KULTUR DAN FUSI PROTOPLAS

1. Kultur Jaringan
Kultur jaringan adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan untuk membuat bagian
tanaman (akar, tunas, jaringan tumbuh tanaman) tumbuh menjadi tanaman utuh (sempurna)
dikondisi invitro (didalam gelas). Keuntungan dari kultur jaringan lebih hemat tempat, hemat
waktu, dan tanaman yang diperbanyak dengan kultur jaringan mempunyai sifat sama atau
seragam dengan induknya.
Kultur jaringan (tissue culture) sampai saat ini digunakan sebagai suatu istilah umum yang
meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang umumnya tembus cahaya. Sering
kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang artinya sebenarnya adalah kultur di dalam
gelas. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan
menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat
steril. Penggunaan kultur jaringan untuk pembiakan klonal didasarkan pada anggapan bahwa
jaringan secara genetik tetap stabil jika dipisahkan dari tumbuhan induk dan ditempatkan dalam
kultur. Pendapat ini sebahagian besar berlaku jika tumbuhan dibiakkan dengan kuncup ketiak
atau tunas liar yang secara langsung dipisahkan dari tanaman. Walaupun demikian, apabila tunas
terbentuk dari jaringan kalus, sering terjadi penyimpangan.
Dalam pelaksanaannya dijumpai beberapa tipe-tipe kultur, yakni: kultur biji (seed culture),
kultur organ (organ culture), kultur kalus (callus culture), kultur suspense sel (suspension
culture), kultur protoplasma dan kultur haploid. Sel tanaman pada umumnya dilindungi
oleh dinding sel dari selulosa yang keras untuk menopang struktur tanaman. Sel tanaman yang
telah kehilangan dinding selnya disebut dengan istilah protoplas. Protoplas dapat diisolasi dari
berbagai macam jaringan ataupun organ tanaman seperti daun, tunas,akar, dan buah. Pada kultur
protoplasma, eksplan yang digunakan adalah sel yang telah dilepas bagian dinding selnya
menggunakan bantuan enzim. Protoplas diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah
diri dan membentuk dinding selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan
hibridisasi somatik atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).
2. Kultur Protoplas
Kultur protoplasma dapat digunakan untuk berbagai macam tujuan seperti perbanyakan
dan untuk memperolehvarietas baru. Teknik yang digunakan untuk memperoleh hibrida ini
antara lain perlakuan protoplasma dengan mutagen dan manipulasi genetik ditingkat sel melalui
fusi (penggabungan) dua protoplasma dari varietas atau spesies yang berbeda serta penggunaan
protoplasma dalam rekayasa genetika ditingkat molekuler dengan teknik elektroporasi, mikro
injeksi atau partikel bombardment.

3. Mekanisme Kultur Protoplas

Kultur ptotoplasma dilakukan melalui secara bertahap mulai dari persiapan eksplan dan
isolasi protoplasma diikuti dengan penanaman. Mutasi protoplasma dapat dilakukan dengan
menambahkan senaywa mutagen ke dalam media tanam atau dengan memperlakukan
protoplasma dengan senyawa mutagen tersebut. Silangan somatik dilakukan dengan cara
penggabungan dua buah protoplama segera setelah isolasi kemudian ditumbuhkan. Prosedur
kultur protoplasma secaraa umum adalah sebagai berikut:
1) Persipan eksplan.
Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam, umumnya
jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda,
seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet), pucuk adventif hasil pangkasan.
Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah diisolasi protoplasmanya karena dinding
selnya masih sederhana dan hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih
memiliki sel-sel parenchyma (dindingnya belum berlignin). Selain itu, ada juga yang
menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi protoplasma dari
jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel
primer dan dinding sel sekunder.
2. Sterilsasi eksplan.
Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci kemudian
disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 2 % selama 10 30 menit
tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air
steril (3 4 kali) untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan.
3. Isolasi Protoplasma.
Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat mengahancurkan
dinding sel. Enzym yang digunakan bervariasi jenis dan konsentrasinya tergantung kondisi
fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya.
Berikut dikemukanan perbandingan antara dinding sel primer dan sekunder pada sel tumbuhan
Protoplasma yang telah berhasil diisolasi berasal dari organ-organ seperti: daun, tangkai
daun, pucuk, akar, buah, koleoptil, embrio dan mikrospora. Diantara organ tersebut sel yang
paling mudah dan bagus untuk diisolasi protoplasmanya adalah berasal dari jaringan mesofil
daun, karena: Bentuk selnya relatif seragam, tidak perlu membunuh tanamannya, dinding sel

mudah terkelupas oleh enzim. Enzym yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel
tumbuhan umumnya ada 3 yaitu: Cellulase untuk menghancurkan sellulose, Hemicellulase untuk
menghancurkan hemisellulose, Pectinase untuk menghancurkan pektin.
4. Fusi Protoplasma
Fusi protoplasma adalah usaha yang dilakukan manusia untuk menggabung protoplasma
(isi sel) dari dua macam sel yang berbeda berasal dari tumbuhan tingkat tinggi secara alami
maupun sengaja. Pada fusi protoplas ini biasanya digunakan sel tubuh (sel somatis). Tujuan fusi
protoplas adalah untuk mendapatkan suatu hibrida somatik atau mengatasi kelemahan dari
hibrida seksual. Terdapat kelemahan dari hibrida seksusal, yaitu:
a) Sukar untuk mendapatkan suatu hibrida antar-spesies dan antar genera. Hibridisasi
somatik dapat mengatasi hal tersebut.
b) Sitoplasma pada perkawinan seksual hanya berasal dari induk betina saja. Dalam
proses pembuahan, gamet jantan hanya membawa inti saja dengan sedikit sitoplasma
sebaliknya pada tetua betina selain inti juga sitoplasma. Untuk mendapat sitoplasma
dari kedua tetua diadakan fusi antara sitoplasma.
Fusi protoplas dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh genom dari spesies
yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang sama (inter-spesies), atau antargenus
dari satu family (inter-genus). Penggunaan fusi protoplas memungkinkan diperolehnya hibridahibrida dengan tingkat heterosigositas yang tinggi walaupun tingkat keberhasilannya sangat
ditentukan oleh genotipenya. Teknologi fusi protoplas juga dapat dilakukan untuk mendapatkan
sifat-sifat tertentu seperti sifat ketahanan terhadap hama dan penyakit serta cekaman abiotik.
Dengan demikian, tanaman hasil fusi dapat berupa tanaman dengan sifat-sifat gabungan dari
kedua tetuanya termasuk sifat-sifat yang tidak diharapkan terutama berasal dari spesies liar.
5. Mekanisme Fusi Protoplas
Mekanisme Fusi protoplasma (bioteknologi modern) untuk menghasilkan produk-produk
yang berkualitas tinggi. Dinding sel tanaman merupakan struktur lapis banyak yang
tersusun dari polisakarida dan protein. Dinding sel berperan penting dalam (1)
memberikan kekuatan regang dan plastisitas sehingga sel dapat mengalami/menghadapi
tekanan turgor yang tinggi tanpa mengalami kerusakan, dan (2) memberikan pembatas fisik
yang melindungi interior sel tanaman dari serangan mikroorganisme. Ukuran pori dinding
sel cukup kecil bahkan untuk dilalui virus sekalipun. Sifat-sifat dinding
sel
tersebut
membatasi penggunaan sel tanaman untuk berbagai teknik kultur sel dan jaringan,
termasuk memasukkan molekul berukuranbesar ke dalam sel, hibridisasi somatic dan
manipulasi genetik. Oleh karena itu, teknik-teknik tersebut hanya dapat dilakukan setelah
dinding sel dihilangkan. Penghilangan dinding sel menghasilkan protoplas yang terdiri dari
kandungan sel yang dibatasi oleh membran plasma. Dibawah kondisi kultur yang sesuai

protoplas dapat meregenerasi dinding sel dan selanjutnya mengalami pembelahan sel untuk
membentuk kalus dan menghasilkan tanaman baru.Penghilangan dinding sel untuk isolasi
protoplas dapat dilakukan secara mekanik atau penggunaan enzim pencerna dinding sel.
Protoplas yang telah diisolasi dari spesies yang sama atau berbeda dapat difusikan dengan
perlakuan yang sesuai sehingga terjadi penggabungan inti dan sitoplasma dari keduanya.
Fusi protoplas dapat dilakukan dengan metode kimia dengan menggunakan
polyethylene glycol (PEG) atau elektrik dengan memaparkan protoplas pada aliran listrik
lemah. Setelah metode fusi dilakukan akan diperoleh campuran hasil fusi yang terdiri dari
protoplas tetua yang tidak mengalami fusi, hasil fusi dari tetua yang sama, atau berbeda dimana
diinginkan diperoleh heterokarion (sel dengan lebih dari satu inti). Selanjutnya perlu
dilakukan konfirmasi terhadap tanaman heterokarion dengan cara analisis morfologi
yang menunjukkan karakter tetua, analsis sitologi yang menunjukkan apakah terjadi
penghilangan kromosom selama hibridisasi serta analisis biokimia yang melibatkan
pembandingan pola pita protein/enzim antara tanaman tetua dan hibrid atau analisis genom.
Pada awalnya hibridisasi sel dipandang sebagai cara membawa dua genotype berbeda
secara bersama-sama dimana hal ini tidak dapat terjadi melalui hibridisasi
konvensional (proses penyerbukan). Dengan metode ini persilangan antar species dengan
hubungan kekerabatan yang cukup jauh menjadi mungkin terjadi. Salah satu contoh fusi
protoplas yang berhasil adalah fusi antara kentang domestik Solanum tuberosum dengan
kentang liar S. brevidens yang bertujuan untuk mengintroduksi karakter tahan virus yang
dimiliki species ketang liar ke species kentang domestic.
Beberapa permasalahan pada fusi protoplas adalah tidak dimungkinkannya
mendapatkan heterokarion yang stabil dari species-species tanaman dengan hubungan
kekerabatan yang jauh, adanya materi genetic yang tidak diinginkan pada tanaman
heterokarion yang yang harus dihilangkan dengan metode tradisional yaitu pengulangan
backcross dan seleksi. Untuk mengatasi hal ini, transfer spesifik gen dengan materi genetic
yang sudah terseleksi telah banyak dilakukan. Dalam hal ini protoplas tanaman menunjang
kesiapan pengambilan materi genetik yang akan disisipkan ke dalam protoplas/sel lain.