IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

JALUR ASETAT-MEVALONAT
DENGAN METODE KLT
A. Tujuan
Praktikan dapat mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder jalur asetat-mevalonat
dengan metode kromatografi lapis tipis.
B. Alat dan Bahan
Alat :
Pipa kapiler
Gelas kaca
Cawan petri
Kertas Saring
Lampu UV 254
Kamera
Lempeng Silika F 254
Pensil warna
Kompor listrik
Penggaris

Bahan :
Larutan sampel oregano
Larutan sampel daun mint
Larutan sampel minyak kayu putih
Larutan sampel daun pacing
Larutan pembanding stigmasterol
Campuran larutan pembanding mentol
dan timol
Anisaldehid asam sulfat
Vanilin asam sulfat

C. Cara Kerja
Disiapkan 2 lempeng silika

Ditentukan jarak rambat fase gerak pada lempeng silika dengan pensil

Lempeng silika kecil :

Ditotolkan larutan pembanding
stigmasterol 1 cm dari tepi kiri
lempeng silika dengan pipa kapiler,
dibiarkan mengering

Lempeng silika besar :

Ditotolkan campuran larutan pembanding
mentol dan timol 1 cm dari tepi kiri
lempeng silika dengan pipa kapiler,
dibiarkan mengering

Ditotolkan larutan sampel daun

pacing 1 cm di kanan totolan
larutan pembanding, dibiarkan
mengering

Ditotolkan larutan sampel oregano, larutan

sampel daun mint, dan larutan sampel
minyak kayu putih di kanan totolan
larutan pembanding dengan jarak 1 cm
satu sama lain

Lempeng silika dimasukkan ke

dalam gelas yang telah berisi fase
gerak

Lempeng silika dimasukkan ke dalam

gelas yang telah berisi fase gerak

Ditutup gelas dengan cawan petri, sampel dibiarkan terelusi

Diambil lempeng silika saat fase gerak telah mencapai batas rambat atas

Fase gerak dikeringkan pada suhu ruangan

Dicek bercak elusi di bawah sinar UV 254 nm

Disemprot lempeng silika dengan larutan anisaldehid asam sulfat (lempeng A) dan
vanilin asam sulfat (lempeng B)

Dicek bercak elusi di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm, didokumentasikan

Dihitung Rf bercak hasil elusi

Dipanaskan lempeng hingga tampak bercak hasil elusi

Dilihat bercak di bawah sinar UV 366 nm, didokumentasikan

Dihitung Rf dan HRf bercak hasil elusi

D. Hasil Percobaan
1. Uji Kandungan Mentol, Timol, dan Sineol

Setelah dielusi
Terbentuk bercak kuning kehijauan pada
penotolan larutan sampel oregano (1)

Setelah disemprot vanilin asam sulfat dan

dipanaskan
Terlihat bercak-bercak ungu pada
penotolan larutan pembanding maupun
sampel.

Di bawah lampu UV 254 nm

Terbentuk bercak ungu pudar pada
penotolan campuran larutan timol dan
mentol; bercak ungu kehijauan, hijau
lumut, dan ungu pudar pada sampel
oregano(1); bercak ungu pada sampel daun
mint (2) dan pada sampel minyak kayu
putih (3)

Di bawah lampu UV 366 nm

Terlihat bercak berfluoresensi pada
penotolan larutan sampel daun mint.
Terlihat bercak berfluoresensi pada
penotolan larutan sampel oregano melalui

Di bawah lampu UV 366 nm setelah

disemprot vanilin H2SO4 dan dipanaskan
Pada pengamatan langsung terlihat
fluoresensi pada penotoloan larutan sampel
oregano dan daun mint tetapi tidak dapat
tertangkap kamera.

pengamatan langsung tetapi tidak

tertangkap kamera.

2. Uji Kandungan Steroid

Setelah disemprot dengan anisaldehid

H2SO4 dan dipanaskan
Setelah dielusi

Di bawah lampu UV 254 nm

Terlihat bercak ungu pada penotolan
larutan sampel daun pacing (S)

Terlihat bercak berwarna ungu pada

penotolan larutan pembanding (P). Terlihat
bercak berwarna hijau kecoklatan dan
ungu pada penotolan larutan sampel (S).

Di bawah lampu UV 366 nm setelah

disemprot vanilin H2SO4 dan dipanaskan
Terlihat bercak fluoresensi kuning pucat
pada penotolan larutan pembanding
maupun sampel pada pengamatan langsung
tetapi tidak tertangkap oleh kamera.

Di bawah lampu UV 366 nm

Terlihat bercak fluoresensi pada penotolan
larutan sampel daun pacing.
Harga Rf
Rf = jarak rambat bercak senyawa/jarak rambat fase gerak
Jarak rambat fase gerak ditetapkan sebesar 5 cm
Tabel Rf Uji Timol, Menthol, dan Sineol
sebelum disemprot vanilin asam sulfat
No.
Tampak
UV 254 nm
P
S1
S2
S3
P
S1
S2
S3
P
1
0,64 0,3
0,6
0,2
Tidak tampak bercak
2
0,4
0,8 0,36

UV 366 nm
S1
S2
0,46 0,44
0,6

S3
-

3
4
5

0,5
0,6

0,9

0,46
0,56
0,64

setelah disemprot vanilin asam sulfat

Sinar Tampak
UV 366 nm
S1
S2
S3
P
S1
S2
0,08
0,1
0,1
0,6
0,1
0,3
0,3
0,66
0,6
0,5
0,4
0,76
0,64
0,6
0,7

No.

P
1
0,46
2
0,64
3
4
5
Keterangan:
P : larutan pembanding campuran mentol dan timol
S1 : larutan sampel oregano
S2 : larutan sampel daun mint
S3 : larutan sampel minyak kayu putih

S3
-

Tabel Rf Uji Kandungan Steroid

sebelum disemprot anisaldehid asam sulfat
No.
Sinar Tampak
UV 254 nm
UV 366 nm
P
S
P
S
P
S
1
0,4
0,56
Tidak tampak bercak
2
0,9

No.

Setelah disemprot anisaldehid asam sulfat

Sinar Tampak
UV 366 nm
P
S
P
0,4
0,3
0,4
0,4
0,54
0,6

1
2
3
4
Keterangan :
P
: larutan pembanding stigmasterol
S
: larutan sampel daun pacing

S
0,3
0,4
0,5
0,6

Harga HRf
HRf = Rf x 100
Tabel HRf Uji Timol, Menthol, dan Sineol
sebelum disemprot vanilin asam sulfat
No.
Tampak
UV 254 nm
P
S1
S2
S3
P
S1
S2
S3
P
1
Tidak tampak bercak
64
30
60
20
-

UV 366 nm
S1
S2
46
44

S3
-

2
3
4
5

40
50
60

No.
P
46
64

80
90

36
46
56
64

60

setelah disemprot vanilin asam sulfat

Sinar Tampak
UV 366 nm
S1
S2
S3
P
S1
S2
8
10
10
60
10
30
30
66
60
50
40
76
64
60
70

S3
-

1
2
3
4
5
Keterangan:
P : larutan pembanding campuran mentol dan timol
S1 : larutan sampel oregano
S2 : larutan sampel daun mint
S3 : larutan sampel minyak kayu putih

Tabel HRf Uji Kandungan Steroid

sebelum disemprot anisaldehid asam sulfat
No.
Sinar Tampak
UV 254 nm
UV 366 nm
P
S
P
S
P
S
1
40
56
Tidak tampak bercak
2
90

No.

Setelah disemprot anisaldehid asam sulfat

Sinar Tampak
UV 366 nm
P
S
P
40
30
40
40
54
60

1
2
3
4
Keterangan :
P
: larutan pembanding stigmasterol
S
: larutan sampel daun pacing

S
30
40
50
60

Harga Rx
Rx = jarak rambat senyawa yang dianalisis/jarak rambat senyawa pembanding
Tabel Rx Uji Kandungan Mentol, Timol, dan Sineol
sebelum disemprot vanilin asam sulfat
No.
Tampak
UV 254 nm
P
S1
S2
S3
P
S1
S2
S3
P

UV 366 nm
S1
S2

S3

1
2
3
4
5

0.47
0,63
0,84
0,94

No.
P
1

0,94
0,32
0,
1,41

0,32
0,57
0,72
0,88
1

setelah disemprot vanilin asam sulfat

Sinar Tampak
UV 366 nm
S1
S2
S3
P
S1
S2
0,125
0,22
0,22
Tidak
tampak
bercak
0,47
0,65
1,43
0,78
0,87
1,65
1
1,30
1,52

S3
-

2
3
4
5
Keterangan:
P : larutan pembanding campuran mentol dan timol
S1 : larutan sampel oregano
S2 : larutan sampel daun mint
S3 : larutan sampel minyak kayu putih

Tabel Rx Uji Kandungan Steroid

sebelum disemprot anisaldehid asam sulfat
No.
Sinar Tampak
UV 254 nm
UV 366 nm
P
S
P
S
P
S
Tidak
Tidak
tampak
tampak
bercak
bercak

No.

Setelah disemprot anisaldehid asam sulfat

Sinar Tampak
UV 366 nm
P
S
P
S
0,75
0,75
1
1
1,35
1,25
1,5
1,5

1
2
3
4
Keterangan :
P
: larutan pembanding stigmasterol
S
: larutan sampel daun pacing

E. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan identifikasi senyawa metabolit sekunder dari
jalur biosintesis asetat-mevalonat menggunakan metode kromatogafi lapis tipis (KLT).
Prinsip dari metode KLT yakni migrasi analit secara kapiler di sepanjang fase diam
(umumnya silika gel) oleh fase gerak (biasanya campuran pelarut organik), di mana jarak
migrasi analit akan berhubungan dengan afinitasnya terhadap fase diam dan fase gerak.
Metode KLT banyak digunakan untuk analisis dasar materi farmasetikal, karena selain
murah dan cepat - dalam satu batch kromatografi dapat dilakukan analisis banyak sampel
sekaligus dengan jumlah sampel yang sangat sedikit; metode ini lebih tak berisiko
dibanding kromatogafi gas dan HPLC karena pada KLT semua komponen dapat terlihat
pada plat sementara pada kedua metode lainnya ada beberapa komponen yang tidak dapat
diamati karena tidak terelusi (Watson, 1999). Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan
metode yang cepat dan sederhana untuk analisis kualitatif dengan adanya senyawa
pembanding. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua
senyawa dikatakan identik jika nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang
sama (Gandjar dan Rohman, 2007).
Jalur asetat-mevalonat adalah jalur biosintesis kerangka molekul isoprenoid yang
melibatkan asam asetat dan asam mevalonat (Evans, 1996). Karbohidrat yang telah
diubah menjadi asam piruvat melalui glikolisis selanjutnya diubah menjadi asetil koenzim
A, menjadi asetil-asetil koenzim A, dan menjadi asam mevalonat kemudian diubah
menjadi isopentenil difosfat (Kar, 2007) untuk selanjutnya menjadi senyawa-senyawa
dengan kerangka mirip isopren (Evans, 1996).

Senyawa-senyawa mirip isopren tersebut disebut isoprenoid, di antaranya adalah

monoterpen, triterpen, seskuiterpen, dan skualen yang nantinya menjadi steroid.

(Evans, 1996)
Dalam praktikum kali ini, dilakukan identifikasi senyawa metabolit sekunder
terhadap empat simplisia, yakni herba oregano, daun mint, minyak kayu putih, dan
rimpang pacing.
Oregano atau Origani Herba merupakan simplisia kering dari daun dan bunga
Origanum onites L. atau Origanum vulgare L.subsp. hirtum (Link) Ietsw. Mengandung
sedikitnya 25 ml/kg minyak atsiri dan sedikitnya 1,5% carvacrol dan thymol (C10H 14O;
Mr150,2) terhadap zat anhidrat (Anonim, 2005). Menurut penelitian, tumbuhan
Origanum vulgare mengandung total konstituen polifenol yang hampir sama dengan
Thymus vulgaris (Modnicki dan Balcerek, 2009). Oregano telah digunakan secara empiris
untuk mengobat penyakit pencernaan, kejang, batuk konvulsif (Vazirian, dkk., 2015).

(Kar, 2007)
Daun mint atau Folium Mentha Piperitae merupakan daun kering dari Mentha
piperita (L.) Huds., famili Lamiaceae. Baunya khas dan menusuk. Dalam beberapa
farmakope dan pengobatan tradisional, daun mint digunakan sebagai obat untuk
dyspepsia, flatulence dan intestinal colic. Konstituen utama dari daun mint adalah minyak
atsiri (0.5-4%) yang mengandung Mentol (30-55%) dan Menton (14-32%). Mentol
terdapat dalam bentuk alkohol bebas. Monoterpen lainnya yakni isomenton (2-10%), 1,8sineol (6-14%), -pinen (1.0-1.5%), -pinen (1-2%), limonen (1-5%), neomentol (2.53.5%) and mentofuran (1-9%) (Anonim, 2010).

Menthol
(Anonim, 2010)
Minyak kayuputih merupakan minyak atsiri yang diperoleh dari daun Melaleuca
leucadendron dari famili Myrtaceae. Minyak ini berbau harum dan kuat mirip camphor,
rasa aromatik; berkhasiat sebagai stimulan dan antispasmodik (Anonim, 1830).
Konstituen utama (sekitar 80%) dari minyak ini adalah Sineol (1,8-epoksi-p-mentana),
nama lainnya yakni Eucalyptol atau Cajeputol. Sineol dapat diisolasi dari minyak
kayuputih dengan distilasi bertingkat, adisi dengan asam halogen, adisi dengan resorsinol,
atau adisi dengan asam fosforat. Sineol hampir tak larut dalam air namun dapat campur
dengan alkohol, kloroform, eter, asam asetat glasial, dan minyak (Kar, 2007).

(Kar, 2007)

Rimpang Pacing
Senyawa terpenoid dan steroid keduanya berasal dari jalur mevalonat
(Achmad,1985). Senyawa steroid pada umumnya merupakan senyawa yang berhubungan
dengan beberapa hormon dan keaktifan biologis tumbuhan. Senyawa ini merupakan
gabungan dua farnesilpiropospat yang kemudian mengalami demetilasi beberapa karbon.
Steroid adalah salah satu bentuk triterpena termodifikasi, sehingga unit penyusunnya
adalah isoprena, yaitu IPP dan DMAPP (Paul, 2002).
Sampel yang digunakan adalah ekstrak Rhizoma Pacing (Costus specious).
Rhizoma Pacing biasa disebut crepe ginger, Keyu atau Kust (Khare,2007). Costus
specious termasuk famili Zingiberaceae, tumbuhan berkayu dengan tinggi mencapai 2,7
m, tumbuh di area lembab dan basah seperti Indo-Malaya dan Sri Lanka. DI India
tanaman ini tumbuh di Himalaya tengah dan timur hingga bagian selatan India (Dutta dan
Dutta, 1998).
Costus specious memiliki kandungan diosgenin, 5-stigmast-9(11)-en-3-ol,
sitosterol--D-glukosida, dioscin, prosapogenins A dan B dari dioscin, gracillin dan
quinon. Selain itu, mengandung -tokoferol (Husein,dkk,1992). Rhizoma Costus specious
digunakan sebagai obat demam, batuk, anti-diabetes, dan hepatoprotektif (Biman dan
Kamaruz,2008).
Kromatografi Lapis Tipis
Dalam prosedur KLT, fase diam yang digunakan adalah silika gel F 254. Artinya,
fase diam tersebut mengandung silica gel sehingga mekanisme sorpsinya adalah adsorbsi.
Simbol F berarti pada fase diam ditambahkan bahan yang dapat berfloresensi. Angka 254
menunjukkan panjang gelombang eksitasi senyawa berfluoresensi yang ditambahkan
(Gandjar dan Rohman,2007).
Fase gerak yang digunakan untuk sampel herba oregano, daun mint, dan minyak
kayuputih yakni toluen : etil asetat (93:7 %v/v); sedangkan untuk sampel rimpang pacing
digunakan n-heksana : etil asetat (4:1 %v/v).
Silika bersifat polar karena mengandung banyak gugus hidroksi, sedangkan
toluen, etil asetat, dan heksana merupakan campuran pelarut-pelarut nonpolar sehingga
sistem ini adalah sistem KLT normal dengan fase diam polar dan fase gerak nonpolar.
Sampel-sampel juga merupakan senyawa yang cenderung nonpolar sehingga akan
terelusi bersama fase gerak. Mekanisme pemisahan pada sistem ini adalah adsorpsi
karena fase diam berupa padatan dan fase gerak berupa cairan.
Proses KLT dimulai dengan penotolan baku pembanding dan sampel pada fase
diam plat silika menggunakan pipa kapiler. Plat sudah ditandai terlebih dahulu dengan
pensil pada jarak 1 cm dari ujung untuk tempat penotolan, juga pada jarak 5 cm dari
tanda yang pertama sebagai batas jarak elusi. Pemisahan pada KLT yang optimum akan
diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin (Gandjar dan Rohman,2007). Apabila terlalu banyak dapat menurunkan resolusi
dan mengakibatkan terjadinya tailing yang dapat mengganggu intepretasi hasil.
Setelah penotolan, plat dilihat di bawah lampu UV 254 untuk mengecek seberapa
luas totolan. Bejana KLT diisi campuran pelarut organik sebagai fase gerak dengan
komposisi sesuai prosedur, yang telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Penjenuhan

bertujuan agar tekanan diseluruh bagian adalah sama dan kecepatan elusi fase gerak pun
sama. Penjenuhan dapat diamati dengan memasukkan kertas saring ke dalam bejana.
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan volume fase gerak sedikit mungkin (akan
tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah
ditentukan) (Gandjar dan Rohman,2007). Setelah fase gerak mencapai batas elusi, pelat
KLT dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Dari pengamatan pelat, bercak hasil elusi
tidak tampak jelas. Dibawah sinar UV 254, pelat KLT tampak berpendar namun bercak
masih belum dapat terlihat jelas. Begitu pula dengan penyinaran UV 366 pelat tampak
gelap dan bercak juga tidak tamak jelas.
Bejana KLT harus dijenuhkan dengan fase gerak terlebih dahulu sebelum
digunakan untuk elusi agar terhindar dari edge effect di mana sampel yang ditotolkan di
pinggir plat bermigrasi lebih jauh daripada sampel yang ditotolkan di tengah plat (Stahl,
1969). Memasukkan plat yang sudah ditotol sampel ke dalam bejana harus dilakukan
secara cepat dan selama elusi, bejana juga tidak boleh digeser dari posisinya. Elusi
dilakukan sampai fase gerak mencapai batas 5 cm yang telah ditandai sebelumnya,
selanjutnya plat KLT diambil dan dibiarkan mengering. Plat yang telah dielusi ini dilihat
kembali di bawah lampu UV 254 dan UV 366.
Dalam praktikum ini, digunakan beberapa baku pembanding. Baku pembanding
adalah materi atau substansi yang nilainya cukup homogen dan jelas dapat digunakan
untuk kalibrasi alat, pengembangan dan validasi metode, dan jaminan kualitas;
merupakan standard untuk digunakan dalam suatu pengukuran (Anonim, 1992). Baku
pembanding yang digunakan untuk sampel oregano, daun mint, dan minyak kayuputih
adalah campuran timol dan mentol. Dalam praktikum, tidak digunakan baku pembanding
sineol, namun karena adanya baku pembanding timol dan mentol, sampel yang
mengandung sineol juga dapat diidentifikasi karena nilai Rf-nya sineol dekat dan berada
di antara Rf mentol dan timol: mentol berwarna biru dengan Rf 0,3; sineol berwarna biru
dengan Rf 0,4; timol berwarna merah violet dengan Rf 0,52 pada fase gerak toluen : etil
asetat (93:7 %v/v) (Bladt, 2009). Pada percobaan ini juga dianalisis kandungan
stigmasterol dari ekstrak Rhizoma Pacing dengan pembanding stigmasterol murni.
Setelah dielusi dan dilihat dengan lampu UV, plat untuk sampel oregano, daun
mint, dan minyak kayuputih disemprot dengan pereaksi warna vanilin-asam sulfat lalu
dipanaskan di atas kompor serta diamati perubahan warnanya.
Plat silika untuk sampel rimpang pacing disendirikan karena selain baku
pembanding yang digunakan berbeda yakni stigmasterol, untuk sampel ini diberi pereaksi
warna yang berbeda juga, yakni anisaldehid-asam sulfat. Plat yang telah disemprot juga
dipanaskan di atas kompor. Perubahan warnanya bisa sangat cepat sehingga harus sangat
teliti dalam mengamati dan mendokumentasikan data. Setelah disemprot dengan pereaksi
dan dipanaskan, plat juga diamati lagi di bawah lampu UV 366.
Dari data pengamatan, diperoleh hasil sebagai berikut:
Untuk sampel oregano, setelah lempeng KLT disemprot dengan reagen vanilinasam sulfat dan dipanaskan dengan kompor, bercak-bercak tampak jelas baik pada
senyawa pembanding maupun sampel. Tampak adanya 2 bercak hasil elusi pada senyawa
pembanding yakni bercak berwarna ungu pudar pada Rf 0,46 dan 0,64. Ketika disinari
dengan UV 366, tidak tampak bercak yang berpendar. Sedangkan pada sampel oregano,
terdapat 4 bercak yang tampak yakni pada Rf 0,08 berwarna ungu; 0,3 dan 0,5 berwarna
ungu pudar; dan 0,64 berwarna kelabu. Di bawah lampu UV 366 tampak bercak

berfluoresensi terang dengan latar biru gelap; nilai Rf-nya 0,6. Bercak pada sampel yang
memiliki nilai Rf kurang lebih sama dengan bercak pada pembanding yakni pada Rf 0,6.
Secara teori, timol berwarna merah violet dengan Rf 0,52 untuk sistem yang sama (Bladt,
2009).
Untuk sampel daun mint setelah lempeng KLT disemprot dengan reagen vanilinasam sulfat dan dipanaskan dengan kompor, bercak-bercak tampak jelas baik pada
senyawa pembanding maupun sampel. Tidak tampak bercak hasil elusi pada senyawa
pembanding pada cahaya tampak juga ketika disinari dengan UV 366, tidak tampak
bercak yang berpendar. Sedangkan pada sampel daun mint, terdapat 5 bercak yang
tampak yakni pada Rf 0,1 dan 0,3 berwarna ungu pudar; 0,4 dan 0,6 berwarna ungu; dan
0,7 berwarna kelabu. Di bawah lampu UV 366 tampak bercak berfluoresensi terang
dengan latar biru gelap; ada dua bercak dengan nilai Rf-nya 0,1 dan 0,6. Bercak pada
sampel yang memiliki nilai Rf kurang lebih sama yakni pada Rf 0,1 dan 0,6. Secara teori,
mentol berwarna biru dengan Rf 0,3 untuk sistem yang sama (Bladt, 2009). Bercak
dengan Rf 0,3 hanya tampak pada sampel di bawah cahaya tampak.
Untuk sampel minyak kayu putih, setelah lempeng KLT disemprot dengan reagen
vanilin-asam sulfat dan dipanaskan dengan kompor, tidak tampak bercak hasil elusi pada
senyawa pembanding, demikian pula ketika disinari dengan UV 366. Sedangkan pada
sampel minyak kayuputih, bercaknya mengalami tailing dengan Rf 0,1 sebagai nilai ratarata bercak yang melebar. Juga diperoleh dua bercak berwarna ungu jelas dengan Rf 0,66
serta ungu pudar dengan Rf 0,76. Di bawah lampu UV 366, tidak tampak bercak yang
berfluoresensi, hanya tampak latar biru gelap Secara teori, sineol berwarna biru dengan
Rf 0,4 untuk sistem yang sama (Bladt, 2009).
Untuk sampel rimpang pacing, visualisasi bercak dilakukan secara destruktif
yakni dengan reagen kimia anisaldehid-asam sulfat. Anisaldehid asam sulfat merupakan
reagen universal untuk produk alami untuk memberikan diferensiasi warna. Reagen ini
merupakan reagen untuk antioksidan, steroid, prostaglandin, karbohidrat, fenol, glikosida,
sapogenin, komponen penting minyak atau senyawa terpen, antibiotik dan mikrotoksin.
Reagen ini merupakan reagen yang sangat baik untuk keperluan deteksi pelat KLT karena
memiliki sensitivitas terhadap senyawa-senyawa yang bersifat nukleofilik. Anisaldehid
merupakan senyawa aldehid yang rentan terhadap reaksi adisi nukleofilik dapat
membentuk warna dengan adanya asam sulfat dan oksigen melalui reaksi Friedel-Crafts
(Stahl dan Glatz, 1982). Reagen ini dibuat dari 0,5 ml p-anisaldehid dalam 50ml asam
asetat glasial dan 1ml asam sulfat. Setelah dipanaskan hingga 105C komponen akan
memberikan warna ungu, biru, merah, abu-abu atau hijau (Sherma dan Fried, 2003).
Setelah lempeng KLT disemprot dengan reagen anisaldehid-asam sulfat dan
dipanaskan, bercak-bercak tampak jelas baik pada senyawa pembanding maupun sampel.
Tampak adanya 4 spot hasil elusi pada senyawa pembanding yakni spot berwarna hijau
lumut pada Rf 0,3; bercak keunguan pada Rf 0,4; bercak merah muda dengan Rf 0,54;
dan pada Rf 0,6 terdapat bercak ungu keabu-abuan. Ketika disinari dengan UV 366
terdapat pula 4 bercak yang berpendar terang yakni pada Rf 0,6; 0,5; 0,4; dan 0,3.
Sementara itu, pada pembanding muncul pula spot berwarna keunguan pada Rf 0,4 yang
berpendar pada UV 366 dengan nilai Rf yang sama.
Terdapat bercak dengan warna yang sama baik pada sampel dan pembanding
yakni bercak keunguan yang berpendar di bawah sinar UV 366. Bercak ini memiliki nilai
Rf yang identik yakni 0,4 sehingga nilai Rx-nya adalah 1. Hal ini menunjukkan adanya

kesesuaian antara senyawa pembanding dan komponen pada ekstrak Rhizoma Pacing.
Dengan demikian, ekstrak Rhizoma Pacing mengandung komponen yang sama dengan
senyawa pembanding yakni stigmasterol. Hal ini sesuai dengan teori dimana Rhizoma
Pacing mengandung stigmasterol (Heftmann, 1976).
Warna yang tertangkap kamera dan yang dilihat oleh mata berbeda. Selain itu,
beberapa saat setelah dipanaskan, ada senyawa yang berubah warna akibat pengaruh
udara sehingga warnanya berbeda dengan ketika dipanaskan di atas kompor. Namun, hal
ini tidak sampai mengganggu hasil pengamatan karena saat pemanasan, perubahan warna
bercak telah didokumentasi.
Meski begitu, ada beberapa hasil yang kurang sesuai teori. Hal ini bisa jadi
dikarenakan penotolan yang terlalu banyak sehingga sampel sulit terelusi ke atas dan
menjadi bercak tailing; terlalu lama membuka bejana KLT saat memasukkan sampel
sehingga ada fase gerak yang menguap; tidak disengaja bergesernya bejana KLT sehingga
arah rambat elusi menjadi agak menyerong.
Selain itu, nilai Rf pada literatur dan praktik dapat berbeda karena Rf merupakan
besaran fisika yang sangat tergantung pada kondisi percobaan.
F. Kesimpulan
1. Sampel herba oregano (Origanum vulgare) mengandung timol yang berupa
bercak keunguan pada plat KLT dengan nilai Rf 0,6.
2. Sampel daun mint (Mentha piperita) mengandung mentol yang berupa bercak
keunguan pada plat KLT dengan nilai Rf 0,3.
3. Sampel minyak kayuputih (Melaleuca leucadendron) belum dapat dikatakan
mengandung sineol karena terjadi tailing bercak pada plat KLT.
4. Ekstrak Rhizoma Pacing (Costus Speciosus) mengandung stigmasterol.
G. Daftar Pustaka
Achmad, S.A., 1985, Kimia Organik Bahan Alam, Departemen Pendididkan dan
Kebudayaan, Universitas Terbuka, Jakarta.
Anonim, 1830, The Pharmacopoeia of the United States of America (The United States
Pharmacopoeia), Volume 2, U.S. Pharmacopeial Convention, Washington, DC.
Anonim, 1992, ISO Guide 30:1992, International Organization for Standardization,
Geneva.
Anonim, 2005, European Pharmacopoiea 5.0, Council of Europe, Strasbourg.
Anonim, 2010, WHO Monographs on Medicinal Plants Commonly Used in the Newly
Independent States (NIS), Volume 2, WHO Headquarters, Geneva.
Biman B, Kamaruz Z, 2008, Evaluation Of Hepatoprotective Activity Of Rhizomes Of
Costus Speciosus (J. Kanji) Smith, Pharmacologyonline, vol. 3 hal. 119-126.
Bladt, Sabine, 2009, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas, Springer,
Berlin.
Dewick, Paul M. , Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach 2nd edition,
2002, Chichester, John Wiley & Sons Ltd, London.
Dutta AC, Dutta TC ,1998, Botany, 6th Edition, Oxford University Press, Oxford.
E. Heftmann, 1976, Chromatography of Steroids, Elsevier Scientific Publishing
Company, Amsterdam.

Evans, W. C., 1996, Trease and Evans Pharmacognosy, 14 th Edition, W. B. Saunders,

London.
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Husain A, Virmani OP, Popli SP, Misra LN, Gupta MM, Srivastava GN, Abraham Z,
Singh AK, 1992, Dictionary of Indian Medicinal Plants, CIMAP, Lucknow.
Joseph Sherma dan Bernard Fried, 2003, Handbook of Thin Layer Chromatography Third
Edition Revised and Expanded, Marcel Dekker Inc, New York.
Kar, Ashutosh, 2007, Pharmacognosy and Pharmacobiotechnology, 2nd Edition, New
Age International Publishers, New Delhi.
Khare, C.P., 2007, Indian Medicinal Plants- an Illustrated Dictionary, Springer-Verlag,
Berlin Heidelberg.
Modnicki, Daniel dan Balcerek, Maciej, 2009, Estimation of total polyphenols contents in
Ocimum basilicum L., Origanum vulgare L. and Thymus vulgaris L. commercial
samples, Herba Polonica Journal, 55 (1), 35-42.
Stahl, Egon, 1969, Thin Layer Chromatography: A Laboratory Handbook, Springer
Verlag, Berlin.
Stahl, Egon dan Glatz, A., 1982 , Optimization of Aldehyde-Sulphuric Acid Reagents for
the Detection in Thin Layer Chromatography, J Chromatogr, vol. 243 hal. 139143.
Vazirian, M., Mohammadi, M., Farzaei, M. H., Amin, G., Amanzadeh, Y., 2015,
Chemical composition and antioxidant activity of Origanum vulgare subsp.
vulgare essential oil from Iran, RJP, 2 (1), 41-46.
Watson, David G., 1999, Pharmaceutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Students
and Pharmaceutical Chemists, Harcourt Publishers Limited, London.

H. Tugas
1. Gambarkan struktur kimia pembanding yang digunakan dalam praktikum ini!

Menthol
Stigmasterol

Thymol

2. Carilah dua contoh simplisia yang mengandung metabolit dari jalur asetatmevalonat selain yang sudah tercantum di buku petunjuk praktikum!
Talinum Paniculatum Radix mengandung stigmasterol
Kaempferiae Rizoma mengandung sineol
Yogyakarta, 9 Maret 2015
Praktikan,
Stefani Sisilia Handoyo (FA/09643)
Tina Nur Rahmi (FA/09644)
Asninda Hafshah Azizah (FA/09645)