Kultur Kalus San Suspensi Sel PDF
Kultur Kalus San Suspensi Sel PDF
Pendahuluan
Inisiasi pembentukan kalus merupakan salah satu langkah penting yang
menentukan keberhasilan teknik kultur in vitro. Kalus merupakan massa sel yang
tidak terorganisir, pada mulanya sebagai respon terhadap pelukaan (wounding).
Pembelahan selnya menjadi tidak terkendali, sel-selnya mengalami proliferasi
yaitu membelah terus menerus dengan sangat cepat, hal ini dimungkinkan
karena sel-sel tumbuhan yang secara alamiahnya bersifat autotrof dikondisikan
menjadi heterotrof oleh adanya nutrisi yang cukup komplek dan zat pengatur
tumbuh didalam medium kultur. Selain dari luka bekas irisan, kalus juga dapat
berasal dari pembelahan sel-sel kambium yang terus membelah dan
berproliferasi. Proliferasi sel-sel akan terjadi lebih baik jika eksplan yang
digunakan berasal dari jaringan yang masih muda. Sel-sel kalus secara fisiologis
dan biokimia sangat
yang sudah
dapat
diperbanyak
secara
tidak
terbatas
dengan
cara
memindahkan sebagian kecil kalus kedalam medium baru (sub kultur). Kalus
dengan sel-selnya yang bersifat meristematik, dapat didispersikan didalam
medium cair sehingga dapat diperoleh kultur suspensi sel.
Pendahuluan
Teknik kultur jaringan dimulai dengan mengisolasi bagian-bagian
tanaman (sel, jaringan, organ) kemudian menumbuhkannya secara aseptis
diatas atau didalam suatu medium budidaya sehingga bagian-bagian tanaman
tersebut dapat memperbanyak diri, dalam 1 - 2 bulan, tergantung dari jenis
tumbuhannya, akan terbentuk kalus. Kalus biasanya terjadi pada eksplan
ditempat irisan, karena jaringan kalus ini merupakan jaringan yang bertujuan
menutup luka. Pembelahan sel-sel pada kalus dipacu oleh hormon endogen dan
eksogen auksin dan sitokinin yang ditambahkan pada medium kultur. Kalus juga
dapat timbul karena adanya infeksi dari mikroorganisme tertentu seperti
Agrobacterium tumefaciens, gigitan serangga dan nematoda. Kalus yang
diakibatkan oleh infeksi Agrobacterium disebut tumor (crown gall). Pembentukan
kalus tergantung dari jenis tumbuhan, asal eksplan, umur fisiologi dari tanaman
donor dan komposisi medium kultur. Pada kenyataannya sulit untuk memperoleh
kalus dari hasil kultur jaringan yang eksplannya diambil dari sembarang bagian
jaringan tumbuhan. Kultur kalus bertujuan untuk mendapatkan kalus dari eksplan
yang ditumbuhkan diatas medium kultur secara terus menerus.
relatip homogen.
Inisiasi pembentukan kalus dimulai dari hasil pembelahan sel yang terus
menerus pada jaringan induk yang tidak perlu harus berhubungan langsung
dengan medium kultur, pertumbuhan yang tercepat terjadi didaerah perifer. Hal
ini disebabkan karena pada daerah tersebut ketersediaan hara dan oksigennya
lebih baik. Pertumbuhan kalus merupakan hasil interaksi yang sangat komplek
antara eksplan, komposisi medium dan kondisi lingkungan selama periode
inkubasi. Sel-sel memperlihatkan peningkatan aktivitas sitoplasmik yang ditandai
dengan meningkatnya respirasi dan jaringan kembali kekeadaan meristematik
(dediferensiasi). Selama pertumbuhannya kalus dapat mengalami lignifikasi yang
cukup kuat hiugga menyebabkan kalus bertekstur keras dan kompak, ada juga
yang friabel dan lunak sehingga mudah terpecah-pecah menjadi serpihanserpihan kecil. Kalus dapat berwarna kekuningan, putih, hijau atau terpigmentasi
oleh antosianin. Pigmentasi dapat seragam pada keseluruhan kalus atau
sebagian daerah tidak terpigmentasi. Sel-sel pembentuk antosianin dan nonantosianin telah berhasil diisolasi dari kalus wortel.
Induksi kalus dan pertumbuhan kalus yang terus berlangsung (dengan
melakukan subkultur), memerlukan gula dan garam-garam mineral pada
medium, selain itu juga memerlukan zat pengatur tumbuh:
(i) Auksin (pada kebanyakan monokotil)
(ii) Sitokinin (misalnya, pada gymnospermae)
(iii) Auksin dan Sitokinin (pada kebanyakan dikotil dan beberapa spesies
monokotil)
(iv) Tidak memerlukan zat pengatur tumbuh (misalnya tumor, jaringan yang
mengalami habituasi penuh)
Zat pengatur
(evaporasi)
yang
mengakibatkan
agar-agar
semakin
Alkohol70%
5. Akuades steril
6. Detergent
7. Clorox, Sunclin
8. Sikatgigi
9. Skalpel, pisau, pinset
10. Erlenmeyer 250 ml, beker glass 250 ml
11. Sprayer
Cara kerja
1. Persiapan eksplan
Umbi akar wortel dicuci bersih dengan cara disikat permukaannya dengan
menggunakan sikat gigi dan detergent. Umbi kemudian dipotong
melintang pada bagian tengah setebal kira-kira 1 cm. Masukkan segera
5-8 potong umbi kedalam beker glass, kemudian segera dibawa kedalam
Laminar air flow.
2. Sterilisasi eksplan
a. Bersihkan permukaan meja kerja dengan menyemprotkan alkohol
70% dan melapnya dengan kertas tissue. Sterilisasi eksplan
dilakukan dengan Clorox 10%. Masukkan potongan-potongan
umbi kedalam beker glass steril, tuangkan 100 ml clorox kedalam
beker glass yang berisi potongan eksplan, biarkan kira-kira 10
menit, sesekali beker glass digoyang-goyang.
b. Dengan pipet steril, pindahkan potongan-potongan eksplan dari
larutan Clorox kedalam beker glass kosong yang steril. Bilaslah
3. Pemotongan eksplan
a. Pindahkan potongan umbi kedalam petridish yang berisi kertas
saring steril, dengan menggunakan skalpel yang tajam, potongan
umbi ditipiskan ukurannya menjadi setebal kira-kira 0,5 cm
b. Buatlah potongan umbi menjadi kubus dengan ukuran kira-kira 0,5
x 0,5 cm
Pengamatan:
1. Amati awal terbentuknya kalus, dari bagian mana kalus terbentuk
2. Lakukan subkultur pada minggu ke 3
3. Amati tekstur, struktur dan warna kalus
4. Ukurlah berat basah dan berat kering kalus
Latihan soal-soal:
1. Apa yang disebut kalus, Jelaskan proses terbentuknya kalus!
2. Jelaskan bagaimana proses diferensiasi pada tanaman bersifat reversible
3. Jelaskan eksplan yang baik digunakan untuk induksi kalus!
4. Jelaskan apa yang terjadi pada kalus yang dipelihara untuk masa yang
panjang!
5. Jelaskan mengapa pada kultur kalus perlu dilakukan subkultur!
adanya
habituasi,
heterogenitas
dan
perubahan-perubahan
Pendahuluan
Kalus mengandung sel-sel yang lebih homogen dibandingkan dengan selsel yang terdapat pada eksplan, namun demikian sel-sel pada kalus tidaklah
seragarn. Kalus mengandung sel-sel yang mempunyai tingkat perkembangan
yang berbeda-beda (asynchronous) hal ini disebabkan karena kalus dikulturkan
pada medium padat, sehingga hanya bagian dasar dari kalus saja yang kontak
dengan medium kultur, akses ternauap nutrient menjadi berbeda. Sinkronisasi
dapat dilakukan dengan mengkulturkan kalus yang friabel kedalam medium cair
yang diinkubasi dengan penggojokan, setelah dua atau tiga minggu akan
terbentuk suspensi sel yang tumbuh aktip.
Kultur suspensi sel merupakan suatu system yang ideal untuk
mempelajari metabolisme sel, pengaruh berbagai persenyawaan pada sel dan
mempelajari diferensiasi sel. Dari segi praktis kultur suspensi sel dapat
digunakan sebagai sumber protoplas untuk difusikan atau manipulasi genetik,
untuk membuat single cell clone, untuk produksi embryo somatik , sel-sel pada
kultur suspensi sel juga dapat diperlakukan sebagai pabrik untuk memproduksi
metabolit sekunder.
ii.
iii.
iv.
sangat cepat. Derajat dispersi sel-sel didalam medium cair sangat dipengaruhi
oleh zat pengatur tumbuh. Penggunaan auksin dengan konsentrasi tinggi
(sampai 10M) bersama dengan sitokinin dengan konsentrasi yang lebih rendah
(0,1 - 5) M dapat meningkatkan dispersi sel. Inisiasi dari kultur suspensi sel
memerlukan kalus sebagai inokulum yang jumlahnya relatip cukup banyak, yaitu
sekitar 2-3 gram untuk 100 ml medium. Kalus sebanyak itu dapat menghasilkan
suspensi sel dengan densitas awal sekitar 0,5-2,5 x 105 per ml medium. Kultur
suspensi sel akan tumbuh dengan sangat cepat, untuk itu harus dilakukan
subkultur dengan cara mengenapkan sel-sel pada dasar botol kultur, kemudian
dengan hati-hati medium yang ada diatasnya dituang. Endapan sel-sel kemudian
dibagi menjadi dua bagian, masing-masing digunakan sebagai inokulum dengan
memasukkan kedalam medium baru yang komposisi dan volumenya sama
dengan medium lama. Biasanya subkultur dilakukan secara teratur setiap satu
atau dua minggu sekali, yaitu ketika sel berada pada awal fase stationary. Dasar
yang digunakan untuk subkultur ini adalah untuk mempertahankan kultur tetap
pada fase pertumbuhan logaritmik.
Ada sejumlah metoda yang digunakan untuk mengukur laju pertumbuhan
sel pada kultur suspensi sel, yaitu dengan menghitung:
a. Jumlah sel termampat (Packed Cell Volume, PCV)
b. Jumlah sel
c. Berat basah dan berat kering
d. Total protein
Sedangkan viabilitas sel ditentukan dengan pengecatan PDA, Evan's
blue, tetrazolium salt dsb. Viabilitas sel menentukan kemampuan sel-sel untuk
membelah. Pada semua metoda pengukuran tersebut diatas, sampling dari kultur
dilakukan pada interval waktu tertentu. Hasil pengukuran yang diplotkan dengan
waktu sampling tersebut akan menghasilkan kurva pertumbuhan yang khas,
berbentuk sigmoid, yang dicirikan dengan 5 fase pertumbuhan (gambar 5.3).
teknik ini adalah pengukuran volume sel yang terendapkan pada periode waktu
tertentu. Sebagai contoh: 50 ml suspensi sel dimasukan dalam gelas ukur atau
tabung sentrifugasi yang berskala, sel-sel dibiarkan mengendap sampai tidak
ada penambahan volume sel-sel yang mengendap. Waktu pengendapan sel
untuk setiap kali pengukuran harus sama, misalnya V30 artinya volume
pengendapan sel-sel selama 30
(inhibition).
Penghambat
sintesis
DNA
seperti
5-
medium cair dengan kerapatan duakali lipat dari kerapatan akhir yang dibutuhkan
untuk sel plating. Suspensi sel kemudian dicampur dengan medium yang
mengandung agar-agar yang masih mencair (35C) dengan perbandingan 1:1.
Suspensi sel yang sudah bercampur medium yang mengandung agaragar kemudian segera dituang kedalam Petridis, petridish di segel dengan
parafilm dan diinkubasi 25C dalam kondisi gelap, koloni sel akan tumbuh dari
sebutir sel pada permukaan medium agar. Untuk penghitungan efisiensi plating
digunakan formula:
X 100
Jumlah awal sel/plate
Kultur suspense sel dapat diinisiasi dari kalus. Tahapan pekerjaan dapat
dilihat pada gambar 5.5.
Pembuatan kultur suspensi sel dan sel plating dilaksanakan dengan prosedur :
1. Kalus wortel yang dibuat seperti yang dijelaskan pada suppokok bahasan
1
2. Siapkan medium cair MS dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D 1 mg/l
didalam Erlenmeyer 100 ml. Tiap Erlenmeyer berisi 50 ml medium cair
3. Siapkan medium MS padat dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D 1 mg/l
didalam petridish.
4. Pilihlah kalus yang lunak dan berwarna putih cerah, timbang secara
aseptis sebanyak (1 - 1,5) gram, masukkan kalus kedalam Erlenmeyer
yang berisi medium MS cair, tutup yang rapat dan beri label.
5. Letakkan Erlenmeyer yang sudah berisi kalus pada penggojok (shaker),
atur kecepatan 120 rpm, inkubasi dilakukan pada suhu 25C pada kondisi
gelap.
6. Setelah 2-3 minggu akan terbentuk suspensi sel, lakukan subkultur
didalam laminar air flow cabinet, dengan menyaring suspensi sel
menggunakan nilon filter porositas 80 m, bagilah filtratnya menjadi dua
bagian, biarkan selama 30-50 menit, supaya sel-sel mengendap,
buanglah medium lama dengan cara menuang, tambahkan medium baru
sebanyak 100 ml, kembalikan salah satu Erlenmeyer yang berisi sel-sel
dengan medium baru diatas shaker.
7. Pindahkan sisa filtrate kedalam tabung sentrifugasi, endapkan dengan
kecepatan 1000 rpm selama 10 menit, buanglah supernatant.
8. Resuspensikan pellet dengan 1 ml medium cair baru, taburkan diatas
petridish yang telah berisi medium MS padat, ratakan dengan
menggoyang petridish pelan-pelan, tutuplah petridish dan segel dengan
parafilm, beri label dan tempatkan kultur didalam incubator 25C pada
kondisi gelap.
Latihan soal-soal:
1. Jelaskan apa keuntungan digunakannya medium cair dibandingkan
dengan medium padat?
2. Jelaskan kurva pertumbuhan sel pada kultur suspensi sell
3. Kapan sebaiknya dilakukan subkultur pada kultur suspensi sel, tnengapa
4. Jelaskan bagaimana sinkronisasi pada kultur suspensi sel dikerjakan!
5. Jelaskan apa manfaat kultur suspensi sel!