Anda di halaman 1dari 9

ANALISIS ASAM NUKLEAT

HIZBA ILMI NAFAN 1506800312


ABSTRAK
Pada asam nukleat deteksi utamanya adalah DNA dan RNA. Metode analisis ini terbagi dua yaitu,
analisis kuantitatif dan analisis kualitatif. Pada analisis kuantitatif bertujuan untuk menentukan
jumlah atau kadar suatu komponen dalam suatu senyawa, sedangkan pada analisis kualitatif
bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan suatu senyawa kimia dalam suatu larutan atau
sampel yang tidak diketahui. Analisis kuantitatif terdiri dari PCR, UV-Vis, SAGE, dan Microarray.
Analisis kualitatif terdiri dari Eletroforesis, staining, sequencing, hibridisasi, spetrofotometri IR,
blotting, mikroskop electron, x-ray diffraction dan LCR.
Kata Kunci : Asam nukleat, DNA, RNA, Analisis Kuantitatif, Analisis kualitatif.
Asam nukleat adalah makromolekul biokimia yang tersusun atas rantai nukleotida yang
mengandung informasi genetik. Asam nukleat yang paling umum adalah Asam deoksiribonukleat
(DNA) and Asam ribonukleat (RNA). Asam nukleat ditemukan pada semua sel hidup serta pada
virus. Asam nukleat merupakan biopolimer, dan monomer penyusunnya adalah nukleotida. Setiap
nukleotida terdiri dari tiga komponen, yaitu sebuah basa nitrogen heterosiklik (purin atau pirimidin),
sebuah gula pentosa, dan sebuah gugus fosfat. Jenis asam nukleat dibedakan oleh jenis gula
yang terdapat pada rantai asam nukleat tersebut (misalnya, DNA atau asam deoksiribonukleat
mengandung 2-deoksiribosa). Selain itu, basa nitrogen yang ditemukan pada kedua jenis asam
nukleat tersebut memiliki perbedaan: adenina, sitosina, dan guanina dapat ditemukan pada RNA
maupun DNA, sedangkan timina dapat ditemukan hanya pada DNA dan urasil dapat ditemukan
hanya pada RNA.
Analisis asam nukleat dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu analisis kuantitatif dan analisis
kualiatif.
I.

Analisis Kuantitatif
Analisis kuantitatif merupakan suatu proses analisis yang bertujuan untuk menentukan
jumlah atau seberapa banyak komponen suatu senyawa.
a. Spektrofotometri UV-Vis
DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin
dan pirimidin. Pita ganda pada DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang
kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada 280 nm. Sehingga kita
dapat mengetahui kemurnian DNA dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi
dengan nilai absorbansi 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.82.0. Serta untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :
[DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran
[RNA] = 260 x 40 x faktor pengenceran
260 = Nilai absorbansi pada 260 nm
50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per mL
40 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 40 ug untai ganda RNA per mL
b. Kuantitatif PCR / Real Time PCR
Real-time PCR merupakan teknologi terkini untuk amplifikasi DNA. Pada real-time
PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara seketika sehingga tidak
memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real-time
PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang sensitif,
spesifik dan reproducibility sehingga mengurangi kesalahan pada hasil.
Proses amplifikasi menggunakan real-time PCR memiliki prinsip yang sama dengan proses
amplifikasi PCR secara konvensional. Namun pada real-time PCR terdapat tambahan
komponen PCR yaitu probe. Probe merupakan primer yang diberi label pewarna dye terdiri
dari reporter dan peredam pewarna (quencher). Fluoresensi dari reporter hanya dilepaskan

ketika dua pewarna secara fisik terpisah melalui hibridisasi atau aktivitas nuclease. Standar
posisi label dye, yaitu quencher berada pada 3' dan reporter pada 5' probe
Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur peningkatan pewarna
(dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Karena sifat
inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika,
semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang
dihasilkan. Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi
DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang
sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang
menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau
atau stabil.
Instrument real-time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal block cycler sebagai
akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisis data.
Real-time PCR juga dapat menganalisis banyak sampel dalam waktu bersamaan
menggunakan multiwell plates.
II.

Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif merupakan suatu proses dalam mengidentifikasi keberadaan suatu
senyawa kimia dalam suatu larutan atau sampel yang tidak diketahui. Analisis kualitaif
digunakan untuk menentukan macam, jenis zat atau komponen-komponen bahan yang
dianalisa. Dalam melakukan analisa kualitatif yang dipergunakan adalah sifat-sifat atau bahan,
baik sifat fisis maupun sifat kimianya
a. Ligase Chain Reaction (LCR)
Ligase chain reaction atau reaksi berantai ligase merupakan suatu metode analisis
yang didasarkan pada kemampuan DNA ligase menghubungkan secara kovalen dua
oligonukleotida berdekatan yang dihibridisasi ke cetakan (template) yang lebih panjang
yang dapat mengikat kedua oligonukleotida. Misalnya, apabila empat oligonukleotida 20mer membentuk dua pasangan komplementer yang berdekatan diinkubasi bersama ligase
stabi-suhu dan dikenai siklus suhu serupa dengan PCR, oligonukleotida tersebut akan
menyatu untuk menghasilkan dua oligonukleotida 40-mer komplementer yang lebih
panjang bergantuk pada ada tidaknya cetakan DNA yang lebih panjang dalam reaksi.
Salah satu sifat LCR yang menguntungkan adalah kemampuannya membedakan cetakan
yang berbeda hanya satu basa di tempat ligase. Dengan menempatkan enam
oligonukleotida dalam reaksi (dua oligonukleotida yang komplementer dan umum pada
salah satu sisi mutasi, ditambah dua yang cocok dengan sekuens normal dan dua yang
cocok dengan sekuens muatan pada sisi yang berlawanan dengan sisi mutasi di ujung
yang berdekatan dengan oligonukleotida yang akan diligasikan), maka dapat dilakukan
analisis genotype terhadap mutasi basa tunggal dengan melihat ada tidaknya produk yang
mencerminkan cetakan normal dan/atau muatan
b. Hibridisasi
Hibridisasi asam nukleat merupakan salah satu metode yang sekarang digunakan
secara luas dalam biologi molekular. Metode ini merupakan metode yang sangat peka
untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA. Metode hibridisasi
ini dapat diterapkan pada beberapa keperluan, mulai dari mencari informasi letak suatu
fragmen DNA dalam genom, analisis transkripsi dan regulasinya, deteksi penyakit genetic
dan sidik jari DNA.
Proses hibridisasi ini berdasarkan pada pembentukan dupleks antara dua untai asam
nukleat yang komplemen. Ada beberapa macam hibridisasi:
1. Hibridisasi Southern, lokalisasi sekuen tertentu dalam DNA genom biasanya dilakukan
dengan teknik yang ditemukan oleh Southern (1975). Dalam hal ini DNA genom
dipotong dengan enzim restriksi endonuclease, dan fragmen yang dihasilkan
dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan elektroforesis gel agarosa. DNA kemudian
didenaturasi in situ dan dipindahkan dari gel ke membran nilon atau membrane
nitroselulosa. Posisi DNA dalam gel sama dengan posisinya pada membrane. DNA
yang menempel pada filter dihibridisasi dengan pelacak DNA berlabel radioaktif, dan

autoradiografi digunakan untuk menentukan letak pita yang komplemen dengan


pelacak.
2. Hibridisasi Nothern, merupakan modifikasi dari metode Southern dengan target RNA
yang telah dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa dengan menggunakan
pelacak DNA berlabel
3. Hibridisasi dot, targer asam nukleat (DNA atau RNA) dititilkan pada membrane dan
keberadaan target dilacak dengan pelacak DNA atau RNA berlabel
4. Hibridisasi in situ, merupakan hibridisasi antara pelacak DNA atau RNA dengan target
DNA atau RNA pada preparat sitologis.
Prinsip kerja sistem ini adalah terjadinya pasangan secara tepat antara dua untai
DNA yang komplemen. Cara hibridisasi asam nukleat dapat dilakukan sebagai berikut:
1. Pengikatan DNA untai tunggal (target) pada membrane.
2. Penambahan DNA pelacak untai tunggal yang telah berlabel pada kondisi tertentu
(suhu dan konsentrasi ion) supaya terjadi pasangan antara DNA targer dan pelacak.
3. Pencucian untuk menghilangkan kelebihan pelacak yang tidak menempel pada DNA
target yang spesifik.
Deteksi adanya hybrid antara DNA target dan pelacak
c. Elektroforesis
Metoda standar yang digunakan untuk identifikasi, separasi dan purifikasi fragmen
DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarosa. Migrasi elektroforesis DNA melalui
gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi molekul DNA, konsentrasi
agarosa, arus listrik dan temperatur. Pewarna Ethidium Bromide (EtBr) digunakan untuk
alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel.
EtBr ini akan terikat diantara dua untai ganda DNA, sehingga band/pita DNA dalam gel
agarosa akan berpendar, karena pewarna ini mengandung zat fluoresence. EtBr dapat
diberikan pada setiap sampel yang akan dimasukkan ke sumuran gel atau dicampurkan ke
gel agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel. Intensitas fluoresence dapat diukur
dengan menggunakan DNA marker standar, sehingga dapat diperkirakan kuantitas
DNAnya, misal antara 0.50 sampai 20 ug/mL.
Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan makromolekul berdasarkan laju
perpindahannya melewati suatu gel dibawah pengaruh medan listrik. Campuran asam
nukleat atau protein ditempatkan di dalam sumur di dekat satu ujung lempeng tipis gel
polimerik. Gel ini ditahan oleh pelat kaca dan direndam dalam larutan aqueous (dengan
pelarut air). Elektroe dilekatkan pada kedua ujung dan diberi tegangan. Setiap
makromolekul kemudian bermigrasi ke arah electrode yang bermuatan berlawanan pada
laju yang sebagian besar ditentukan oleh muatan dan ukuran molekulnya. Biasanya
beberapa sampel yang berbeda, masing-masing merupakan campuran molekul,
dimasukkan secara bersamaan ke dalam lajur majemuk pada gel lempeng.
Untuk asam nukleat, laju migrasi-berapa jauh yang ditempuh molekul itu ketika
diberi arus-berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya. Asam nukleat membawa
muatan negative (pada gugus fosfat) yang proporsional dengan panjangnya, tetapi belukar
serat polimer di dalam gel lebih menghambat fragmen yang lebih panjang daripada yang
lebih pendek.
Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor di antaranya:
1. Ukuran molekul DNA
Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran
kecil.
2. Konsentrasi agarosa
Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih cepat daripada migrasi
molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Oleh karena itu, penentuan
konsentrasi agarosa dalam membuat gel harus memperhatikan ukuran molekul DNA
yang akan dianalisis.
3. Konformasi DNA
Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan bermigrasi
dengan kecepatan yang berbeda.

4. Voltase yang digunakan


Dalam voltase, kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang
digunakan. Akan tetapi apabila penggunaan voltase dinaikkan, mobilitas molekul DNA
meningkat secara tajam. Ini mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam gel
menurun dengan meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang
ideal untuk mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah
tidak lebih dari 5 Volt per cm.
5. Keberadaan etidium bromida di dalam gel
Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear
sebesar 15%.
d. Spektrofotometri IR
Berkas-berkas absorbansi dari molekul-molekul asam nukleat digunakan sebagai
penanda. Spektrum asam-asam nukleat (DNA dan RNA) dibentuk oleh unsur-unsur
konstruktif: N-basa, karbohidrat (desoksiribosa/ribosa), gugus fosfat. Basa (Adenin,
Guanin, Timin, Urasil, Sitosin) memiliki berkas karakteristik dalam kisaran 1800-1500 cm-1
dan berkas-berkas ini merupakan penanda sensitif untuk penggabungan basa dan
penataan basa. Berkas-berkas pada 1500-1250 cm-1 ditranskripsi untuk kombinasi vibrasi
antara basa dan karbohidrat yang relevan, dimana pada 1250-1000 cm-1 terkait dengan
vibrasi karbohidrat-posfat. Berkas-berkas ini menjamin informasi untuk konformasi asam
nukleat. Pada kisaran 1000-800 cm-1 diamati vibrasi karbohidrat/karbohidrat-fosfat.
e. Blotting
Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA
atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut
mengalami imobilisasi.RNA Blotting dan DNA Blotting umumnya disebut dengan istilah
Northern Blotting dan Southern Blotting.
1. Northern Blotting
Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA sequence)
tertentu diantara kumpulan molekul RNA. Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi
dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Dalam proses ini RNA dipisahkan
berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa
dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui
berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam
penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas bandband ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur
ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen
yang terjadi dengan mengukur berapa banyak RNA hadir dalam sampel yang berbeda.
Langkah pertama dari metode ini adalah denaturasi atau pemisahan RNA di dalam
sampel menjadi rantai tunggal. Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak dalam
posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul. Selanjutnya molekul
RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode gel elektroforesis. Setelah
pemisahan, RNA ditransfer dari gel ke blot membran. Setelah itu membran dilalui
proses probe, DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan harus
memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. Dengan begitu, probe dapat
terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran. Setelah hibridisasi, probe
mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul RNA
2. Southern Blotting
Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam
sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan
dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui
aksi kapiler. Membran tersebut kemudian dikenakan probe DNA berlabel yang memiliki
urutan basa pelengkap untuk urutan DNA sampel.
Metode ini digunakan untuk memindahkan protein DNA ke suatu pengangkut
sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel elektroforesis.
Southern blot berkombinasi dengan elektroforesis gel agarosa untuk separasi ukuran
DNA.

Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi dan
studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk
memodifikasi pada organisme. blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk
berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan danuntuk
mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang mengalami perubahan
f.

Staining
Metode staining digunakan untuk visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel
elektroforesis.Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini,
beberapa diantaranya adalah etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, dan
Eva Green.
1. Etidium Bromida
Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk
memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan
penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel
pada rantai DNA dan bersifat fluoresens dia bawah cahaya UV. Namun etidium
bromida bersifat karsinogen, karena itu penggunaannya harus ditangani dengan baik
2. SYBR Gold
Pewarna SYBR Gold dye digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau
RNA. SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai
lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR
Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat berikatan
dengan asam nukleat. Pewarna ini dapat juga digunakan pada gel formaldehida
3. SYBR Green
Pewarna SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial
sebagai mutagen, karena itu pewarna ini harus ditangani dengan hati-hati. SYBR
Green I lebih cocok untuk digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green
II lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA
4. SYBR Safe
SYBR Safe merupakan pewarna yang dirancang agar menjadi pewarna yang lebih
aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ni tidak
bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan
limbah. Pewarna SYBR Safe dapat digunakan dengan blue-light transillluminator yang
mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang diamati dan lebih efisien
untuk proses kloning selanjutnya
5. Eva Green
Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR
(Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel
yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil di
dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan dengan
DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki tingkat toksisitas yang rendah

g. Sequencing
Metode sequencing merupakan metode penentuan urutan nukleotida suatu fragmen
DNA tertentu (gen) atau genom. Prinsip dasar dari metode DNA sequencing menggunakan
metode PCR (Polymerase Chain Reaction). DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGTnya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan
enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan
beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing. Beberapa metode
dalam sequencing :
1. Sequencing dye terminator
Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim
disebut metode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh
proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat
reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut,
masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens,
yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah

dan lebih cepat dibandingkan penggunaan primer berwarna, namun dapat


menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan oleh
ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada
pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah
tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim
dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan.

Prinsip Sanger Method dengan dye dideoxy terminator (Sumber: appliedbiosystems.com)

Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena
lebih sederhana dan lebih murah. Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel
secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali
pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan universal
primer.
Hasil pembacaan

h. RT-PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan
reaksi berantai dengan
memanfaatkan aktivitas enzim polymerase. Teknik ini digunakan untuk replikasi
(memperbanyak) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme sehingga
menghasilkan DNA dalam jumlah besar dengan waktu yang singkat. Jumlah sampel yang
dibutuhkan hanya sedikit.

Gambar 1. Proses Polymerase Chain Reaction

Terdapat tiga tahap PCR, yakni


1. Denaturasi
Pada proses ini double stranded DNA akan berubah menjadi single starnded.
Double stranded DNA diberikan suhu yang tinggi sekitar 90 95oC yang menyebabkan
putusnya ikatan hidrogen diantara basa nitrogen yang komplemen. Tahap ini
berlangsung 1 hingga 2 menit
2. Annealing (penempelan primer)
Primer merupakan DNA berukuran pendek yang mempunyai panjang sekitar 10
sampai 30 pasang basa. Pada annealing primer akan menempel pada untai DNA target
yang telah dipisahkan sebelumnya pada proses denaturasi. Primer akan menuju
daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Diperlukan waktu 1-2
menit unutk proses ini dengan suhu sebesar 50 60oC.
3. Extension (pemanjangan)
Setelah primer menempel pada DNA target, enzim DNA polymerase akan
memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antar primer,
DNA cetakan, dan nukleotida. Dilakukan pada suhu 72 oC selama 1 menit.
Setelah proses polimerisasi, proses diulang kembali ke denaturasi, annealing, dan
pemanjangan DNA membentuk DNA yang baru. Pengulangan ini akan menghasilkan DNA
cetakan baru secara eksponensial.
Setelah pengulangan 20 50 kali akan diperoleh jumlah fragmen DNA yang cukup banyak
sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis. Selanjutnya pita-pita DNA dai hasil
elektroforesis dibandingkan dengan marker DNA.

Gambar 2. Hasil PCR

Terdapat beberapa macam PCR, salah satunya ada yang dapat digunakan untuk analisa
kuantitatif DN yang disebut Real-Time PCR
RT PCR atau dikenal juga sebagai Q-PCR (Quantitative Real Time Polymerase Chain
Reaction) ialah teknik amplifikasi (memperbanyak) sekaligus kuantifikasi (menghitung)
jumlah target molekul DNA hasil perbanyakan tersebut. Kuantitas yang didapat berupa
jumlah DNA hasil perbanyakan dari proses PCR atau jumlah relatif setelah dinormalisasi
terhadap input DNA atau gen-gen pernormal yang ditambahkan..
Pada PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada
akhir reaksi dan
pengamatan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses
elektroforesis. Sedangkan pada Real Time PCR, pengamatan keberadaan DNA tersebut
dapat dilakukan secara bersamaan pada saat reaksi berlangsung. Keberadaan DNA hasil
amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil fluoresensi dari probe
(penanda). Pada RT PCR tidak ada tahap elektroforesis sehingga lebih aman karena tidak
lagi digunakan gel agarose dan pemakaian senyawa karsinogenik seperti Etidium Bromida
(EtBr).
Prinsip kerja RT PCR ialah menghitung DNA yang telah diamplifikasi setelah
diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesaat sesudah setiap siklus amplifikasi
selesai. Metode kuantifikasi yang umumnya digunakan ialah
1. Penggunaan zat perwarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai
ganda (dsDNA). Contohnya SyBr Green
2. Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan
berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen. Contohnya
probe FRET (hibridisasi) dan probe TaqMan. Pada pengamatan proses PCR, sinyal
fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional saat siklus PCR
telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil
amplifikasi) yang dihasilkan

Kesimpulan
Analisis pada DNA dan RNA dapat dilakukan secara kuantitatif dan kualitatif, disesuaikan
dengan kebutuhan. Analisis kuantitatif dilakukan untuk menentukan jumlah atau kadar komponen
dalam suatu zat, sedangkan analisis kualitatif dilakukan untuk menentukan keberadaan komponen
dalam suatu zat.
Analisis kuantitatif ada metode PCR-RT (Real-time PCR) merupakan teknologi terkini untuk
amplifikasi DNA dan metode spektrofotometri dengan menyerap cahaya ultraviolet karena
keberadaan basa-basa purin dan pirimidin.
Analisis Kualitatif ada metode LCR yang didasarkan pada kemampuan DNA ligase
menghubungkan secara kovalen dua oligonukleotida berdekatan yang dihibridisasi ke cetakan
(template) yang lebih panjang yang dapat mengikat kedua oligonukleotida, metode hibridisasi yang
sangat peka untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA, metode
elektroforesis dengan memanfaatkan migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa, metode
spektrofotometri IR dengan memanfaatkan absorbansi, metode blotting dengan memindahkan
bagian protein yang telah dipisahkan agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi, metode
staining dengan visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel elektroforesis, metode sequencing
dengan penentuan urutan nukleotida suatu fragmen DNA tertentu (gen) atau genom, dan metode
RT-PCR dengan memanfaatkan aktivitas enzim polymerase.

Daftar Pustaka
Anonim
2007,
Ligase
Chain
Reaction,
[online]
<http://www.ganfyd.org/index.php?title=Ligase_chain_reaction>

available

at:

Anonim, Detection and Indentification. [online] available at:


http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciencesus/applications/AlternativeProductStructure_11756/
Anonim. Northern Blotting. [online] available at: <http://www.protocolonline.org/prot/Molecular_Biology/RNA/Northern_Blotting/>
Campbell, N. (2002). Biologi. Penerjemah Rahayu L. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology