Ekstraksi

Fraksinasi Flavonoid

Penapisan Flavonoid
Simplisia 1 gram
++100 mL air panas

Dididihkan selama 5 menit

Disaring

Filtrat

Lanjutan...
Filtrat C
++ Serbuk Mg
++ HCl pekat 1 mL

Filtrat C (5 mL)
++ Amil alkohol
Kocok kuat

Lapisan amil alkohol

Terbentuk warna

+ Flavonoid

Hasil

Amil
alkohol

Amil
alkohol

Pegagan

Binahong
Air

Air

Ekstraksi Fraksinasi Flavonoid

Harbone, J.B. (1996) : Metoda Fitokimia, terjemahan K.

Padmawinata dan I. Soediro, Penerbit ITB, Bandung
Markham, K. R. (1988) : Cara Mengidentifikasi
Flavonoid, terjemahan K. Padmawinata, Penerbit ITB,
Bandung.
Sirait, Midian. (2007) : Penuntun Fitokimia Dalam
Farmasi, Penerbit ITB, Bandung.
Mabry, Flavonoid

Penetapan Kadar Flavonoid ??

Pemisahan Flavonoid

Kromatografi kolom

Kromatografi lapis tipis (KLT)

Kromatografi kertas (Kkt)

Kromatografi Kolom
Adsorben
Silika gel
Isoflavon
Flavanon
Dihidroflavonol
Flavon Yang mengalami metilasi dan asetilasi
Flavonol Yang mengalami metilasi dan asetilasi
O dan C-glikosida dari isoflavon

Kromatografi kolom

Eluen

Nheksan EtOAc (6:1)

Nheksan-CHCl3 (1:1)
CHCl3-MeOH (20:0,8)
EtOAc-MeOH (19:1)

Kromatografi Kolom
Selulosa

untuk semua kelas flavonoid

untuk Glikosida

Eluen
EtOAc-MeOH-Air
Asam asetat 2%
Asam asetat 5%
BAW (4:1:5)

Cara membuat BAW ???

KLT

Adsorben = Kromatografi kolom

Eluen = kromatografi kolom

CHCl3-MeOH (15:1)
Nheksan-ETOAc (3:1)
CHCl3-ETOAc (1:1)

Deteksi di Bawah Sinar lampu UV

Sinar lampu UV 366 nm

Sinar lampu UV 254 nm
Spot berwarna gelap (Fase diam silika)

Diuapi iodin
muncul sebagai bercak kuning coklat

AlCl3 (Metanol)

Kromatografi kertas

Eluen
asam asetat 2-60%
BAW (4:1:5)
Forestal (asam asetat-HCl-Air) 10:3:10
T-Butanol- Asam asetat-Air (3:1:1)

Penampak Bercak

FeCl 5% (MeOH)
Sinar lampu UV 366 nm
AlCl3 (MeOH)

Pereaksi semprot

AlCl3
Kompleks difenil-asam borat-etanolamin
(Naturstoffreagenz A)
Asam sulfanilat yang terdiazotasi
Vanilin HCl
Sitroborat

AlCl3

AlCl3 5% dalam Metanol

Pada kromatogram
Disemprotkan
dikeringkan
Menunjukan semua 5-hidroksi-flavonoid
Bercak berfluoresensi kuning
Pengamatan pada sinar UV 366 nm

Pemantauan Flavonoid

2 3

4 5

UV 254 nm

UV 366 nm

AlCl3 5%
UV 366 nm

4 5

Tampak visual

4 5

H2SO4 10%

Fase diam silika gel GF254 pra salut, fase gerak BAW (4:1:5), 1: fraksi etilasetat
(0,1 mg), 2, 3, 4, 5: isolat TO-A (masing-masing 1, 2, 3, 5 g).

4 5

DPPH 0,2%

Kompleks AlCl3

AlCl3 5% Vs Sitroborat
PADA KERTAS WHATMAN NO 3 DENGAN METODE DOT-BLOT TES
1a

1b

2a

2b

3a

3b

4a

4b

5a

5b

6a

6b

7a

7b

8a

8b

9a

9b

10a

10b

11b

12a

11a

13a

13b

14a

16a

16b

17a

14b

17b

No

Senyawa

No

Senyawa

12b

Flavon

10 Asam-o-kumarat

15a

15b

3-OH-Flavon

11 Asam trans-m-kumarat

18a

18b

Luteolin-7-glukosida

12 Asam-p-kumarat

Apigenin-7-glukosida

13 Asam kafeat

kuersitrin

14 Asam ferulat

Tampak Visual

Rutin

15 Asam-o-hidroksi benzoat

-tokoferol

16 umbiliferon

Kuersetin

17 Saponin

10

11

12

Asam askorbat

18 Stigmasterol

13

14

15

16

17

18

+AlCl3 5%

1 (Flavon), 2 (3-OH-Flavon), 8 (Kuersetin)

10

11

12

10

11

12

13

14

15

13

14

15

16

17

18

16

17

18

Sinar UV 254 nm

Sinar UV 366 nm

10

11

12

10

11

12

10

11

12

10

11

12

13

14

15

13

14

15

13

14

15

13

14

15

16

17

18

16

17

18

16

17

18

16

17

18

+AlCl3 pada Sinar UV 254 nm

+AlCl3 pada Sinar UV 366 nm

+Sitroborat
pada Sinar UV 254 nm

+Sitroborat
pada Sinar UV 366 nm

Larutan Penampak Bercak Sitroborat?

Larutkan 5 g asam sitrat P dan 5 g asam borat P dalam

etanol hingga 100 mL

Farmakope Herbal Indonesia, Edisi 1 tahun 2008, hal 183)

Kompleks difenil-asam borat-etanolamin

(Naturstoffreagenz A)

1% dalam MeOH
Pada kromatogram
Disemprotkan
dikeringkan
Menunjukan semua 3-4-dihidroksi-flavon dan
3-4-dihidroksi-flavonol
Bercak jingga (UV atau tampak)
4-hidroksi-flavon dan 4-hidroksi-flavonol
Bercak hijau kuning

Asam sulfanilat yang terdiazotasi

Asam sulfanilat 0,3% dalam HCl 8% (25 ml) dicampur

dengan natrium nitrit 5% (1,5 ml) tepat sebelum
digunakan.
Pada kromatogram
Disemprotkan
natrium karbonat 20%
dikeringkan
Gugus hidroksi fenol terlihat sebagai bercak kuning,
jingga, atau merah

Vanilin HCl

5% dalam EtOH dicampur HCl pekat (4:1) tepat sebelum

digunakan.
Disemprotkan
dipanaskan
Pola oksidasi lingkar-A floroglusinol dan lingkar-C jenuh (
umumnya pada kromatogram tidaktampak jika disinari
UV).
Untuk katekin dan proantosianidin muncul segera,
flavanon dan dihidroflavonol terbentuk lebih lambat.

UV 365 nm
Fase diam Silika gel GF254 pra salut, pengembang etil
asetat-asam format-asam asetat glasial-air (100-11-1127).
Penampak bercak NP/PEG.

1. Quercetin-3-O-gentiobioside
2. Kaempferol-3-O-gentiobioside
3. Quercetin-3-O-rutinoside
4. Vitexin-2-O-rhamnoside
5. Naringin and neohesperidin
6. Chlogenic acid
7. Orientin
8. Vitexin
9. Isorhamnetin-3-O-glucoside
10. Chlorogenic acid,
isochorogenic acid, caffeic acid
11. Isorhamnetin-3-Ogalactoside
12. Quercetin-3-O-rhamnoside
13. Kaempferol-7-O-rhamnoside
14. Caffeic acid and ferulic acid
15. Rutin, chlorogenic acid,
hyperoside.