LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

UREASE
Disusun oleh : Zyahra Islami Syovhia 10510043 Assisten Tanggal Percobaan Tanggal pengumpulan : Awalia 10509025 : 21 Maret 2013 : 27 Maret 2013

LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2013

PERCOBAAN 6 UREASE

Tujuan Menentukan kadar urea di dalam urin secara enzimatik dengan enzim urease menggunakan alat Conway

Teori Dasar Enzim urease termasuk dalam kategori enzim hidrolase yang merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis urea menjadi amonium karbonat. Enzim ini memiliki titik isoelektrik pada pH 5,0 serta memiliki senyawa inorganik Ni2+ yang berfungsi sebagai kofaktor (Lehninger). Urease disebut juga urea amidohidrolases. Urease merupakan enzim yang mengkatalis hidrolisis urea menjadi karbon dioksida dan ammonia. Urease adalah sebuah protein yang ditemukan dalam bakteri, kacang, dan beberapa tanaman tingkat tinggi. Karakteristiknya yaitu pH optimum 7,4 suhu optimum 64C dengan spesifikasi enzimatis : urea dan hidroksi urea. Beberapa tanaman memanfaatkan urease untuk keperluan yang sama. Urease ditemukan dalam jumlah yang besar pada jack bean, kacang kedelai dan beberapa biji tanaman lainnya. Urease juga terdapat pada beberapa jaringan binatang dan pencernaan mikroorganisme. Urease penting dalam sejarah enzimologi sebagai enzim pertama yang dimurnikan dan dikristalakan (Sumner, 1926).

Penentuan kadar urea di dalam urinatau cairan lainnya dapat dilakukan secara enzimatik dengan enzim urease menggunakan alat Conway. Penambahan alkali pada amonium karbonat yang dihasilkan, akan membentuk amonia bebas yang berdifusi ke dalam cawan-cawan yang berisi larutan asam borat, sehingga terikat menjadi amonium tetraborat. Kemudian senyawa tersebut dititrasi dengan asam sulfat atau asam klorida menggunakan indikator Tashiro hingga pada akhirnya kadar urea dapat ditentukan. Reaksi yang terjadi secara keseluruhan ialah sebagai berikut: CO(NH2)2 + 2H2O (NH4)2CO3 2NH4+ (NH4)2CO3 + CO3-

2NH4+ + 2OH- 2NH4OH 2NH4OH 2NH3 + 2H2O 2NH3 + 2H3BO3 2NH4+ + 2H2BO32NH4+ + 2H2BO3- + 2H+ 2NH4+ + 2H3BO3

Pengamatan

Gambar1. Sebelum Titrasi

Gambar2. Conway 1 setelah titrasi

Gambar3. Conway 2 setelah titrasi

Gambar4. Conway 3 (kiri) dan 4 (kanan) setelah titrasi Volume Titrasi 2.85 ml 0.47 ml 2.4 ml 0.16 ml

Alat Conway I (urin + K2CO3) II (akua dm + K2CO3) III (urin + urease + K2CO3) IV (akua dm + urease + K2CO3)

Perubahan Warna Biru Violet Biru Violet Biru Violet Biru Violet

Perhitungan dan Pengolahan Data (1) (2) ( ) ( )

Pembahasan Pada percobaan kali ini kadar urea dalam urin ditentukan berdasarkan metode titrasi menggunakan alat Conway dengan bantuan enzim urease dari kacang kedelai yang mengkatalisis hidrolisis urea menjadi amonium karbonat. Enzim urease ini terdiri dari empat domain struktural dengan logam Ni2+ sebagai kofaktor. Enzim ini tidak terdapat di dalam tubuh manusia sehingga di dalam tubuh, urea tidak dihidrolisis oleh enzim urease menjadi amonium karbonat, melainkan langsung dieksresikan oleh ginjal dan keluar bersama urin atau feses sehingga hasil sisa metabolisme tersebut mengandung urea. Urea adalah senyawa organik yang tersusun dari unsur karbon, hidrogen, oksigen dan nitrogen dengan rumus CON2H4 atau (NH2)2CO. Di dalam tubuh, urea disintesis melalui siklus urea yang berlangsung di dalam mitokondria dan sitosol. Atom nitrogen yang ditransfer menjadi -ketoglutarat pada reaksi transaminase dikonversikan menjadi ion amonium bebas dengan deaminasi oksidatif. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim glutamat dehidrogenase. Proses yang terjadi secra umum ialah dehidrogenasi ikatan C-N kemudian diikuti oleh proses hidrolisis menghasilkan basa Schiff sebagai senyawa intermediet dalam pembentukan ketoglutarat dan pelepasan ion amonium bebas. Ion amonium bebas dapat digunakan kembali dalam proses biosintesis senyawa nitrogen, namun jika dalam jumah yang berlebihan, akan dikonversi menjadi urea.

Gambar1. Proses pelepasan ion amonia bebas melalui senyawa intermedet Schiff-base Siklus urea dimulai dari coupling NH3 dengan HCO3- membentuk carbamoyl posfat yang merupakan senyawa dengan potensial yang tinggi. Gugus carbamoyl ini berlangsung di mitokondria kemudian ditransfer ke ornitin membentuk sitrulin. Sitrulin yang terbentuk dibawa ke sitoplasma dan berkondensasi dengan aspartat membentuk argininosuksinat yang akan mengalami cleavage membentuk fumarat dan arginin. Arginin yang dihasilkan mengalami hidrolisis membentuk urea dan ornithin. Ornithin yang dihsilkan akan ditranspor balik menuju mitokondria untuk proses ulang siklus.

Gambar2. Siklus urea di dalam tubuh

Dalam percobaan, urin yang akan ditentukan kadar ureanya dilakukan dengan empat alat conway. Pada keempat sisi dalam alat conway (sisi A) berisi larutan yang sama, yakni asam borat dan indikator Tashiro. Sementara pada sisi B, Conway pertama berisi urin; kedua berisi akuades; ketiga berisi urin dan urease; dan conway keempat berisi akuades dan urease. Kedalam keempat larutan pada sisi B (lingkaran luar) alat conway tersebut direaksikan dengan K2CO3 sebagai sumber ion OH- . Kalium karbonat akan terurai menjadi ion K+ dan CO3-. Selanjutnya ion kalium akan bereaksi dengan H2O membentuk KOH sebagai sumber ion hidroksida. Urease yang digunakan dalam proses katalisis, dicampurkan terlebih dahulu dengan EDTA dan buffer posfat sebelum direaksikan dengan substratnya (urea). Penambahan EDTA dilakukan sebagai pembentuk kelat agar logam nikel pada sisi aktif enzim tidak bereaksi dengan ligan. Sementara buffer posfat digunakan agar enzim dapat bekerja pada pH yang optimum sebab salah satu parameter yang mempengaruhi kinerja enzim ialah pH. Dalam proses reaksi senyawa-senyawa diatas, alat Conway yang digunakan harus tertutup rapat agar tidak ada gas amonia yang bocor. Salah satu cara untuk mensiasatinya ialah dengan mengoleskan gliserin yang telah dicampur NaOH dan indikator penoftalein pada bagian penutup Conway. Gas amonia bersifat basa namun tidak begitu kuat sehingga perlu ditambah NaOH agar sifat kebasaan menjadi lebih kuat dan apabila terjadi kebocoran, dapat dideteksi dengan munculnya perubahan warna menjadi pink akibat adanya indikator penoftalein yang bekerja pada rentang pH 8-9. Maka dengan penambahan NaOH dan PP, jika terdapat sedikit saja gas amonia yang bocor, dapat merubah warna sehingga kebocoran dapat segera diketahui. Setelah ditutup rapat, semua alat Conway dimasukkan ke dalam inkubator suhu 37C sebagai suhu optimum bagi enzim untuk bereaksi. Urea yang terdapat dalam urin akan diubah menjadi amonium karbonat. Dengan adanya basa alkali, ion amonium akan dibebaskan kemudian berdifusi ke dalam dinding cawan dan bereaksi dengan asam borat membentuk amonium tetraborat yang berwarna biru. Jumah asam borat yang berubah menjadi amonium tetraborat menujukkan banyaknya amonium yang bereaksi. Sehingga untuk mengetahui jumlahnya, diakukan titrasi dengan HCl terhadap amonium tetraborat tersebut hingga tercapai titik ekivalen yang ditandai dengan perubahan warna dari biru menjadi violet. Volume HCl yang digunakan ekivalen dengan jumlah amonium yang terbentuk sehingga kadar urea dapat ditentukan pula dengan perhitungan. Pada percobaan ini dilakukan dengan empat alat Conway sehingga titrasi yang dilakukan sebanyak empat kali pula. Selisih volume HCl yang digunakan pada Conway 1 dan 2 menentukan jumlah awal amonia yang terdapat dalam urin, sementara selisih conway 3 dan 4 menunjukkan banyaknya urea yang duibah menjadi amonia setelah kerja urease. Selisih (1,2) dan (3,4) menunjukkan banyaknya urea dalam urin yang diubah menjadi amonia. Dari keseluruhan hasil perhitungan, didapat kadar urea dalam urin sebesar 0.105 g/L . Angka ini masih dibawah batas normal sebesar 9.3 g/L. Urin merupakan sisa hasil metabolit yang dieksresikan tubuh dimana zat-zat yang terkandung didalamnya dianggap sudah tidak berguna lagi bagi tubuh. Protein dalam jumlah yang berlebihan dikeluarkan tubuh dalam bentuk urea melalui siklus urea. Jika urin mengandung urea dalam jumlah yang berlebihan (diatas kadar normal), mengindikasikan adanya kerusakan kinerja hati dan ginjal. Kesimpulan Kadar urin dalam tubuh sebesar 0.105 g/L Daftar Pustaka Stryer, Lubert. 2010. Biochemistry. 6th edition. W.H Freeman and Company. New York. Hal 560 Lehninger, A.L. 2008. Principles of Biochemistry. 5th edition. Worth Publisher, Inc. New York. Hal 661