Acara 6

Ekstraksi DNA

I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Sampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit
dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan sec ara kimiawi monoton.
Sebagai m a t e r i g e n e t i k s u a t u o r g a n i s m e , n u k l e o t i d a h a n y a d a p a t
d i a n a l i s i s s e c a r a t i d a k langsung melalui analisis urutan protein dan
RNA melalui analsis genetik. Kini m e n j a d i h a l y a n g m u n g k i n u n t u k
m e n g i s o l a s i s u a t u r e g i o n s p e s i f i k d a r i s u a t u genome, yaitu total
informasi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme; dan untuk m e m p r o d u k s i
jumlah kopi yang tidak ter batas dar i region ter sebut, atau
untuk mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut
h a n y a d a l a m s e m a l a m , dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik.
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti
p a r a r e l d e n g a n komponen -komponenn ya, yaitu gul a pentosa
( d e o k s i r i b o s a ) , g u g u s f o s f a t d a n pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA
yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.
Genom adalah set lengkap darimateri genetik (DNA) yang dimiliki suatu
organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik
pada manusia maupun tumbuhan.
Isolasi DNA meru pakan langkah yang tepat untuk
mempelajari DNA. Prinsipn ya ada dua, yaitu sentri fugasi dan
presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
c a m p u r a n b e r d a s a r k a n b e r a t m o l e k u l k o m p o n e n n y a . Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi
merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari
campuran. Pada praktikum kali ini, kami akan mencoba untuk mengekstraksi DNA
dengan metode sederhana dengan menggunakan sampel daging buah pepaya,
strawberry, dan mangga serta metode CTAB dengan menggunakan sampel daging
buah pepaya, strawberry, mangga, daun kertas, daun cabai, dan daun jagung.
B. Tujuan
1. Dapat mengetahui proses ekstraksi DNA dengan berbagai sampel.
2. Dapat memahami gambaran umum DNA hasil ekstraksi sebagai unit hereditas.
 II. TINJAUAN PUSTAKA
Biologi sel dan molekuler merupakan bidang ilmu yang terus menerus
berkembang. Ilmu ini bermanfaat hampir di semua bidang. Baik bidang medis untuk
menangani kelainan-kelainan genetik dan penemuan obat-obat baru, pada bidang
pertanian, peternakan, dan kehutanan untuk meningkatkan produk-produk baik
tanaman maupun hewan unggul maupun di bidang lingkungan dalam hal mengatasi
polutan serta perannya dalam kemajuan produksi pangan. Isolasi DNA merupakan
teknik yang penting dala,m pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian dan kualitas
dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yang akan diperoleh. Secara umum,
prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi DNA mencakup 3 hal penting, yaitu harus
bisa dihasilkan DNA dengan kemurniannya yang tingi, DNAnya harus utuh, dan
jumlahnya tinggi (konsentrasi tinggi). (Clark, 1997)
Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting
dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik
makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam
suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional
maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen
(Suryo, 2004).
Isolasi DNA juga merupakan langkah pertama dalam studi sekuen DNA dari
populasi DNA kompleks dan dalam analisis struktur genom dan ekspresi gen.
Kuantitas, kualitas, dan intregritas DNA akan mempengaruhi hasil yang diperoleh
secara langsung. (Surzycki, 2000)
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1)Isolasi sel; (2)Lisis dinding dan
membransel; (3)Ekstraksi dalam larutan; (4)Purifikasi; dan (5)Presipitasi. Prinsip-
prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis
molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih
berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama
mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation
per minute) atau 3000 rpm. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus
dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya.
Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan
mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas
sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga
dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA
plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan.
 III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan
1. Metode Konvensional
No Sampel Kemurnian Konsentrasi
1 Buah Strawberry 1.182 1299 ng/ L
2 Buah Pepaya 1.188 1898 ng/ L
3 Buah Mangga 1.200 599/ L

2. Metode CTAB
No Sampel Kemurnian Konsentrasi
1 Daun Cabai 2.286 1589 ng/ L
2 Daun Bunga Kertas 1.900 1898 ng/ L
3 Daun Jagung 1.821 5095 ng/ L
4 Buah Strawberry 1.00 200 ng/ L
5 Buah Pepaya 1.00 400 ng/ L
6 Buah Mangga 1.33 200 ng/ L

B. Pembahasan
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolasi DNA
yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Aris, 2010).

CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi
protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila
dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan
ke dalam buffer ekstraksi ( Purwantara, 2001). Metode ekstraksi DNA dengan CTAB
akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari
polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility).
Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA
dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA
tergantung bahan yang diekstraksi.

Pada praktikum ini dilakukan dengan 2 metode yakni metode konvesional dan metode
CTAB. Metode konvensional menggunakan sampel yaitu daging buah strawberry,
mangga dan pepaya. Daging buah tersebut dihancurkan didalam plastik ziplock yang
telah disediakan. Kemudian daging buah yang berada di dalam plastik ziplock
dimasukkan kedalam gelas bening yang telah disediakan. Selanjutnya ditambahkan
dengan 1 sendok garam, 1 sendok detergen dan 100 ml aquades diaduk secara hati hati,
jangan sampai menghasilkan busa. Penambahan beberapa larutan seperti campuran
aquades, garam, dan detergen berfungsi untuk mengurangi tegangan sel dan untuk
melarutkan lipid. Dilanjutkan dengan hasil campuran tadi disaring menggunakan kertas
saring. Penyaringan berfungsi untuk menjaga serat serat tidak ikut dalam larutan yang
digunakan. Setelah disaring, kemudian larutas hasil saringan ditambahkan alkohol untuk
mengendapkan DNA, pada penambahan ini diharapkan jangan sampai berbusa karena
akan susah dibedakan antara supernatan dengan busannya. Lalu larutan tersenit dilarutkan
kedalam mikrotube menggunakan mikropipet. Selanjutnya disentrifuse selama 15 menit
1200 rpm. Setelah itu dikeluarkan, akan terlihat DNA yang menempel pada mikrotube,
DNA terlihat berwarna putih telur dengan ukuran sangat kecil, setelah itu larutannya
dibuang, DNA yang masih menempel akan dikeringkan.

Pada metode modern yaitu dengan menggunakan buffer CTAB, langkah awal buffer
CTAB dipanaskan pada suhu 65 C selama 30 menit. Fungsi dari pemnasan buffer CTAB
ini agar supaya larutan buffer CTAB menjadi homogen. Dalam buffer ekstraksi CTAB
terdapat 1% PVP yang berfungsi untuk mendegradasi komponen phenopolik,
Mercaptoethanol yang berfungsi untuk mendegradasi polisakarida. Selanjutkan dilakukan
penggerusan pada sampel daun. Langkah ini merupakan langkah yang sangat penting dan
harus benar-benar diperhatikan dalam ekstraksi DNA. Semakin halus, maka DNA yang
akan di ekstrak pun akan lebih mudah, begitu juga sebaliknya. Setelah dilakukan
penggerusan selajutnya dilakukan inkubasi campuran hasil gerusan dan buffer pada suhu
65 C selama 60 menit dan setiap 10 menit dilakukan pembalikan. Tahap ini dilakukan
untuk mengefektifkan lisis sel dan me-nonaktifkan DNAse yang dapat merusak DNA
serta menghancurkan protein, komponen phenol dan polisakarida. Setelah 60 menit
campuran diambil dari waterbath dan didiamkan selama 2 menit kemudian ditambahkan
pada setiap sampel 500 l campuran 24 chloroform : 1 isoamil alkohol. Tinggi cairan
haruslah seimbang. Dicampur dengan baik kemudian divortex selama 5 menit. Tujuan
dari tahap ini adalah mengekstrak dan mengedapkan protein, komponen phenol dan
polisakarida dlln di dalam campuran untuk dipisahkan dari larutan DNA dengan
sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada
di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil
sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada
bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Supernatan yang telah terbentuk kemudian
diambil dengan hati-hati dan dipindahkan ke mikrotube yang baru. Kemudian,
ditambahkan sodium asetat 3M sebanyak 1/10 dari volume supernatan. Selanjutnya,
ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 2/3 volume total (seupernatan + sodium
asetat), dihomogenkan dengan cara membolak-balikan tabung. Campuran ini nantinya
didiamkan didalam freezer selama 1-24 jam. Tahap ini berfungsi untuk mengendapkan
DNA (presipitasi). DNA akan mengendap oleh keberadaan garam, isopropanol dan suhu
dingin. Langkah selanjutnya adalah setrifuse 12.000rpm selama 10 menit. Cairan dan
endapan DNA dibuang dengan menambahkan 500 l etanol 70% dengan cara membolak-
balikan mikrotube. Hal ini bertujuan untuk mencuci endapan DNA supaya bersih dari
sisa-sisa garam yang mengkontaminasinya. Setelah disentrifuse 5 menit dalam 12.000
rpm. Selanjutnya buang cairan dan endapan DNA dikeringkan dengan cara diangin-
anginkan. Setelah kering, endapan DNA dilarutkan kembali dengan 50-100 l TEbuffer +
1% RNAse dan diinkubasi pada waterbath pada suhu 37C selama 60 menit. RNAse
berfungsi mendegradasi RNA yang terbawa bersama DNA. Langkah terakhir DNA
disimpan pada suhu 4C. Pada percobaan ini sterilisasi alat penting untuk dilakukan hal
ini dilakukan dengan tujuan untuk menghindari terjadinya kontaminasi DNA.
Kontaminasi ini akan mempengaruhi kemurnian DNA (tidak menunjukan sifat genetik
tanaman yang diuji).

Setelah dilakukan ekstraksi DNA menggunakan CTAB, selanjutnya dilakukan

visualisasi DNA genom dengan elektroforesis. Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen/ molekul bermuatan berdasakan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah
medan listrik. Pada praktikum ini elektroforsis DNA menggunakan metode elektroforsis
gel agarosa. Gel agarosa dapat digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari
100 bp, sedangkan untuk memisahkan DNA dengan ukuran lebih pendek dapat digunakan
gel poliakrilamid. Agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga.

Setelah dilakukan visualisasi DNA dengan elektroforesis, langkah terakhir dari

ekstraksi DNA ini adalah menentukan kuantifikasi konsentrasi dan kemurnian DNA
genom dengan alat spektrofotometer. Spektrofotometer merupakan suatu metode analaisa
yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan
berwarna pada panjang gelombng spesifik dengan menggunakan monokromator prisna
atau kisi difraksi dengan detector Fototube. Prinsip alat ini adalah pemancaran sinar.
Absorbansi (kemampuan suatu partikel untuk menangkap cahaya) panjang gelombang
yang diharapkan adalah 260 nm, hal ini dikarenakan pada panjang gelombang ini
komponen yang terdeteksi adalah komponen DNA/RNA, sedangkan pada absorbansi
panjang gelombang 280 nm komponen yang terdeteksi adalah komponen protein dan
pada absorbansi panjang gelombang 320 nm komponen yang terdeteksi adalah komponen
pengotor lainnya yang tidak diharpakan terjadi.

Dari hasil dapat dilihat perbedaan kemurnian serta konsentrasi gen pada ektraksi
dengan metode konvesional dan dengan menggunakan CTAB. Pada kemurnian gen
diharapkan ratio yang di dapatkan antara 1,8-2. Jika kemurnian menunjukan angka
diantara ratio tersebut maka dapat dikatakan bahwa kemurnian gen tersebut tinggi dan
sudah tidak ada lagi pengotor-pengotor lainnya didalam DNA hasil ektraksi. Pada sampel
buah dengan kedua metode didapatkan hasil bahwa kemurnian gen tidak ada yang
berdada pada ratio 1,8-2. Hal ini menunjukan bahwa masih terdapat pengotor-pengotor
lain yang tidak diharapkan yang terbaca oleh spektofotometri. Sehingga hasil dari
kemurnian gen rendah. Akan tetapi ektstraksi DNA dengan metode konvensional
memiliki kemurnian gen lebih tinggi dibandingkan dengan ekstraksi DNA dengan
menggunakan metode CTAB. Hal ini dimungkinkan terjadi karena rendahnya sterilitas
alat pada ekstraksi DNA dengan metode CTAB sehingga terjadi kontaminasi dengan
DNA lain dan menyebabkan rendahnya kemurnian gen (tidak menunjukan sifat asli
genetik organ buah tersebut). Selanjutnya, jika ditinjau dari konsentrasi gen (kuantitas)
didapatkan hasil pada ektstraksi DNA dengan metode konvensional memiliki lebih
banyak partikel DNA didalam hasil ektraksinya dibandingkan dengan metode CTAB.
Pada ekstraksi DNA dengan sampel daun didapatkan ratio kemurnian tinggi, hal ini
menunjukan bahwa tidak ada lagi pengotor lain yang ada di dalam hasil ekstraksi DNA.
Absorbansi (kemampuan suatu partikel untuk menangkap cahaya) panjang gelombang
adalah 260 nm, pada panjang gelombang ini menunjukan bahwa komponen yang
terdeteksi adalah komponen DNA/RNA. Pada konsentrasi gen (kuantitas) didapatkan
hasil pada ektstraksi DNA dengan metode CTAB tinggi hal ini menunjukan bahwa
terdapat banyak partikel DNA dalam satuan mL.
 IV. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:

1. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan metode konvensional menggunaan detergen,

dan metode CTAB
2. Pada metode konvensional, nilai kemurnian tertinggi adalah buah mangga 1,200 dan
nilai konsentrasi tertinggi adalah buah pepaya 1898. Pada metode CTAB kemurnian
tertinggi adalah daun cabai 2.286 dan nilai konsentrasi tertingi adalah daun jagung
5095.
DAFTAR PUSTAKA

Aris. 2010. Restriction Enzymes and DNA Hibrydization. diakses dari

http://www.nature.com/scitable/topicpage/Restriction-Enzymes-545 Diakses pada
tanggal 17 September 2016 pukul 21.30 WIB.
Clark, M.S. 1997. Plant Molecular Biologi. Lab Fox. BIOS Scientific Publisher Limited.
United Kingdom
Purwantara, A. 2001. Principles of DNA Isolation and Manipulation. Workshop on Plant
Pathogens Detection by Moleculae Tehniques.
Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Surzycki, S. 2000. Basic Technique in Molecular Biology. Springer-Verlay. Berlin
Heidelberg. Germany