PERCOBAAN I OPTIMASI METODE ANALISA OBAT

A. TUJUAN 1. 2. Memahami langkah-langkah analisa obat di dalam darah Mampu melakukan validasi metode analisa obat di dalam darah

B.

DASAR TEORI Validasi merupakan suatu proses yang terdiri atas paling tidak 4 langkah nyata, yaitu: 1. 2. 3. 4. Validasi perangkat lunak (software validation) Validasi perangkat keras/instrumen (instrumcnt/liord-ware validation) Validasi metode, dan Kesesuaian sistem (system suitability)

Proses validasi dimulai dengan perangkat lunak yang tervalidasi dan sistem yang terjamin, lalu metode yang divalidasi menggunakan sistem yang terjamin dikembangkan. Akhimya, validasi total diperoleh dengan melakukan kesesuaian sistem. Masing-masing tahap dalam proses validasi ini merupakan suatu proses yang secara keseluruhan bertujuan untuk mencapai kesuksesan validasi. Validasi Metode Analisis Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis, karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika: 1. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi 2. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu. 3. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda. 4. Untuk mendemonstrasikan kcsetaraan antar 2 metode, seperti

5.

antara metode baru dan metode baku.

Menurut USP (United States Pharmacopeia), ada 8 langkah dalam validasi metode analisis sebagaimana terlihat dalam gambar di bawah ini: 1. Ketepatan (akurasi) Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan. Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar (standard reference material, SRM). Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi). Data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali. 2. Presisi Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diokspresikan sebagai simpangan baku relatif dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik. Sesuai dengan ICH, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu: keterulangan (repeatibiliy), presisi antara (intermediate precision) dan ketertiruan (reproducibility). Keterulangan yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. Presisi antara yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. Ketertiruan merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain.

Dokumentasi presisi seharusnya mencakup: simpangan baku, simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV), dan kisaran kepercayaan. Pengujian presisi pada saat awal validasi metode seringkali hanya menggunakan 2 parameter yang pertama, yaitu: keterulangan dan presisi antara. Reprodusibilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan uji banding antar laboratorium. Presisi seringkali diekspresikan dengan SD atau standar deviasi relatif (RSD) dari serangkaian data. 3. Spesifisitas Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmumian, produk degradasi, dan komponen matriks. ICH membagi spesifisitas dalam 2 kategori, yakni uji identifikasi dan uji kemurnian atau pengukuran. Untuk tujuan identifikasi, spesifisitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode analisis untuk membedakan antar senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hampir sama. Untuk tujuan uji kemurnian dan tujuan pengukuran kadar, spesifisitas ditunjukkan oleh daya pisah 2 senyawa yang

berdekatan. Senyawa-senyawa tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen aktif dan atau suatu pengotor. Jika dalam suatu uji. terdapat suatu pengotor (impurities) maka metode uji harus tidak terpengaruh dengan adanya pengotor ini. Penentuan spesifisitas metode dapat diperoleh dengan 2 jalan. Yang pertama (dan yang paling diharapkan), adalah dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dari senyawa-senyawa lain (resolusi senyawa yang dituju 2). Cara kedua untuk memperoleh spesifisitas adalah dengan menggunakan detector selektif, terutama untuk senyawa-senyawa yang terelusi secara bersama-sama. 4. Batas Deteksi {limit of detection, LOD) Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi vang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blanko (yb) ditambah dengan 3 simpangan baku blanko (3Sb). 5. Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ) Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan). Kadang-kadang rasio signal to noise 10: 1 digunakan untuk menentukan LOQ. PerhitunganLOQ dengan rasio signal to noise 10: 1 merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bahwa LOQ merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. Jadi, jika konsentrasi LOQ menurun maka presisi juga menurun. Jika presisi tinggi dipersyaratkan, maka konsentrasi LOQ yang lebih tinggi harus dilaporkan. ICH mengenalkan metode rasio signal to noise ini, meskipun demikian sebagaimana dalam perhitungan LOD, ICH juga meng-gunakan 2 metode pilihan lain untuk menentukan LOQ yaitu: (1) metode non instrumental visual dan (2) metode perhitungan. 6. Linieritas Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan koefisien korelasinya. 7. Kisaran (range) Kisaran suatu metode didefinisikansebagai konsentrasi terendah dan terringgi yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, dan linieritas yang mencukupi. Kisaran-kisaran

konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama (mayor), maka konsentrasi baku harus diukur di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan. 8. Kekasaran (Ruggedness) Kekasaran (Ruggedness) merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh di bawah kondisi yang bermacam-macam yang diekspresikan sebagai persen standar deviasi relatif (% RSD). Kondisi-kondisi ini meliputi laboratorium, analis, alat, reagen, dan waktu percobaan yang berbeda. 9. Ketahanan (Robutness) Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter-parameter metode seperti: persentase pelarut organik, pH, kekuatan ionik, suhu, dan sebagainya. Suatu praktek yang baik untuk mengevaluasi ketahanan suatu metode adalah dengan memvariasi parameter-parameter penting dalam suatu metode secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan. 10. Stabilitas Untuk memperoleh hasil-hasil analisis yang reprodusibel dan reliabel, maka sampel, reagen dan baku yang digunakan harus stabil pada waktu tertentu (misalkan 1 hari, 1minggu, 1 bulan, atau tergantung kebutuhan). Stabilitas semua larutan dan reagen sangat penting, baik yang berkaitan dengan suhu atau yang berkaitan dengan waktu. Jika larutan tidak stabil pada suhu kamar, maka penurunan suhu hingga 28"C dapat meningkatkan stabilitas sampel dan standar. 11. Kesesuaian system Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem yang didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-persyaratan kesesuaian sistem biasanya dilakukan setelah dilakukan pengembangan metode dan validasi metode. Baik USP maupun ICH telah memperkenalkan bahwa tidak selamanya parameter untuk mengevaluasi validasi metode diuji. USP membagi metode-metode analisis ke dalam kategori yang terpisah, yaitu: a. b. c. Penentuan kuantitatif komponen-komponen utama atau bahan aktif Penentuan pengotor (impurities) atau produk-produk hasil degradasi Penentuan karakteristik-karakteristik kinerja

d.

Pengujian identifikasi (Ibnu Gholib G., 2008)

Akurasi dan Presisi adalah persyaratan paling mendasar untuk suatu analisis adalah bahwa analisis tersebut harus akurat dan tepat. Serangkaian pengukuran (y) pada sampel yang sama diperkirakan, meskipun tidak dapat dibuktikan, akan terdistribusi secara normal di sekitar suatu rerata (), yaituhasil-hasil pengukuran tersebut. Prosedur analisis , memberikan deskripsi yang tepat bagaimana suatu analisis dilakukan. Tahaptahap penting untuk melakukan tiap uji analisis harus dijelaskan secara terperinci. Metode lengkap harus menjelaskan: 1. 2. 3. mutu dan sumber baku pembanding untuk senyawa yang sedang dianalisis; prosedur yang digunakan untuk menyiapkan larutan baku pembanding; mutu semua pereaksi atau pelarut yang digunakan dalam penetapan kadar dan metode pembuatannya; 4. prosedur dan keadaan yang digunakan untuk pengoperasian semua perlengkapanyang diperlukan dalam penetapan kadar tersebut; dan 5. metodologi yang digunakan untuk kalibrasi penetapan kadar dan metodologi yang digunakan untuk pemrosesan sampel tersebut sebelum analisis. Presisi (ketepatan, pedoman ICH mendefinisikan presisi sebagai berikut: "Presisi suatu prosedur analisis menyatakan kedekalan kesesuaian (derajat sebaran) di antara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari pengambilan sampel berulangpada sampel homogen yang sama di bawah kondisi-kondisi yang ditentukan... Presisi suatu prosedur analisis biasanya dinyatakan sebagai variansi, simpangan baku, atau koefisien variasi serangkaian pengukuran. " Secara luas, hal ini merupakan hal-hal yang telah dijelaskan dengan lebih terperinci sebelumnya untuk penetapan kadar tablet parasetamol. Tidak ada pedoman mutlak tentang seberapa baik seharusnya presisi tersebut untuk bahan aktif di dalam formulasi tapi, secara umum, presisi yang diinginkan adalah 1,0%. Presisi yang dapat diperoleh tergantung pada sifat sampel yang sedang dianalisis. Salah satu kesulitan dalam mendefinisikan presisi suatu penetapan kadar adalah pengindikasian tahap-tahap apa saja dalam penetapan kadar yang harus diperiksa. Pada mulanya suatu penetapan kadar memiliki karakteristik secara rinci tetapi, kemudian dalam menentukan kembali presisi (misalnya dalam rangka menentukan keterulangan dan presisi intermediat), unsurunsur tertentu dalam penetapan kadar tersebut mungkin dipertimbangkan. Berdasarkan pedoman ICH, presisi mungkin dipertimbangkan pada tiga tingkatan: a. Keterulangan Keterulangan menyatakan presisi yang diperoleh di bawah kondisi-kondisi pelaksanaan yang sama selama interval waktu yang singkat. Keterulangan juga dapat disebut scbagai presisi intra penetapan kadar.

b.

Presisi intermediate Presisi intermediat menyatakan variasi presisi dalam laboratorium pada saat analisis tersebut dilakukan oleh analis yang berbeda, pada hari-hari yang berbeda, dan dengan menggunakan perlengkapan yang berbeda. Jadi suatu laboratorium akan melakukan standardisasi terhadap bagian tertentu pada perlengkapan, metode, dan memastikan bahwa semua analisnya dilatih dengan standar yang sama.

c.

Reprodusibilitas Reprodusibilitas menyatakan presisi antar laboratorium. Uji tersebut akan dilakukan jika suatu metode sedang diganti dari satu bagian perusahaan ke bagian yang lain.

Akurasi, seperti dijelaskan di atas, metode dapat tepat tetapi tidak akurat. Penentuan akurasi dalam penetapan kadar suatu bahan obat yang tidak diformulasi relatif dilakukan secara langsung. Metode paling sederhana adalah membandingkan zat yang sedang dianalisis dengan baku pembanding yang dianalisis dengan menggunakan prosedur yang sama. Baku pembanding adalah bentuk obat tersebut yang sangat terkarakterisasi yang telah menjadi subjek analisis yang ekstensif termasuk uji komposisi unsur. Metode untuk penentuan akurasi penetapan kadar suatu obat yang diformulasi lebih sedikit dilakukan secara langsung. Prosedur analisis dapat diterapkan untuk: formulasi obat yang disiapkan dalam skala kecil sehingga jumlah obat dalam formulasi tersebut lebih tepat dikendalikan daripada dalam proses ruahan; suatu formulasi plasebo ditingkatkan secara tiba-tiba dengan suatu obat dalam jumlah yang diketahui. Akurasi metode ini juga dapat dinilai dengan membandingkan metode tersebut dengan metode pembanding yang sudah ditentukan sebelumnya seperti dalam metode farmakope.

Kesalahan acak majemuk Kesalahan sistematik dalam analisis biasanya dapat dieliminasi, tetapi kesalahan acak nyata disebabkan oleh pelaksanaan dalam suatu pengujian yang belum sepenuhnya dikendalikan. Jenis kesalahan acak umumnya berasal dari penerimaan toleransi pabrik Jadi hal ini dapat dilihat bahwa kesalahan majemuk dari alat-alai gelas sedikit berbeda' dari kesalahan terbesar dalam proses. Tentu saja kesalahan alat gelas dapat dicliminasi dengan kalibrasi alat gelas sebelum digunakan, tetapi umumnya analis akan menerima toleransi pabrik. Kesalahan acak yang ditoleransi dari alat gelas dapat mudah dihilangkan; kesalahan acak lain seperti variasi dalam efisiensi ekstraksi Icbih sulit dikendalikan.

Istilah-istilah lain yang digunakan dalam pengendalian prosedur analisis: a. Kesesuaian sistem Kesesuaian sistem tidak boleh tertukar dengan validasi metode. Uji kesesuaian sistem lebih sering diterapkan pada instrumen analisis. Uji-uji tersebut dirancang untuk mengevaluasi komponen-komponen sistem analisis untuk menunjukkan bahwa kinerja sistem memenuhi standar yang dipersyaratkan oleh metode tersebut. Validasi metode dilakukan satu kali pada

akhir pengembangan metode, sedangkan uji-uji kesesuaian sistem dilakukan terhadap suatu sistem secara periodik untuk menentukan apakah sistem tersebut masih berjalan dengan baik dan mampu digunakan untuk analisis. b. Blangko analisis Blanko analisis terdiri atas semua pereaksi atau pelarut yang digunakan dalam analisis tanpa adanya analit. Blangko analisis yang sebenarnya harus mencerminkan semua operasi yang melibatkan analit tersebut dalam sampel sebenarnya sebagai subjek. c. Kalibrasi Kalibrasi suatu metode meliputi perbandingan nilai atau nilai-nilai parameter tertentu yang diukur oleh sistem di bawah kondisi-kondisi yang ditetapkan secara ketat dengan nilai-nilai standar yang telah ditentukan sebelumnya. d. Selektivitas Selektivitas suatu metode adalah suatu ukuran seberapa mampu metode tersebut mengukur analit saja dengan adanya senyawa-senyawa lain yang terkandung di dalam sampel.

(David Watson, 2007)

Farmakokinetika meneliti perjalanan obat, mulai dari saat pemberiannya, bagaimana absorbs dari usus transport dalam darah, dan distribusinya ke tempat kerjanya dan jaringan lainnya. Begitu pula bagaimana perombakannya (biotransformasi) dan akhirnya dieksresi oleh ginjal. Singkatnya farmakokinetika mempelajari segala sesuatu tindakan yang dilakukan tubuh terhadap obat. (Tan Hoan Tjay, 2007)

Tehnik analisis hanya merujuk pada pengukuran dan evaluasi hasil pengukuran, sedangkan prosedur analisis merupakan serangkain proses mulai dari penyiapan sampel sampai evaluasi hasil pengukuran. Keseluruhan tahap/langkah prosedur analisis dapat diringkas sbb : a. b. c. d. e. Definisi masalah Pemilihan tehnik dan metode analisis Pengambilan sampel Pra-perlakuan sampel Pengukuran analit yang dibutuhkan

f.

Perhitungan dan interaksi data analisis Metode analisis Suatu metode analisis terdiri atas serangkain langkah yang harus diikuti untuk tujuan analisis kuantitatif, kualitatif, dan informasi struktur dengan menggunakan tehnik tertentu. Dalam setiap analisis, pemilihan suatu metode analisis harus memperhatikan faktor-faktor sbb: a. b. c. d. e. Tujuan analisis Jumlah sampel Level analit Macam sampel Peralatan (Sudjadi, 2008)

Na.diklofenak Mempunyai aktivitas antirematik, antiradang dan analgesic antipiretik, digunakan terutama untuk mengurangi rasa nyeri akibat peradangan pada berbagai keadaan rematik dan kelainan degenerative pada system otot rangka. Diklofenak diabsorbsi secara cepat dan sempurna dalam lambung, kadar plasma tertinggi dicapai 2 jam setelah pemberian oral, dengan waktu paro eliminasi 3-6 jam. Dosis : 25-50mg 3.d.d (Siswandono, Bambang Soekardjo, 2008)

C.

ALAT DAN BAHAN ALAT : o o o o o o o Labu Takar Mikropipet Tabung reaksi Tabung penampung darah Vortex Mixer Sentrifuge Spektrofotometer

o o

Skalpel Hematokrit

BAHAN : o o o o o Na.diklofenak Asam Trikloroasetat (TCA) 5% Heparin Aqua dest Tikus

D.

SKEMA KERJA a. Pembuatan larutan stok natrium diklofenak

Ditimbang 50mg serbuk Na.diklofenak

Dilarutkan ke dalam aq.dest ad 100ml dengan menggunakan labu takar 100ml

Digojog hingga homogen, kadar yang diperoleh adalah 50ppm

b.

Pembuatan Kurva Baku Interval

Diambil darah sebanyak 500l yang mengandung heparin

Ditambah larutan stok Na.diklofenak sehingga kadarnya 0(blangko), 6g/ml, 10g/ml, 14g/ml, 16g/ml, 18g/ml, dan 22g/ml

Diaduk hingga homogen

Ditambah 1,0ml TCA 5% dengan vortexing Disentrifuge 5-10 menit, 2500rpm

Diambil beningan 1,0ml ditambah aq.dest 5,0ml

Dibaca nilai absorban larutan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang max menggunakan blangko darah yang dip roses dengan cara yang sama

c. Pemrosesan sampel darah in vivo (sebagai blangko)

Diambil 500l darah yang mengandung heparin

Ditambah 1,0ml TCA 5% dengan vortexing

Disentrifuge 5-10 menit, 2500rpm

Diambil beningan 1,0ml, ditambah aq.dest 5,0ml

Dibaca nilai absorban larutan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang max menggunakan blangko darah yang dip roses dengan cara yang sama

E.

DATA PENGAMATAN

F.

PERHITUNGAN

1. Pembuatan kurva baku internal a. 6 g / ml V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 500 g / ml = 500 g / ml x 6 g / ml V1 = 6 g / ml + ( 500 l 6 l ) + 1 ml TCA sentrifuge V1 = 6 g / ml + 494 l + 1 ml TCA sentrifuge

b. 10 g / ml V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 500 g / ml = 500 g / ml x 10 g / ml

V1 = 10 g / ml + ( 500 l 10 l ) + 1 ml TCA sentrifuge V1 = 10 g / ml + 490 l + 1 ml TCA sentrifuge c. 14 g / ml V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 500 g / ml = 500 g / ml x 14 g / ml V1 = 14 g / ml + ( 500 l 14 l ) + 1 ml TCA sentrifuge V1 = 14 g / ml + 486 l + 1 ml TCA sentrifuge d. 16 g / ml V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 500 g / ml = 500 g / ml x 16 g / ml V1 = 16 g / ml + ( 500 l 16 l ) + 1 ml TCA sentrigufe V1 = 16 g / ml + 484 l + 1 ml TCA sentrigufe e. 18 g / ml V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 500 g / ml = 500 g / ml x 18 g / ml V1 = 18 g / ml + ( 500 l 18 l ) + 1 ml TCA sentrigufe V1 = 18 g / ml + 482 l + 1 ml TCA sentrigufe

f. 22 g / ml V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 500 g / ml = 500 g / ml x 22 g / ml V1 = 22 g / ml + ( 500 l 22 l ) + 1 ml TCA sentrigufe V1 = 22 g / ml + 478 l + 1 ml TCA sentrigufe Koreksi kadar : a. V1 x C1 = V2 x C2 6,0 l x 462 g / ml = 500 ml x C2 C2 = 5,544 g / ml b. V1 x C1 = V2 x C2 10,0 l x 462 g / ml = 500 ml x C2 C2 = 9,24 g / ml c. V1 x C1 = V2 x C2 14,0 l x 462 g / ml = 500 ml x C2 C2 = 12,936 g / ml d. V1 x C1 = V2 x C2 16,0 l x 462 g / ml = 500 ml x C2 C2 = 14,784 g / ml e. V1 x C1 = V2 x C2 18,0 l x 462 g / ml = 500 ml x C2 C2 = 16,632 g / ml

f. V1 x C1 = V2 x C2 22,0 l x 462 g / ml = 500 ml x C2 C2 = 20,328 g / ml

Absorbansi deret baku : C ( g / ml ) 0,000 5,544 9,240 12,936 14,784 16,632 20,328 A( = 230,5 nm ) 0,000 0,260 0,181 0,566 0,608 -0,274 -0,060 A ( 280,5 nm ) 0,000 -0,283 -0,213 -0,218 -0,133 0,013 0,128

Untuk = 230,5 nm A = 0,2180, B = -3,0864 . 10-3, R = -0,0659 Untuk = 280,5 nm A = -0,1991, B = 8,6589. 10-3, R= 0,3997 Absorbansi perlakuan : C ( g / ml ) A( = 230,5 nm ) A ( 280,5 nm )

0,000 9,240 12,936 20,328

0,000 1,896 1,984 1,792

0,000 0,300 0,383 0,368

C ( g / ml ) 0,000 9,240 12,936 20,328

A(

= 230,5 nm ) 0,000 -0,178 0,031 -0,150

A ( 280,5 nm ) 0,000 0,152 0,344 0,201

= 230,5 nm y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 Menentukan :

Konsentrasi 9,240 g / ml

1. y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 1,896 = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 x = -543,6755 g / ml 2. y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 -0,178 = 3,0864 . 10-3 x + 0,2180 x = 128,3048 g / ml

Konsentrasi 12,936 g / ml

1. y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 1,984 = 3,0864 . 10-3 x + 0,2180 x = -572,1877 g / ml

2. y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 0,031 = 3,0864 . 10-3 x + 0,2180 x = 60,5884 g / ml Konsentrasi 20,328 g / ml

1. y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 1,792 = 3,0864 . 10-3 x + 0,2180 x = -509,9793 g / ml 2. y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 -0,150 = 3,0864 . 10-3 x + 0,2180 x = 119,2328 g / ml Menentukan Perolehan kembali ( P % ) Konsentrasi 9,240 g / ml

1.

x 100 % = -5883,93 %

2.

x 100 % = 1388,58 %

Konsentrasi 12,936 g / ml

1.

x 100 % = -4423,21 %

2.

x 100 % = 468,37 % Konsentrasi 20,328 g / ml

1.

x 100 % = -2508,75 %

2.

x 100 % = 586,54 %

Menentukan Kesalahan sistemik : Konsentrasi 9,240 g / ml I. 100 ( -5883,93 % ) = 5983,93 % II. 100 1388,58 % = 1288,58 % Konsentrasi 12,936 g / ml I. 100 ( -4423,21 % ) = 4523,21 % II. 100 468,37 % = -368,37 % Konsentrasi 20,328 g / ml I. 100 ( -2508,75 % ) = 2608,75 % II. 100 586,54 % = -486,54 %

Menentukan Kesalahan acak : I. C = 9,240 g / ml = -207,6854, SD = 475,1618

Kesalahan acak = II. C = 12,936 g / ml

x 100 % = -228,79 % = -255,7997, SD = 447,4403

Kesalahan acak = III. C = 20,328 g / ml

x 100 % = -174,92 % = -195,3733, SD = 444,9201

Kesalahan acak =

x 100 % = -227,73 %

Kesalahan Kesalahan C Absorbansi P% Sistematis I 9,240 1,896 -543,6755 5883,93 II III IV 9,240 12,936 12,936 -0,178 1,984 0,031 128,3048 -572,1877 60,5884 1388,58 4423,21 468,37 1288,58 4523,21 -368,37 -228,79 % -174,92 % -174,92 % 5983,93 Acak -228,79 %

20,328

1,792

-509,9793

2508,75

2608,75

-227,73 %

VI

20,328

-0,150

119,2328

586,54

-486,54

-227,73 %

= 280,5nm
Menentukan y = 8,6589 X 10-3x 0,1991 Konsentrasi 9,240 g/ml I. 0,300 = 8,6589 X 10-3x 0,1991 x = 57,6401 II. 0,152 = 8,6589 X 10-3x 0,1991 x = 40,5479

Konsentrasi 12,936 g/ml I. 0,383 = 8,6589 X 10-3x 0,1991 x = 67,2256 II. 0,344 = 8,6589 X 10-3x 0,1991 x = 62,7216

Konsentrasi 20,328 g/ml

I.

0,368 = 8,6589 X 10-3x 0,1991 x = 65,4933

II.

0,201 = 8,6589 X 10-3x 0,1991 x = 46,2068

Menentukan Perolehan Kembali P% Konsentrasi 9,240 g/ml

I.

X 100% = 623,81%

II.

X 100% = 438,83%

Konsentrasi 12,936 g/ml

I.

X 100% = 519,68%

II.

X 100% = 484,86%

Konsentrasi 20,328 g/ml

I.

X 100% = 322,18%

II.

X 100% = 227,31%

Menentukan kesalahan sistematis Konsentrasi 9,240 g/ml I. II. 100 623,81% = -523,81% 100 438,83% = -338,83%

Konsentrasi 12,936 g/ml I. II. 100 519,68% = -419,68% 100 484,86% = -384,86%

Konsentrasi 20,328 g/ml I. II. 100 322,18% = -222,18% 100 227,31% = -127,31%

Menentukan kesalahan acak I. C = 9,240 g / ml = 49,0940 , SD = 12,086

X 100% = 24,62% II. C = 12,936 g / ml = 64,9736, SD = 3,1848

X 100% = 4,90% III. C = 20,328 g / ml = 55,8501, SD = 13,6376

X 100% = 24,42% Kesalahan sistemis(%) Kesalahan acak(%)

C ( g/ml )

Absorbansi

X topi

P%

I 9,240 II I 12,936 II I 20,328 II

0,300 0,152 0,383 0,344 0,368 0,201

57,6401 40,5479 67,2256 62,7216 65,4933 46,2068

623,81 438,83 519,68 484,86 322,18 227,31

-523,81 24,62 -338,83 -419,68 4,90 -384,86 -222,18 24,42 -127,31

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan optimasi metode analisa. Metode yang akan dioptimasi adalah metode penetapan kadar Na.diklofenak. Optimasi metode merupakan langkah pendahuluan yang harus dilakukan dalam serangkaian prosedur penetapan kadar.Langkah ini bertujuan untuk mengetahui kevalidan dari suatu metode penetapan kadar. Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi. Tujuan dilakukannya validasi terhadap metode analisa obat adalah agar setiap data yang diperoleh dari pengujian telah distandarisasi, sehingga dapat langsung digunakan untuk kepentingan dokumentasi data profil suatu obat. Parameter farmakokinetika obat diperoleh berdasarkan hasil pengukuran kadar obat utuh dan atau metabolitnya didalam cairan hayati (darah, urine, saliva atau cairan tubuh lainnya). Apabila suatu metode valid, maka parameter-parameter farmakokinetik yang diperoleh dari metode tersebut dapat dipercaya. Suatu metode dikatakan valid apabila memenuhi berbagai kriteria yaitu sensitivitas, spesifisitas, akurasi, presisi dan praktis. Secara singkat, suatu metode harus dapat menetapkan satu senyawa tertentu yang kita inginkan saja (spesifik); dapat menetapkan senyawa dalam konsentrasi yang kecil (sensitif); hasil pengukurannya mendekati

nilai sesungguhnya (akurat); memberikan hasil yang sama dalam suatu seri pengukuran (reprodusibel); mudah pengerjaannya, dan tidak membutuhkan waktu yang lama serta biaya yang banyak (praktis). Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis(Ibnu Gholib G., 2008).

Na Diklofenak berkhasiat sebagai analgetik dan antiinflamasi, dipilih Na Diklofenak karena kelarutannya yang mudah dalam air sehingga tidak membutuhkan waktu proses yang lama saat preparasi serta mengurangi kemungkinan adanya gangguan dalam proses pengukuran akibat aktivitas pelarut yang digunakan. Pada prosedur penetapan Na Diklofenak ini digunakan plasma darah. Plasma darah diperoleh dengan mengambil sampel darah dan ditampung dalam ependroff yang telah diberi heparin. Heparin merupakan antikoagulan dan berfungsi untuk mencegah terjadinya penggumpalan pada sampel darah yang telah ditampung. Darah yang telah diberi heparin dimasukkan dalam tabung sentrifuge, lalu ditambah larutan TCA. Penambahan larutan TCA dimaksudkan untuk mengendapkan seluruh protein darah. TCA akan mengikat protein darah seperti albumin dan globulin membentuk kompleks yang tidak larut. Campuran tersebut divortex agar darah dapat bercampur dengan TCA dan memberikan kesempatan pada TCA untuk bereaksi dengan protein darah. Campuran kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Hal ini dimaksudkan untuk mengendapkan kompleks TCA-protein yang terbentuk. Pengendapan merupakan langkah awal yang penting sebelum dilakukan sentrifugasi. Pengendapan dapat meningkatkan pemisahan. Apabila terjadi penggabungan partikel (koalesen), maka densitas partikel tersebut akan meningkat dan memudahkan pemisahannya (John H.Perry, 1950). Prinsip sentrifugasi ini adalah adanya gaya sentrifugal yaitu gaya ke arah luar lingkaran dengan memutar suatu campuran senyawa secara melingkar pada kecepatan yang tinggi. Pada

campuran senyawa dengan kerapatan yang berbeda, senyawa dengan kerapatan yang lebih tinggi akan turun ke dasar tabung dan campuran senyawa dapat terpisah dengan sempurna. Hasil akhir yang tersisa dibagian atas atau yang dikenal dengan supernatan hanyalah ikatan obat dengan plasma. Supernatan yang diperoleh dari hasil proses sentrifus dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan dengan aquadest 5 ml untuk menambah masa campuran agar mudah saat pengukuran dengan spektrofotometer. Langkah pertama pada optimasi metode analisis adalah mencari panjang gelombang maksimum, tujuannya adalah menentukan pada panjang gelombang berapa nanometer senyawa Na Diklofenak menyerap energi yang dipancarkan yang bersifat sebanding dengan konsentrasinya, yaitu apabila konsentrasi meningkat maka absorbansi atau banyaknya energi yang diserap juga semakin banyak. Hasil screening yang diperoleh, Na Diklofenak memberikan serapan maksimal pada panjang gelombang 280,5nm. Langkah selanjutnya yakni penetapan operating time. Operating time adalah waktu yang memberikan rentang serapan yang stabil dari senyawa yang diukur. Namun pada percobaan kali ini kami tidak melakukan prosedur tersebut karena factor keterbatasan waktu. Berikutnya adalah pembuatan kurva baku. Sejumlah deret baku Na Diklofenak yang telah dipersiapkan, direaksikan sesuai dengan prosedur dan diukur serapannya sesuai dengan max yang telah ditetapkan pada 230,5 nm dan 280,5nm. Dari data yang diperoleh kemudian dibuat kurva hubungan antara konsentrasi (C) dan absorbansi (A) dan dihitung persamaan regresi liniernya. Persamaan regresi linier yang diperoleh adalah Y =-3,0864 X+0,2180 dengan nilai r

= -0,0659 pada 230,5nm dan Y = 8,6589X -0,1991 dengan nilai r = 0,3997. Persamaan ini selanjutnya digunakan untuk menentukan konsentrasi dari data absorbansi yang diperoleh. Langkah akhir dalam optimasi metode adalah penentuan recovery, kesalahan acak dan kesalahan sistemik. Persyaratan paling mendasar untuk suatu analisis adalah bahwa analisis tersebut harus akurat dan tepat. Serangkaian pengukuran (y) pada sampel yang sama diperkirakan, meskipun tidak dapat dibuktikan, akan terdistribusi secara normal di sekitar suatu rerata (), yaituhasil-hasil pengukuran tersebut(David Watson, 2007). Recovery atau nilai perolehan kembali merupakan tolok ukur dari efisiensi analisis. Recovery diperoleh dengan

membandingkan nilai pengukuran dengan nilai yang sesungguhnya dalam persen. Apabila nilai pengukuran yang diperoleh hamper mendekati nilai yang sesungguhnya, maka metode tersebut dapat dikatakan akurat. Sedangkan kesalahan acak merupakan tolok ukur ketidaktepatan suatu metode dan kesalahan sistematik merupakan tolok ukur seberapa besar kemungkinan suatu metode tidak akurat (inakurasi metode). Persyaratan yang dituntut dari suatu metode analisis adalah jika metode tersebut dapat memberikan nilai perolehan kembali yang tinggi,yakni 75-90% atau lebih serta kesalahan acak dan kesalahan sistemik kurang dari 10%. Berdasarkan hasil yang diperoleh, metode penetapan kadar Na Diklofenak ini memiliki nilai perolehan kembali yang rendah, yakni -5883,93 % (<75%) dan 586,54 % (>75%), ini berarti bahwa nilai pengukuran yang diperoleh dari metode tersebut sangat jauh berbeda dengan nilai yang sesungguhnya. Hal tersebut didukung dengan kesalahan sistemik yang tinggi yaitu 228,79 %(<10%, tetapi minus) dan nilai kesalahan acak 24,62% (<10%). Data tersebut menunjukkan bahwa metode penetapan yang digunakan tidak tepat dan memiliki kemungkinan inakurasi yang sangat tinggi. Jika dibandingkan dengan persyaratan yang dituntut, metode penetapan Na Diklofenak ini tidak valid. Hal ini sangat bertolak belakang dengan teori yang ada. Berdasarkan teori, metode penetapan kadar obat dalam darah ini valid. Metode ini telah digunakan selama bertahun-tahun dengan hasil yang akurat. Ini dapat disebabkan karena beberapa faktor, di antaranya adalah kesalahan saat penambahan jumlah reagen maupun saat mereaksikannya. Ketidaktepatan tahapan penambahan reagen; dan keadaan yang tidak memadai seperti parasetamol yang harus didinginkan sebelum pengukuran untuk menghilangkan panas. Apabila hal-hal tersebut terjadi, maka akan berpengaruh pada nilai absorbansi dan hasil yang diperoleh menjadi tidak akurat. I. KESIMPULAN

1. Panjang gelombang maksimum natrium diklofenak yang dihasilkan 280,5 nm. 2. Pada kurva baku natrium diklofenak didapat persamaan y = -3,0864 . 10-3 x + 0,2180 3. Recovery natrium diklofenak tidak memenuhi persyaratan. 4. Hasil kesalahan sistemik natrium diklofenak memenuhi persyaratan. Hasil kesalahan acak natrium diklofenak tidak memenuhi persyaratan.

DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2010. farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : Departemen kesehatan Republik Indonesia Gandjar,Ibnu Gholib. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar Mutschler, Ernest. 1991. Dinamika Obat. Bandung : ITB Shargel, Leon, dan andrew B.C.YU. 1988. Biofarmasetika Dan Farmakokinetika Terapan. Surabaya : Airlangga University Press Tan Hoan Tjay, dan Raharja Kirana. 2007. Obat-Obat penting. Jakarta : Gramedia