkini untuk
amplifikasi DNA dan metode spektrofotometri dengan menyerap cahaya ultraviolet karena
keberadaan basa-basa purin dan pirimidin.
Analisis Kualitatif ada metode LCR yang didasarkan pada kemampuan DNA ligase
menghubungkan secara kovalen dua oligonukleotida berdekatan yang dihibridisasi ke cetakan
(template) yang lebih panjang yang dapat mengikat kedua oligonukleotida, metode hibridisasi yang
sangat peka untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA, metode
elektroforesis dengan memanfaatkan migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa, metode
spektrofotometri IR dengan memanfaatkan absorbansi, metode blotting dengan memindahkan
bagian protein yang telah dipisahkan agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi, metode
staining dengan visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel elektroforesis, metode sequencing
dengan penentuan urutan nukleotida suatu fragmen DNA tertentu (gen) atau genom, dan metode
RT-PCR dengan memanfaatkan aktivitas enzim polymerase.
Daftar Pustaka
Anonim
2007,
Ligase
Chain
Reaction,
[online]
<http://www.ganfyd.org/index.php?title=Ligase_chain_reaction>
available
at: