PEMBUATAN MEDIA

KULTUR JARINGAN

EKO HARY PUDJIWATI

PREPARASI MEDIA
Persiapan alat, alat harus sudah dalam kondisi steril
Persiapan bahan, sesuai dengan formula media yang
akan dibuat.
Pembuatan larutan stok, untuk menghindari
kesalahan penimbangan (khususnya unsur mikro) dan
menghemat waktu.
Larutan stok adalah larutan berisi satu atau lebih
komponen media yang konsentrasinya lebih tinggi
daripada konsentrasi komponen tersebut dalam
formulasi media yang akan dibuat.
Larutan stok tunggal dan larutan stok campuran.

 Larutan stok yang perlu dibuat adalah :

stok hara makro (boleh dibuat boleh tidak), berupa stok
tunggal atau stok campuran)
stok hara mikro (harus dibuat, berupa stok campuran)
stok Fe (peka terhadap cahaya, botol penyimpan berwarna
gelap atau ditutup Al foil)
stok vitamin (dibuat sebagai stok campuran bila vitamin
bukan merupakan perlakuan)
stok zpt (berupa stok tunggal, biasanya zat pengatur tumbuh
merupakan perlakuan dalam media). Zat pengatur tumbuh
yang bereaksi asam seperti auksin dan gibberelin dibantu
pelarutannya dengan penambahan larutan NaOH (basa)
atau dengan bahan pelarut alkohol 40% atau dengan
pemanasan. Sedangkan zat pengatur tumbuh yang bereaksi
basa seperti sitokinin dibantu pelarutannya dengan
penambahan HCl 1 N atau dengan pemanasan.

Hal-hal penting lainnya yang harus

diperhatikan dalam pembuatan larutan stok
adalah :
penyimpanan yang tepat agar tidak terjadi
kerusakan
lamanya penyimpanan, karena masa simpan
setiap larutan stok berbeda.
pelabelan agar tidak terjadi kekeliruan
sterilitas
kehati-hatian untuk mendapatkan konsentrasi
yang tepat.

CARA PEMBUATAN LARUTAN STOK

Larutan Stok Makro dan Mikro
- larutan stok hara makro, perlu dipisahkan dari unsur Ca
karena bila dijadikan satu maka akan terjadi pengendapan.
Contoh:larutan stok hara makro media MS dengan kepekatan
100 x dalam 2 liter
Larutan A:
NH4NO3

MS
1650

165 g

KH2PO4
17 g
KNO3
190 g
MgSO4 4H2O 2230 mg
KI
83 mg
ZnSO4 7H2O
860 mg
H3BO3
620 mg
CoCl2 6H2O
2,5 mg
CuSO4 5H2O
2,5 mg
Na2MoO4 2H2O 25 mg

Dalam
2 liter

mg/l

170
1900
370
0,83
8,6
6,2
0,025
0,025
0,25

Larutan B :
CaCl2 2H2O

44 g

Larutan C :
MnSO4 4H2O
2,23 g
Larutan D :
Na2EDTA 2 H2O (Titriplex III)3,73 g
FeSO4 7H2O
2,78 g
Larutan Stok Vitamin
Larutan E :
Myo inositol
Pyridoxine HCL
Glycine
Nicotinic Acid
Thiamine HCL

( dalam 1 liter )

( dalam 1 liter )
( dalam 1 liter,
panaskan 30
menit )

MS
440
MS
22,3
MS
37,3
27,8

mg/l

mg/l
mg/l
mg/l

MS
20 g
100 mg
400 mg
100 mg
20 mg

dalam 1 liter

100
0,5
2
0,5

mg/l
mg/l
mg/l
mg/l

0,1 mg/l

 Larutan stok ZPT

-Larutan stok zpt biasanya dibuat dengan kepekatan
antara 1 10 mg / ml.
Contoh : membuat larutan stok Auksin (IAA, NAA dll)
dengan kepekatan 1 mg / ml (1000 ppm) dalam volume
100 ml
Cara membuat:
-timbang bahan 100 mg
-teteskan sedikit demi sedikit NaOH 1 N sambil dikocok
hingga zpt larut
-tambahkan aquades kedalam labu ukr sampai
volumenya 100 ml
-pindahkan ke dalam botol, tutup dengan alumunium foil,
beri label dan simpan dalam lemari es
-Bila media yang akan dibuat volumenya 1 liter dan zpt
yang dibutuhkan 1mg/l (1 ppm), maka larutan stok yang
diambil hanya 1 ml.

PEMBUATAN MEDIA

Mencampur bahan-bahan sesuai dengan resep media

yang akan dibuat dengan cara mengambil dari larutan
stok. Cara menghitung kebutuhan larutan stok untuk
satu liter media menggunakan rumus :
M1
=
M2
V1
V2
dimana M1 = berat bahan dalam larutan stok
V1 = volume larutan stok yang dibuat
M2 = berat bahan dalam 1 liter media
sesuai resep media
V2 = volume larutan stok yang harus diambil

Setelah semua larutan stok dimasukkan dalam labu

takar, ditambahkan gula yang sebelumnya dilarutkan
dan disaring.
Penepatan Ph media, dengan menggunakan NaOH
atau HCl. pH media dibuat 5,6 5,8.
Ditambah aquades sampai volume yang diinginkan.
Penambahan agar dan dipanaskan sampai larut, bila
media yang dibuat berupa media padat.
Memasukkan media pada wadah tertentu dan ditutup
dengan alumunium foil atau plastik.
Sterilisasi dengan autoklaf, pada suhu 121-127C,
tekanan 15-20 psi, selama 20 30 menit.
Setelah dingin, media disimpan dalam ruangan ber AC
(suhu 24 26 0C) selama 2 hari sebelum digunakan.
Penyimpanan ini bertujuan untuk melihat kesterilan
media, yang ditandai dengan tidak terjadinya
kontaminasi pada media tersebut.

Perhitungan Kimia
Satuan Bobot
1 kg = 1.000 g
1g
= 1.000 mg
1mg = 1.000 g (mikrogram)
1 g = 10 -6 g
Satuan Volume
1 l
= 1.000 ml
1 ml = 1.000 l (mikroliter)
Kesetaraan
1 kg 1 l
1 g 1 ml
1 mg 10 -3 ml

 Konsentrasi
Konsentrasi adalah jumlah zat (solut) per satuan
volume pelarut (solven). Satuan konsentrasi
adalah g/l, mg/l, persen volume atau persen
berat, M (molar), mM (milimolar), dan M
(mikromolar).
Beberapa satuan konsentrasi yang umum
digunakan dalam pembuatan media kultur :
1 ppm atau part per million (bobot/volume) artinya satu
per sejuta, contohnya 1 mg/l
2% (bobot/volume), contohnya 2% sukrosa, artinya
20 g sukrosa per liter air
5% (volume/volume), contohnya 15% air kelapa,
artinya 150 ml air kelapa ditambahkan ke dalam 850 ml
air, sehingga volume akhirnya 1.000 ml.
1 M (mol / liter), contohnya 1 mol gula (C6H12O6) =
180 g, maka 1 M gula artinya 180 g gula per liter air

Contoh Perhitungan
Tersedia larutan stok NaH2PO4 dengan konsentrasi 17 g/l . Buatlah media 2
liter dengan konsentrasi NaH2PO4 170 mg/l. Berapa volume larutan stok
tersebut yang harus diambil?
Jawab
Stok NaH2PO4 yang tersedia adalah 17 g/l = 17.000 mg/l. Media
yang dibuat harus mengandung 170 mg/l NaH2PO4. Karena stok yang
tersedia adalah 100 kali lebih pekat, maka untuk membuat 2 liter media
dibutuhkan larutan stok sebanyak
1/100 x 2 liter = 1/100 x 2.000 ml = 20 ml
Dapat juga dihitung dengan rumus
V1 x C1 = V2 x C2, dimana
V1 = volume media
C1 = konsentrasi NaH2PO4 dalam media
V2 = volume larutan stok yang harus ditambahkan ke dalam media
C2 = konsentrasi NaH2PO4 dalam larutan stok
V1 x C1 = V2 x C2
2.000 ml x 170 mg/l = V2 x 17.000 mg/l
V2 = 2.000 ml x 170 mg/l
17.000 mg/l
= 20 ml.

Bobot molekul BA adalah 225. Berapa BA yang harus ditimbang untuk

membuat 200 ml larutan stok BA dengan konsentrasi 1 mM. Jika media
yang akan dibuat volumenya 2 liter dengan konsentrasi BA 5 M, berapa
ml larutan stok yang harus ditambahkan ke dalam media?
Jawab
1 M BA
= 225 g/l
1 mM BA = 225 mg/l atau 225 mg/1.000 ml
Jika larutan stok yang dibuat hanya sebanyak 200 ml, BA yang ditimbang
sebanyak
200 ml x 225 mg = 45 mg
1.000 ml
Jika hendak membuat 2 liter media dengan konsentrasi BA 5 M, larutan
stok BA (1 mM = 1.000 M) yang harus ditambahkan ke dalam media
adalah
V1 x C1 = V2 x C2
2.000 ml x 5 M
= V2 x 1.000 M
V2 = 2.000 ml x 5 M
1.000 M
= 10 ml
Jadi larutan stok BA 1 mM yang diperlukan untuk membuat 2 liter media
dengan konsentrasi BA 5 M adalah 10 ml.

LINGKUNGAN KULTUR
Selain komposisi media, kondisi lingkungan juga
mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan, yang meliputi pH
media, cahaya, suhu, aerasi dan kelembaban.

pH optimal media berkisar 5,5 5,8. Perubahan pH selama

siklus pertumbuhan sel / kalus tidak boleh kurang dari 5 dan
lebih dari 6, kecuali untuk perlakuan khusus.

Cahaya dibutuhkan untuk mengatur proses morfogenetik

tertentu. Kebutuhan terhadap cahaya dinyatakan dengan
dimensi lama penyinaran, intensitas dan kualitas cahaya.
Secara umum intensitas cahaya yang optimum untuk tahap
inisiasi kultur adalah 0 1.000 lux, tahap multiplikasi sebesar
1.000 10.000 lux, tahap pengakaran sebesar 10.000 30.000
lux dan tahap aklimatisasi sebesar 30.000 lux

 Suhu berpengaruh terhadap kesehatan tanaman yang

dikulturkan. Suhu yang umum digunakan untuk kultur
berbagai jenis tanaman adalah 26 2C. Tetapi ada
juga galur sel yang dapat tumbuh pada suhu 32 33
C.

Aerasi juga diperlukan terutama pada kultur media

cair (kultur suspensi). Untuk menjaga aerasi
digunakan penggojog / shaker 100 150 rpm.

Kelembaban juga menentukan keberhasilan kultur

jaringan terutama pada tahap aklimatisasi.
Kelembaban nisbi didalam botol kultur hampir selalu
100%, karena itu diperlukan pengaturan kelembaban
pada tahap aklimatisasi, agar planlet tidak stres yaitu
pada minggu pertama aklimatisasi kelembaban tetap
tinggi dan menurun secara bertahap pada mingguminggu selanjutnya.

1. Jelaskan mengapa perlu dibuat larutan stok dan apa yang perlu diperhatikan
dalam pembuatan larutan stok?
2. a. Buat larutan stok KNO3 dengan kepekatan 200 X dalam volume 1 l.
KNO3 yang dibutuhkan untuk membuat 1 liter media 1900 mg.
b. Jika media yang akan dibuat volumenya 500 ml, berapa larutan stok
KNO3 yang harus diambil?
3. a. Buatlah larutan stok IBA dengan konsentrasi 5.000 ppm sebanyak
100ml.
b. Jika dalam pembuatan media diperlukan IBA dengan konsentrasi
2,5 mg/L. Berapa IBA yang harus diambil dari larutan stok, jika
volume
media yang akan dibuat 1,5 L?