Machine Translated by Google

Blot Selatan dan Artikel sekunder

Deteksi DNA Terkait . Perkenalan

Isi Artikel

Teknik . Prinsip Southern Blot

. Persiapan DNA Sebelum Southern Blotting
Terence A Brown, Institut Sains dan Teknologi Universitas Manchester, Manchester, Inggris . Teknik Pemblokiran DNA
. Hibridisasi DNA/DNA

Southern blotting adalah teknik transfer molekul DNA dari gel elektroforesis ke . Jenis Probe Hibridisasi

membran nitroselulosa atau nilon, dan dilakukan sebelum deteksi molekul . Aplikasi dan Keterbatasan Southern Blotting

tertentu melalui pemeriksaan hibridisasi. . Ringkasan

Perkenalan
Southern blotting adalah salah satu teknik sentral dalam biologi Prinsip Southern Blot
molekuler. Pertama kali dirancang oleh EM Southern (1975), Southern
Kemampuan bubuk atau lembaran nitroselulosa untuk mengikat DNA
blotting menghasilkan transfer molekul DNA, biasanya fragmen restriksi,
telah dikenal selama bertahun-tahun dan digunakan pada tahun 1950an
dari gel elektroforesis ke lembaran nitroselulosa atau nilon (disebut
dan 1960an dalam berbagai jenis studi hibridisasi asam nukleat. Dalam
sebagai 'membran'), sedemikian rupa sehingga pita DNA pola yang ada
teknik awal ini, DNA yang diimobilisasi tidak terfraksi, hanya terdiri dari
dalam gel direproduksi pada membran. Selama transfer atau sebagai
DNA total yang terikat pada bubuk nitroselulosa atau ditempelkan pada
hasil pengolahan selanjutnya, DNA menjadi tidak bergerak pada
lembaran nitroselulosa. Pengenalan metode elektroforesis gel pada awal
membran dan dapat digunakan sebagai substrat untuk analisis hibridisasi
dengan probe DNA atau RNA berlabel yang secara khusus menargetkan tahun 1970-an yang memungkinkan pemisahan fragmen restriksi DNA
berdasarkan ukurannya mendorong pengembangan teknik untuk
fragmen restriksi individu dalam DNA yang dihilangkan. Intinya, Southern
mentransfer fragmen terpisah secara massal dari gel ke pendukung
blotting adalah sebuah metode untuk 'mendeteksi suatu fragmen
nitroselulosa. Prosedur yang dijelaskan oleh Southern (1975), melibatkan
restriksi tertentu dengan latar belakang banyak fragmen restriksi lainnya'
transfer DNA kapiler dari gel ke lembaran nitroselulosa yang ditempatkan
(Brown, 1999). DNA yang dibatasi mungkin merupakan klon plasmid
di atasnya, sederhana dan efektif, dan meskipun telah dikembangkan
atau bakteriofag, Southern blotting digunakan untuk mengkonfirmasi
selama bertahun-tahun, prosedur asli ini hanya sedikit berbeda dari
identitas fragmen yang dikloning atau untuk mengidentifikasi subfragmen
metode rutin yang masih digunakan. di banyak laboratorium biologi
yang menarik dari dalam DNA yang dikloning, atau mungkin DNA genom,
molekuler.
dalam hal ini Southern blotting adalah pendahuluan. hingga teknik
seperti analisis polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP).

Metodologi asli untuk Southern blotting

Dalam artikel ini dijelaskan prinsip-prinsip umum Southern blotting,
diikuti dengan ikhtisar metodologi yang digunakan untuk persiapan DNA
Metodologi asli untuk Southern blotting diilustrasikan pada Gambar 1.
sebelum blotting, untuk blotting itu sendiri, dan untuk analisis hibridisasi.
Gel elektroforesis agarosa, yang mengandung fragmen restriksi yang
Artikel ini diakhiri dengan survei terhadap aplikasi dan keterbatasan
difraksinasi, ditempatkan pada sumbu kertas saring yang membentuk
Southern blotting.
sambungan antara gel dan reservoir buffer garam tinggi. Nitroselulosa

Terbatas
DNA
Penanda DNA
Kertas tisu

123 Membran nilon

Penyangga

Gel
Sumbu

Gel agarosa
Membran nilon
Mendukung

Gambar 1 Southern blotting. Direproduksi dari Brown (1999) dengan izin dari BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford.

ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net 1

Machine Translated by Google
Teknik Southern Blotting dan Deteksi DNA Terkait
Membran ditempatkan di atas gel dan ditutup dengan handuk kertas
yang ditahan dengan beban.
Aksi kapiler menyebabkan buffer meresap melalui sumbu kertas saring,
gel dan membran dan ke dalam tisu. Saat buffer melewati gel, fragmen
DNA dibawa ke dalam membran, di mana mereka terikat pada
nitroselulosa. Pemindahan fragmen yang efektif hingga panjang 15 kb
memerlukan waktu sekitar 18 jam, kira-kira setara dengan 'semalaman'.
Satu-satunya komplikasi teknis adalah kemungkinan bahwa buffer
melewati gel dengan merendam langsung dari sumbu ke tisu, yang tidak
mungkin terjadi jika pengaturannya dilakukan dengan hati-hati.
Modifikasi terbaru pada Southern blotting
Sistem yang ditunjukkan pada Gambar 1 adalah deskripsi akurat
Southern blotting yang masih dilakukan di banyak laboratorium, namun
berbagai modifikasi telah diperkenalkan selama bertahun-tahun untuk
meningkatkan efisiensi transfer DNA dari gel ke membran. Kemajuan
besar adalah pengenalan membran nilon, yang memiliki tiga keunggulan
dibandingkan membran nitroselulosa. Pertama, membran nilon kurang
rapuh dibandingkan lembaran nitroselulosa, yang terakhir cenderung
retak jika ditangani secara kasar selama Southern blotting, dan biasanya
hancur jika dilakukan upaya untuk melakukan lebih dari dua atau tiga
analisis hibridisasi dengan noda yang sama. Membran nilon tidak dapat
rusak jika ditangani dan satu noda dapat dihibridisasi ulang hingga
sepuluh kali, batasan ini bukan disebabkan oleh kerusakan membran,
tetapi karena hilangnya DNA yang terhapus secara bertahap selama
hibridisasi berulang. Keuntungan kedua dari membran nilon adalah
bahwa dalam kondisi tertentu (membran bermuatan positif dan buffer
transfer basa) DNA yang ditransfer menjadi terikat secara kovalen ke
membran selama proses transfer. Hal ini tidak terjadi pada membran
nitroselulosa, yang awalnya mengikat DNA secara semipermanen,
imobilisasi hanya terjadi jika membran dipanggang pada suhu 808C.
Oleh karena itu, transfer ke membran nilon yang bermuatan positif dapat
mengurangi kemungkinan hilangnya DNA yang mungkin terjadi karena
pencucian melalui membran selama proses blotting; ini juga lebih cepat,
waktu transfer dikurangi dari 18 jam menjadi 2 jam. Terakhir, membran
nilon secara efisien mengikat fragmen DNA hingga panjang 50 bp,
sedangkan membran nitroselulosa hanya efektif dengan molekul yang
panjangnya lebih dari 500 bp. Namun, nitroselulosa belum sepenuhnya
tergantikan karena ia mempunyai satu keuntungan yang signifikan
dibandingkan dengan membran nilon: berkurangnya jumlah hibridisasi
latar belakang, terutama dengan probe yang telah diberi label dengan
penanda nonradioaktif.
Perubahan lain pada prosedur Southern blotting telah diperkenalkan
untuk mempercepat dan meningkatkan efisiensi transfer. Perubahan
pada arsitektur
2 ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net
sistem kapiler blotting telah diusulkan namun pengaturan alternatif ini
lebih rumit untuk dilakukan dibandingkan dengan transfer ke atas
sederhana yang ditunjukkan pada Gambar 1, dan tidak ada yang
memberikan peningkatan besar dalam kecepatan atau efisiensi. Namun
perbaikan dapat dicapai dengan penggunaan metode transfer nonkapiler,
seperti electroblotting, yang menggunakan elektroforesis untuk
memindahkan DNA dari gel ke membran. Teknik ini awalnya
dikembangkan untuk blotting gel poliakrilamida, yang ukuran porinya
terlalu kecil untuk transfer DNA kapiler yang efektif, dan juga telah
diterapkan pada gel agarosa (Bittner et al., 1980). Electroblotting lebih
cepat daripada transfer kapiler tetapi harus dilakukan dengan hati-hati
karena masalah dapat timbul dengan pembentukan gelembung jika gel
menjadi terlalu panas selama transfer. Vacuum blotting adalah pilihan
yang lebih populer untuk gel agarosa, tekanan vakum digunakan untuk
menarik buffer melalui gel dan membran lebih cepat daripada yang
terjadi dengan aksi kapiler sederhana, memungkinkan waktu transfer
dikurangi hingga 30 menit. Upaya juga telah dilakukan untuk
menghilangkan Southern blotting sepenuhnya dan melakukan analisis
hibridisasi secara langsung dengan gel elektroforesis, imobilisasi DNA
dicapai dengan mengeringkan gel sehingga DNA terperangkap dalam
matriks gel yang mengalami dehidrasi atau terikat pada padatan.
dukungan di mana gel ditempatkan sebelum dikeringkan. Teknik-teknik
ini telah terbukti berguna untuk beberapa aplikasi tetapi mendapatkan
sinyal latar belakang yang tinggi setelah analisis hibridisasi.
Persiapan DNA Sebelum ke Selatan
noda
Persiapan DNA genom
Teknik yang digunakan untuk mempersiapkan DNA untuk Southern
blotting bergantung pada jenis DNA yang sedang dipelajari. Untuk DNA
genom, tujuannya adalah untuk mendapatkan molekul yang belum
terfragmentasi secara luas melalui pemotongan acak selama proses
ekstraksi, sehingga dapat diperoleh fragmen restriksi spesifik berukuran
20 kb atau lebih.
Oleh karena itu, sel harus dipecah dalam kondisi yang relatif lembut.
Untuk kultur jaringan sel dan sampel darah, inkubasi dalam buffer yang
mengandung deterjen seperti natrium dodesil sulfat (SDS) biasanya
cukup untuk mengganggu membran sel dan melepaskan DNA dengan
berat molekul tinggi. Bakteri, yang dikelilingi oleh dinding sel, dapat
dipecah secara perlahan melalui pengobatan dengan kombinasi lisozim
dan etilendiamintetraasetat (EDTA). Lisozim adalah enzim yang
mendegradasi beberapa senyawa polimer yang ada di dinding sel
bakteri, dan EDTA mengkelat ion magnesium yang diperlukan untuk
integritas struktur polimer. Penambahan deterjen selanjutnya
menyebabkan sel-sel pecah. Mikroorganisme lain dengan dinding sel
yang keras, seperti ragi dan jamur, juga bisa mengalami hal ini
Machine Translated by Google
diperlakukan dengan enzim-enzim penghancur dinding sel yang sesuai,
dan hal yang sama juga berlaku pada sel-sel tumbuhan meskipun sel-
sel tumbuhan biasanya dipecah dengan penggilingan fisik jaringan-
jaringan yang telah dibekukan dalam nitrogen cair. Hal ini menyebabkan
beberapa fragmentasi DNA tetapi memberikan hasil yang jauh lebih
tinggi.
Setelah gangguan sel, prosedur ekstraksi DNA genom dilanjutkan
dengan langkah-langkah yang bertujuan menghilangkan biokimia utama
selain DNA yang ada dalam ekstrak awal.
Protease seperti proteinase K mungkin dimasukkan dalam buffer yang
digunakan untuk gangguan sel, untuk memulai degradasi protein dalam
ekstrak, tetapi deproteinisasi secara rutin dilakukan dengan ekstraksi
fenol, penambahan fenol atau campuran 1:1. fenol dan kloroform
menghasilkan pengendapan protein. Setelah sentrifugasi, protein yang
diendapkan bermigrasi ke antarmuka antara fase organik dan air,
sedangkan asam nukleat tetap berada dalam fase air. Untuk ekstrak
tumbuhan, yang mengandung jumlah karbohidrat lebih besar
dibandingkan yang ditemukan pada sebagian besar sel hewan dan
mikroba, pemurnian tambahan yang melibatkan deterjen
cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) sering digunakan. Senyawa
ini secara spesifik mengikat asam nukleat, meningkatkan perolehannya
selama ekstraksi fenol. Sebagian besar prosedur ekstraksi juga
mencakup pencernaan RNA dengan ribonuklease dan pengolahan akhir
dengan etanol, yang mengendapkan polimer asam nukleat yang tersisa,
memungkinkan ribonukleotida dan kontaminan dengan berat molekul
rendah lainnya dihilangkan. DNA yang diendapkan dikeringkan dan
kemudian dilarutkan kembali dalam air atau buffer Tris-EDTA.
Persiapan DNA plasmid atau bakteriofag
Teknik khusus harus digunakan jika tujuannya adalah untuk mendapatkan
DNA plasmid atau bakteriofag dari klon bakteri.
DNA plasmid dapat diperoleh dengan salah satu dari beberapa teknik
yang mengeksploitasi perbedaan fisik antara plasmid dan DNA genom
bakteri, plasmid merupakan molekul superkoil kecil sedangkan DNA
genom, setelah gangguan sel, hadir dalam bentuk fragmen linier yang
panjang. Metode yang populer melibatkan perlakuan ekstrak sel dengan
alkali, yang mengendapkan DNA linier tetapi meninggalkan plasmid
superkoil dalam larutan. DNA bakteriofag, misalnya vektor rekombinan l
atau M13, biasanya diperoleh langsung dari partikel bakteriofag yang
disekresikan oleh bakteri yang terinfeksi, proses pemurniannya
disederhanakan karena partikel-partikel ini hanya terdiri dari DNA dan
protein.
Teknik Pemblokiran DNA
Setelah DNA yang dimurnikan diolah dengan satu atau lebih
endonuklease restriksi, DNA tersebut difraksinasi dengan elektroforesis
gel agarosa dan gel kemudian diberi perlakuan awal sebelum pengaturan.
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net
Teknik Southern Blotting dan Deteksi DNA Terkait
sampai noda Selatan. Perlakuan awal mempunyai dua tujuan.
Pertama, diinginkan untuk memecah molekul DNA dalam pita individu di
dalam gel menjadi fragmen yang lebih kecil, karena fragmen yang lebih
kecil berpindah lebih cepat daripada fragmen yang lebih besar. Hal ini
dicapai dengan merendam gel dalam 0,25 mol L 2 1 HCl selama 30
menit, yang menghasilkan sejumlah kecil depurinasi – pemutusan ikatan
bN-glikosidik antara basa purin (adenin atau guanin) dan komponen gula
dari nukleotidanya – yang diikuti dengan penguraian struktur gula dan
pemutusan rantai polinukleotida. Perlakuan awal yang kedua adalah
dengan larutan basa yang mendenaturasi molekul DNA beruntai ganda
dengan memutus ikatan hidrogennya, sehingga molekul menjadi beruntai
tunggal. Hal ini membantu transfernya dan pengikatan selanjutnya ke
membran, dan juga memastikan bahwa setelah pengikatan, komponen
pasangan basa polinukleotida tersedia untuk hibridisasi dengan probe.
Jika membran nitroselulosa digunakan maka perlakuan awal alkali
diikuti dengan netralisasi gel dengan merendam dalam buffer garam
Tris, langkah ini penting karena DNA tidak berikatan dengan nitroselulosa
pada pH lebih besar dari 9,0. Southern blot kemudian dibuat, seperti
diilustrasikan pada Gambar 1, dengan buffer transfer garam tinggi,
biasanya formulasinya disebut '20 SSC', yang terdiri dari 3,0 mol L 2 1
NaCl (garam) dan 0,3 mol L 2 1 natrium sitrat . Buffer yang sama dapat
digunakan untuk transfer ke membran nilon, tetapi dengan membran
nilon yang bermuatan positif, buffer transfer basa (0,4 mol L 2 1 NaOH)
digunakan karena, seperti dijelaskan sebelumnya, hal ini menghasilkan
perlekatan kovalen langsung pada DNA yang ditransfer. ke membran.
Dengan jenis transfer ini, perlakuan awal dengan alkali tidak diperlukan.
Noda tersebut kemudian dibiarkan setidaknya selama 18 jam untuk
transfer garam tinggi, atau 2 jam untuk noda basa.
Setelah blotting, pengaturan transfer dibongkar dan membran dibilas
dalam 2 SSC dan dibiarkan kering. Jika noda telah dibuat pada membran
nitroselulosa atau nilon yang tidak bermuatan, maka DNA hanya terikat
secara longgar pada membran pada tahap ini. Oleh karena itu, imobilisasi
yang lebih permanen harus dilakukan, baik dengan memanggang pada
suhu 808C selama 2 jam, yang menghasilkan perlekatan DNA nonkovalen
namun semipermanen pada membran nitroselulosa, atau penyinaran
UV, yang menghasilkan perlekatan kovalen DNA pada membran nilon.
Hibridisasi DNA/DNA
Analisis hibridisasi didasarkan pada prinsip bahwa dua polinukleotida
akan membentuk hibrid yang stabil melalui pasangan basa jika rangkaian
nukleotidanya saling melengkapi atau sebagian. Oleh karena itu, suatu
fragmen restriksi spesifik pada Southern blot dapat dideteksi jika
membran diperiksa dengan molekul DNA kedua yang diberi label dan
memiliki urutan yang sama atau mirip dengan fragmen yang dicari. Kami
akan
3
Machine Translated by Google
Teknik Southern Blotting dan Deteksi DNA Terkait
memeriksa jenis probe hibridisasi yang dapat digunakan nanti;
pertama-tama kita akan mensurvei metodologi yang digunakan
untuk analisis hibridisasi.
Prahibridisasi Southern blot
Analisis hibridisasi dilakukan dengan merendam Southern blot
dalam buffer yang berisi probe hibridisasi, biasanya dalam
tabung yang diputar terus-menerus sehingga seluruh bagian
membran terkena probe, atau sebagai alternatif dalam kantong
plastik tertutup yang ditempatkan pada a pengocok. Hibridisasi
dilakukan dalam dua tahap. Pertama, membran diprahibridisasi
dalam larutan yang dirancang untuk memblokir situs pengikatan
DNA yang tidak terpakai pada permukaan membran. Jika
langkah ini dihilangkan maka probe akan berikatan secara
nonspesifik pada permukaan membran dan sinyal yang
dihasilkan dari hibridisasi ke fragmen restriksi spesifik akan
sulit bahkan tidak mungkin untuk diidentifikasi. Oleh karena
itu, larutan prahibridisasi mengandung senyawa polimer
nonbiologis seperti polivinilpirolidon dan/atau polimer biologis
seperti Ficoll (senyawa berbasis karbohidrat), albumin serum
sapi atau susu kering. DNA dari organisme yang tidak ada
hubungannya dengan organisme yang DNA-nya telah dihapus
juga dapat digunakan (DNA sperma salmon adalah pilihan
yang populer). Prahibridisasi memakan waktu antara 15 menit
dan 3 jam pada suhu 688C, tergantung pada jenis membran.
Langkah-langkah hibridisasi dan pencucian
Tahap kedua adalah hibridisasi sebenarnya, yang dilakukan
dalam buffer garam tinggi yang mengandung deterjen, biasanya
2 SSC 1 1% SDS. Ada dua isu yang penting pada tahap
percobaan ini. Pertama, DNA probe yang cukup harus
berhibridisasi dengan fragmen restriksi target untuk
menghasilkan sinyal jelas yang dapat dilihat oleh sistem deteksi
yang sesuai dengan label yang dibawa oleh probe. Untuk
aplikasi yang paling menuntut seperti deteksi satu salinan gen
dalam DNA genom manusia, mencapai sensitivitas yang
memadai mungkin menjadi masalah bahkan jika jumlah
maksimum DNA genom dimasukkan ke dalam gel elektroforesis
(dalam praktiknya, sekitar 10 mg DNA per jalur) dan probe
telah diberi label aktivitas spesifik maksimalnya (4 109 dpm mg
21
untuk label radioaktif 32P ). Masalah yang lebih besar akan
dihadapi jika label radioaktif selain 32P digunakan, seperti 35S,
yang umumnya hanya cocok untuk menyelidiki DNA yang
kurang kompleks seperti plasmid terbatas atau klon bakteriofag,
atau jika probe nonradioaktif digunakan. Dalam keadaan ini
beberapa peningkatan sensitivitas dapat diperoleh dengan
memasukkan polimer inert seperti 10% dekstran sulfat atau 8%
polietilen glikol 6000 dalam larutan hibridisasi.
Polimer ini diperkirakan menginduksi molekul probe untuk
membentuk jaringan sehingga jumlah DNA yang lebih banyak
berhibridisasi ke lokasi target pada membran. Dalam praktek,
4 ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net
peningkatan sensitivitas 10 hingga 100 kali lipat dapat dicapai
(Amasino,1986).
Faktor penting kedua yang harus dipertimbangkan selama
langkah hibridisasi adalah kekhususan reaksi. Jika DNA probe
telah dipilih dengan hati-hati maka DNA tersebut akan
mengandung wilayah yang sepenuhnya melengkapi seluruh
atau sebagian dari fragmen restriksi terhapus yang sedang
dicari. Jika wilayah hibridisasi dalam penyelidikan ini tidak
sepenuhnya saling melengkapi dengan target, maka setidaknya
wilayah tersebut akan memiliki kemiripan yang kuat sehingga
hibrida yang stabil dapat terbentuk. Masalahnya adalah bahwa
probe tersebut juga mempunyai potensi untuk melakukan
hibridisasi dengan fragmen DNA lain yang terhapuskan yang
mana ia mempunyai sifat komplementaritas parsial. Eksperimen
hibridisasi tidak akan pernah memberikan sinyal yang jelas jika
probe lebih mirip dengan fragmen restriksi kedua dibandingkan
dengan yang dicari, namun masalah dengan hibridisasi
nonspesifik masih dapat muncul meskipun yang paling cocok
adalah dengan target spesifik. Ini berarti bahwa langkah
hibridisasi harus dilakukan pada 'keketatan' yang menghasilkan
hibrid probe-target tertentu tetap stabil sementara semua hibrid
lainnya tidak stabil, keketatan ditentukan oleh komposisi buffer
hibridisasi dan suhu di mana hibridisasi tersebut berada.
percobaan dilakukan. Komposisi buffer relevan karena
stabilitas hibrid bergantung pada kekuatan ionik dan adanya
zat destabilisasi, seperti formamida, yang mengganggu ikatan hidrogen.
Suhu relevan karena suhu leleh (Tm, suhu tertinggi di mana
hibrida stabil) dari hibrida berpasangan basa penuh lebih tinggi
dibandingkan suhu leleh di mana beberapa pasangan basa
belum terbentuk karena probe dan DNA target tidak sepenuhnya.
yang saling melengkapi. Pembentukan hibrida yang diinginkan,
dan destabilisasi hibrida nonspesifik, dapat dicapai dengan
memanfaatkan kombinasi komposisi buffer dan suhu hibridisasi
yang tepat. Sejumlah strategi berbeda dapat dilakukan. Jika
probe memiliki panjang 4100 bp, misalnya fragmen restriksi
yang dikloning, maka hibridisasi awal biasanya dilakukan pada
suhu 688C dalam buffer garam tinggi, hal ini mewakili kondisi
yang sangat ketat di mana hanya hibrida stabil yang diperkirakan
akan terbentuk, dengan sangat sedikit jika ada hibridisasi
nonspesifik. Dengan strategi ini, langkah pencucian yang
dilakukan setelah hibridisasi dirancang hanya untuk
menghilangkan probe non-hibridisasi. Namun, jika probe
oligonukleotida pendek digunakan (panjang 15-25 nukleotida),
maka langkah hibridisasi biasanya dilakukan dalam kondisi
ketat yang rendah (biasanya pada suhu beberapa derajat di
bawah Tm yang dihitung untuk hibrida yang diinginkan),
sehingga semua hibrida potensial, termasuk yang nonspesifik,
dapat terbentuk. Kekhususan kemudian dicapai dengan
serangkaian pencucian pada suhu yang meningkat sehingga,
diharapkan, hanya hibrida yang diinginkan yang tersisa pada
akhir prosedur.
Setelah dicuci, membran dilakukan prosedur pendeteksian
yang sesuai dengan label yang digunakan, misalnya
autoradiografi untuk label radioaktif. Pemeriksaan ulang
selanjutnya dapat dilakukan jika membrannya
Machine Translated by Google
'dilucuti' dengan mencuci dalam buffer suhu tinggi yang mengandung
alkali dan deterjen untuk mengganggu kestabilan DNA hibridisasi.
Prosedur ini tidak pernah sepenuhnya memuaskan karena sulit untuk
menghindari penghilangan sebagian DNA yang terhapus pada saat yang
sama, sehingga bahkan membran nilon yang membawa DNA yang terikat
secara kovalen hanya dapat ditiru sepuluh kali atau lebih.
Jenis Probe Hibridisasi
Setiap molekul DNA yang melengkapi fragmen restriksi yang dicari dapat
digunakan sebagai probe.
Tergantung pada aplikasinya (lihat di bawah), probe itu sendiri mungkin
berupa fragmen restriksi, atau mungkin berupa molekul DNA yang
diperoleh melalui reaksi berantai polimerase (PCR), atau cDNA yang
dibuat melalui sintesis DNA komplementer dari cetakan mRNA.
Oligonukleotida sintetik juga sering digunakan sebagai probe hibridisasi,
terutama ketika diperlukan diskriminasi antara DNA target yang sangat
mirip. Hal ini karena oligonukleotida dengan panjang 15–25 nukleotida
membentuk hibrida yang suhu lelehnya dapat diperkirakan dengan
rumus:
Tm 5 (2 jumlah nukleotida A dan T)
1 (4 jumlah nukleotida G dan C) 8C
Nilai Tm untuk sebagian besar oligonukleotida 15–25mer berkisar antara
40 dan 908C. Posisi nukleotida berpasangan nonbasa tunggal dalam
hibrid antara probe oligonukleotida dan DNA target dapat mereduksi Tm
sebesar 3–58C, sehingga kontrol suhu pencucian pascahibridisasi
secara hati-hati dapat membedakan lokasi target yang sepenuhnya
melengkapi probe dengan lokasi yang berbeda. hanya pada satu posisi
nukleotida, memungkinkan dilakukannya penyelidikan yang sangat
spesifik.
Jenis penyelidikan hibridisasi populer kedua adalah yang terbuat dari
RNA, bukan DNA. Probe RNA memiliki sejumlah keunggulan
dibandingkan dengan bagian DNA-nya, yang paling penting dalam
praktiknya adalah tersedianya metode sintesis dalam tabung reaksi
sejumlah besar probe RNA dari molekul DNA yang telah diklon
berdekatan. menjadi promotor bakteriofag RNA polimerase. Dimulai
dengan 1 mg DNA kloning, RNA polimerase T7 yang dimurnikan,
misalnya, dapat membuat hingga 30 mg RNA dalam 30 menit, RNA ini
diberi label dengan aktivitas spesifik lebih dari 109 dpm mg jika
ribonukleotida berlabel 32P disertakan dalam campuran reaksi. Probe
21
RNA juga mempunyai keuntungan berupa untai tunggal, yang berarti
bahwa konsentrasi probe efektif tidak menurun selama hibridisasi,
seperti yang terjadi pada probe DNA beruntai ganda karena pasangan
basa dari dua molekul probe yang saling melengkapi satu sama lain.
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net
Teknik Southern Blotting dan Deteksi DNA Terkait
Aplikasi dan Keterbatasan
Blot Selatan
Penerapan Southern blotting beragam dan tidak mudah diringkas dalam
artikel pendek. Dua contoh saja sudah cukup untuk mengilustrasikan
rentang pertanyaan penelitian yang mana teknik ini dapat diterapkan.
Southern blotting dalam identifikasi klon
Penerapan Southern blotting yang paling umum terjadi selama proyek
yang bertujuan untuk identifikasi dan kloning gen tertentu. Southern
blotting pada DNA genom digunakan untuk mengidentifikasi satu atau
lebih fragmen restriksi yang mengandung gen yang sedang dicari dan,
setelah kloning dan identifikasi sementara dari rekombinan yang
diinginkan dengan pemeriksaan hibridisasi koloni atau plak, Southern
blotting pada DNA klon yang dibatasi ulang digunakan untuk
mengonfirmasi identifikasi klon dan mungkin untuk menemukan fragmen
restriksi yang lebih pendek, yang berisi urutan yang diinginkan, dari
dalam DNA yang dikloning. Penerapan yang terakhir ini penting karena
urutan gen yang menarik mungkin hanya memiliki panjang beberapa kb
tetapi awalnya terkandung dalam klon genom beberapa ratus kb yang
disiapkan dengan vektor berkapasitas tinggi seperti kromosom buatan
bakteri atau ragi. Agar Southern blotting dapat diterapkan pada identifikasi
gen, tentu saja diperlukan probe hibridisasi yang sesuai, yang akan
mendeteksi secara spesifik satu atau lebih fragmen restriksi yang
mengandung gen yang sedang dicari. Seringkali gen tersebut telah
diklon sebagai cDNA yang dapat digunakan sebagai probe untuk
mengidentifikasi versi genom gen tersebut. Alternatifnya, jika gen telah
diklon dari organisme terkait, yang urutan gennya kemungkinan besar
serupa dengan organisme yang sedang dipelajari, maka pemeriksaan
heterolog dapat digunakan, yang mana beberapa ketidaklengkapan
antara probe dan target dapat ditoleransi. selama langkah hibridisasi.
Pendekatan ini dapat digunakan, misalnya, untuk mengidentifikasi
homolog gen manusia dalam genom primata lain, dan bahkan dapat
digunakan melintasi batasan spesies yang luas, misalnya dengan
menggunakan gen Drosophila sebagai penyelidikan untuk rangkaian
manusia terkait. Kemungkinan lain adalah dengan menggunakan
rangkaian asam amino dari protein yang dikode oleh gen yang diinginkan
untuk merancang penyelidikan oligonukleotida campuran, yang terdiri
dari berbagai rangkaian terkait yang bersama-sama mencakup semua
kombinasi yang akan mengkode segmen pendek asam amino. urutan.
Misalnya, campuran oligonukleotida 5'-AA(C/U)GA(A/ G)AUGUU(C/
U)UGGUA(C/U)GG-3', yang berisi enam belas urutan berbeda, mencakup
semua kemungkinan amino urutan asam asparagin-glutamin-metionin-
fenilalanin-triptofan-tirosin-glisin dan diharapkan dapat mendeteksi urutan
DNA yang mengkode segmen protein ini bila digunakan pada tingkat
keketatan yang cukup tinggi dalam percobaan hibridisasi Selatan.
5
Machine Translated by Google
Teknik Southern Blotting dan Deteksi DNA Terkait
Analisis polimorfisme panjang fragmen restriksi
Penerapan besar kedua dari hibridisasi Selatan adalah
dalam teknik yang disebut pemetaan polimorfisme panjang
fragmen restriksi (RFLP), yang penting dalam konstruksi
peta genom (Brown, 1999). Perlakuan DNA genom dari
individu yang berbeda dengan satu enzim restriksi tidak
selalu menghasilkan kumpulan fragmen yang sama karena
beberapa situs restriksi bersifat polimorfik, terdapat pada
beberapa individu tetapi tidak ada pada individu lain,
biasanya karena perubahan titik pada urutan nukleotida
mengubah restriksi tersebut. situs ke dalam urutan yang
tidak dikenali oleh enzim restriksi. Situs polimorfik ini dapat
digunakan sebagai penanda dalam pemetaan genetik dan
sangat penting dalam pembuatan peta manusia komprehensif
pertama (Donis-Keller dkk., 1987), terdapat sekitar 105 RFLP
dalam genom manusia. RFLP diketik dengan Southern
blotting seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, probe
berupa fragmen DNA yang mencakup wilayah polimorfik
(mungkin salah satu fragmen polimorfik, mungkin fragmen
yang dibuat dengan memotong DNA dengan enzim restriksi
berbeda, atau mungkin fragmen diperoleh oleh PCR) dan
ada tidaknya situs polimorfik yang ditentukan dari ukuran
fragmen restriksi yang terdeteksi setelah Southern blotting.
Ringkasan
Southern blotting adalah teknik yang memungkinkan fragmen
restriksi tertentu dideteksi dengan latar belakang banyak
fragmen restriksi lainnya. Ini melibatkan transfer fragmen
DNA dari gel elektroforesis ke membran nitro-selulosa atau
nilon sedemikian rupa sehingga pola pita DNA yang ada
dalam gel direproduksi pada membran. Probing hibridisasi
kemudian digunakan untuk mendeteksi fragmen restriksi
yang sedang dicari. Metodologi dasar Southern blotting tidak
berubah sejak teknik aslinya dijelaskan pada tahun 1975,
namun modifikasi telah diperkenalkan dengan tujuan
mempercepat proses dan mencapai transfer yang lebih
efisien. Southern blotting memiliki banyak penerapan dalam
biologi molekuler, termasuk identifikasi satu atau lebih
fragmen restriksi yang mengandung gen atau rangkaian
DNA lainnya.
6 ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group / www.els.net
Situs polimorfik
R1 R2 R3 Peta situs
pembatasan
penyelidikan DNA
23
Hibridisasi
obligasi
Membran nilon Autoradiograf
Gambar 2 Deteksi RFLP dengan Southern blotting. Dalam contoh ini,
jalur 2 berisi DNA yang tidak memiliki situs restriksi polimorfik R2,
sehingga berisi satu fragmen restriksi yang berhibridisasi dengan probe.
DNA di jalur 2 berisi situs polimorfik sehingga menghasilkan dua fragmen
yang berhibridisasi dengan probe. Direproduksi dari Brown (1999)
dengan izin dari BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford.
minat, dan dalam mendeteksi RFLP yang digunakan dalam
konstruksi peta genom.
Referensi
Amasino RM (1986) Percepatan laju hibridisasi asam nukleat oleh
polietilen glikol. Biokimia Analitik 152: 304–307.
Bittner M,Kupferer P dan Morris CF (1980) Transfer elektroforesis protein dan asam nukleat
dari gel lempengan ke lembaran diazobenzyloxymethyl selulosa atau nitroselulosa.
Biokimia Analitik 102: 459– 471.
Brown TA (1999) Genom. Oxford: Penerbit Ilmiah BIOS.
Donis-Keller H, Green P, Helms C dkk. (1987) Peta genetik genom
manusia. Sel 51: 319–337.
Southern EM (1975) Deteksi urutan spesifik di antara fragmen DNA
yang dipisahkan dengan elektroforesis gel. Jurnal Biologi Molekuler
98: 503–517.
Bacaan lebih lanjut
Ausubel FM,Brent R,Kingston RE dkk. (eds) (1993) Protokol Terkini
dalam Biologi Molekuler. New York: John Wiley.
Brown TA (1995) Kloning Gen: Sebuah Pengantar,Edisi ke-3rd. London:
Chapman & Aula.
Brown TA (1998) Labfax Biologi Molekuler. London: Pers Akademik.
Dyson NJ (1991) Imobilisasi asam nukleat dan analisis hibridisasi.
Dalam: Brown TA (ed.) Biologi Molekuler Esensial: Pendekatan
Praktis, vol. 2, hal. 111–156. Oxford: Pers Universitas Oxford.
Sambrook J,Fritsch EF dan Maniatis T (1989) Kloning Molekuler.
Panduan Laboratorium. Cold Spring Harbor, NY: Laboratorium Cold
Spring Harbor.
Watson JD, Gilman M, Witkowski J dan Zoller M (1992) Rekombinan
DNA, edisi ke-2. New York: WH Freeman.