Southern blot

Disusun oleh :
JUNEDI RAGANSAN PURBA
140410070074

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MIPA UNPAD
 Southern blot
Southern Blot merupakan proses perpindahan
fragmen DNA yang terpisah
secara elektroforesis dari gel ke membran.
Metode ini diambil dari nama penemunya
yaitu Edward M. Souther. Prinsipnya
adalah kapilaritas, dimana bufer yang
merupakan fase gerak diasumsikan akan
membawa fragmen DNA dari gel ke membran.
Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran
positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada
membran.

Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah

membran nitroselulosa.

Blot Southern merupakan sebuah metode yang sering

digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk menguji
keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA
.
Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk
memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan kemudian ditransfer
ke membran filter untuk selanjutnya dilakukanhibridisasi
dengan probe.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam
sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan. 

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik

yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan
negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui
suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub
yang
. berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif. 
 Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah
muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada
bentuk molekulnya. 

Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz,

yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang
diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk

memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen
DNA. 
.
 Pita DNA Setelah Elektroforesis
dan Diamati di Bawah Sinar UV Perangkat elektroforesis
gel

.
Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu
fragmen DNA spesifik, diperlukan suatu pelacak
(probe).

DNA dipisahkan terlebih dahulu dengan

elektroforesis. Probe yang dilabel akan hibridisasi
pada pita-pita DNA untuk mengetahui apakah DNA
tersebut mengandung gen yang diinginkan.

Blot Southern mendeteksi DNA rantai tunggal

.
dengan menggunakan DNA sebagai pelacak.
 TAHAP AWAL METODA SOUTHERN
BLOT

pendigestian DNA
dengan enzim restriksi Kemudian DNA dipisahkan
endonuklease sehingga sesuai ukuran
terbentuk fragmen-fragmen dengan elektroforesis agarosa.
DNA yang lebih kecil

Setelah DNA terpisah,

Membran nitroselulosa
dilakukan pemindahan DNA
diletakkan pada bagian atas
ke membran nitroselulosa,
. dari gel agarosa
tahap ini disebut dengan tahap
blotting
 TEKNIK BLOTTING DENGAN VAKUM

membran
membran diletakkan
diletakkan pada
pada bagian
bagian bawah
bawah
gel. Proses
Proses transfer
transfer berlangsung
berlangsung dengan
dengan
gel. Tekanan diberikan secara merata pada
Tekanan diberikan secara merata pada
gel memanfaatkan
memanfaatkan daya kapilaritas setalah
daya kapilaritas setalah DNA
DNA
gel untuk
untuk memastikan
memastikan terjadi kontak antara
terjadi kontak antara
gel ditransfer ke gel
ditransfer ke gel
gel dengan
dengan membran
membran

membran
membran dicampur
dicampur dengan
dengan probe
probe membran
membran nitroselulosa
nitroselulosa dipanaskan
dipanaskan dengan
dengan
(pelacak) yang telah dilabel radioaktif
(pelacak) yang telah dilabel radioaktif suhu
suhu tinggi (60 C-100oC)
tinggi (60 oo
C-100 o
C) kemudian
kemudian
tetapi
tetapi dapat
dapat juga
juga digunakan
digunakan label
label membran
membran diberi
diberi radiasi
radiasi UV
UV agar
agar terbentuk
terbentuk
nonradioaktif yang dapat berpendar
nonradioaktif yang dapat berpendar ikatan kovalen
ikatan kovalen dan
dan permanen
permanen antara
antara pita-
pita-
pita DNA dengan membran
pita DNA dengan membran

. Probe
Probe yang
yang digunakan
digunakan adalah
adalah DNA
DNA utas
utas Setelah
Setelah proses
proses hibridisasi,
hibridisasi, probe
probe yang
yang
tunggal yang memiliki sekuen yang akan
tunggal yang memiliki sekuen yang akan tidak terikat dicuci dari membran
tidak terikat dicuci dari membran
dideteksi.
dideteksi. Probe
Probe diinkubasi
diinkubasi dengan
dengan sehingga
sehingga yang
yang tinggal
tinggal hanya
hanya probe
probe yang
yang
membran
membran agar dapat berhibridisasi dengan
agar dapat berhibridisasi dengan hibrid
hibrid dengan DNA di membran. Pola
dengan DNA di membran. Pola
DNA yang ada pada membran.
DNA yang ada pada membran. hibridisasi
hibridisasi kemudian
kemudian dideteksi
dideteksi
dengan visualisasi
dengan visualisasi pada
pada film X-ray
film X-ray
melalui autoradiografi.
melalui autoradiografi.