PRAKTIKUM V

A.
Judul
Praktikum:
UJI KUANTITATIF BAKTERI PADA BAHAN MAKANAN DENGAN METODE POUR
PLATE
B.
Tujuan
Praktikum
Untuk mengetahui jumblah bakteri pada bahan makanan dengan metoda
pour
plate
C.
Dasar
Teori
Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan
keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini
dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui
beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer
fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak
rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan
beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau
memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan).
Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan
dengan menuangkan media penyubur (nutrien agar) steril hangat (4050oC) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator (37oC)
selama
1-2
hari.
Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak
terjdi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak
diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat
tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang
hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses
penuangan (media panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas
masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup,
sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni akan
tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di
dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam incubator.
Pada metode pour plate volume kultur sebanyak 0,1-1,0 ml diambil dan
dimasukkan kedalam cawan petri steril. Kemudian ditambahkan media
agar cair dan dilakukan pencampuran antara kultur dan media dengan
memutar cawan petri secara pelan pada permukaan yang rata. Karena
sampel dicampur dengan media agar cair maka volume kultur yang
digunakan dapat lebih tinggi dibanding dengan metode spread plate. Pada
pengujian dengan metode pour plate, kultur/sampel mikroba yang
digunakan harus dapat bertahan hidup pada saat media agar dengan
suhu sekitar 45 0C ditambahkan. Didalam penggunaan metode spread
plate dan pour plate sangat penting jika jumlah koloni yang tumbuh pada
media agar tidak terlalu banyak, karena pada petri yang ditumbuhi koloni
yang banyak, beberapa sel tidak dalam bentuk koloni tunggal sehingga
dapat menimbulkan perhitungan yang salah. Jumlah koloni yang sangat
sedikit juga tidak diharapkan karena secara statistik keakuratan hasil
perhitungan jumlah koloni ini sangat rendah. Dalam penerapannya, secara
statistik yang paling baik adalah menghitung jumlah koloni hanya jika
pada media agar terdapat koloni antara 30 300 koloni.

Untuk memperoleh jumlah koloni yang tepat, sampel yang akan dianalisa
harus selalu diencerkan terlebih dahulu. Karena dalam penerapannya
sangat sulit dilakukan pendugaan jumlah sel maka biasanya sangat
penting
untuk
melakukan
pengenceran
lebih
dari
satu.
D.
Alat
dan
Bahan
1. Alat : Vortex, petridish, Erlenmeyer , Dispo, incubator, autoklaf, mortar,
Colini
counter,
Bunsen,
Neraca
Ohaus,
dan
Tabung
reaksi.
2. Bahan : NaCL fisiologis, aquades steril, NA ( Nutrien Agar ), alcohol 70
% dan bahan makanan ( daging, ikan kaleng ,telur, ikan asin, ikan asap. ).
E.
Prosedur
Kerja
1. Mengambil bahan makanan yang akan di uji seberat 1 gram lalu
masukkan ke dalam mortar steril dan menghaluskan, lalu mengambil
bahan makanan yang sudah dihaluskan tadi sebanyak 1 gr kemudian
memasukkannya kedalam larutan NaCL fisiologi steril sebanyak 10 ml,
suspensi yang diperoleh dipindahkan kedalam tabung steril dan di vortex
sampai
homogen.
2. Dari suspensi yang tersedia diambil sebanyak 1 ml dengan
menggunakan dispo dan mengencerkan menjadi 1 ; 10 dengan
menambahkan NaCL fisiologi sebanyak 9 ml, selanjutnya dibuat
pengenceran 1 : 100 , yaitu mengambil 1 ml dari hasil pengenceran
sebelumnya ( 1 : 10 ) dan ditambahkan NaCL fisiologi sebanyak 9 ml.
demikian seterusnya dibuat sampai pengenceran yang diinginkan.
3. Setelah itu dari masing masing pengenceran di ambil suspense
sebanyak 1 ml dan memindahkan kedalam cawan petri kemudian
memasukkan media NA yang bersuhu 45 0C kemudian digerakkan
perlahan lahan agar suspense tersebut tercampur rata ke dalam media.
4. Selanjutnya menginkubasi dalam incubator dengan suhu 37 0C selama
1 x 24 jam dengan posisi cawan petri dalam keadaan terbaik.
5. Menghitung jumlah koloni yang terdapat di cawan petri kemudian
hitung jumlah sel bakteri pada bahan makan dengan menggunakan rumus
sebagai
berikut
:
Koloni per ml / per gr = jumlah koloni percawan x 1/ Factor pengenceran
F.
Hasil
Pengamatan
Cawan petri yang telah di inkubasi didalamnya terdapat mikroba.
Dari percobaan yang kami lakukan kami maendapatkan hasil :
PENGENCERAN JUMLAH KOLONI BENTUK PERMUKAAN BENTUK PINGGIR
10-1
40
Datar
Agak
Bergerigi
&
melengkung
10-2
20
Datar
Agak
Bergerigi
&
melengkung
10-3
13
Datar
Melengkung

G.
Pembahasan
Pada metode pour plate volume kultur sebanyak 0,1-1,0 ml diambil dan
dimasukkan kedalam cawam petri steril. Kemudian ditambahkan media
agar cair dan dilakukan pencampuran antara kultur dan media dengan
memutar cawan petri secara pelan pada permukaan yang rata. Karena
sampel dicampur dengan media agar cair maka volume kultur yang
digunakan dapat lebih tinggi dibanding dengan metode spread plate.
Pada pengujian dengan metode pour plate, kultur/sampel mikroba yang
digunakan harus dapat bertahan hidup pada saat media agar dengan
suhu sekitar 45 0C ditambahkan. Didalam penggunaan metode spread
plate dan pour plate sangat penting jika jumlah koloni yang tumbuh pada
media agar tidak terlalu banyak, karena pada petri yang ditumbuhi koloni
yang banyak, beberapa sel tidak dalam bentuk koloni tunggal sehingga
dapat menimbulkan perhitungan yang salah. Jumlah koloni yang sangat
sedikit juga tidak diharapkan karena secara statistik keakuratan hasil
perhitungan jumlah koloni ini sangat rendah. Dalam penerapannya, secara
statistik yang paling baik adalah menghitung jumlah koloni hanya jika
pada media agar terdapat koloni antara 30 300 koloni. Untuk
memperoleh jumlah koloni yang tepat, sampel yang akan dianalisa harus
selalu diencerkan terlebih dahulu. Karena dalam penerapannya sangat
sulit dilakukan pendugaan jumlah sel maka biasanya sangat penting untuk
melakukan
pengenceran
lebih
dari
satu.
Untuk membuat pengenceran 10-1 maka kita dapat melakukan
pencampuran antara 0.5 ml sampel dengan 4.5 ml larutan pengencer
atau dengan pencampuran 1.0 ml sampel dengan 9.0 ml larutan
pengencer. Untuk membuat pengenceran 10-2 maka kita dapat
melakukan pengenceran 0.05 ml sampel dengan 4.95 larutan pengencer
atau 0.1 sampel dengan 9.9 ml larutan pengencer atau sebagai alternatif
pengenceran 10-2 dapat dibuat dengan melakukan pencampuran 1,0
sampel (yang diambil dari pengenceran 10-1) dengan 9,0 ml larutan
pengencer, dan begitu seterusnya hingga didapatkan pengenceran yang
diperkirakan dapat memberikan hasil antara 30-300 koloni. Jumlah koloni
dalam
sampel
dapat
dihitung
sebagai
berikut
:
Koloni per ml / per gr = jumlah koloni percawan x 1
Factor
pengenceran
Pada pengenceran 10-1 dengan jumlah 40 koloni dapat dihitung koloni
dalam
sampel
yaitu
:
40
x
1
=
400
koloni/ml
10-1
H.
Kesimpulan
Jumlah koloni yang diperoleh dengan menggunakan metode ini tidak
hanya bergantung pada jumlah inokulum tetapi juga kesesuaian media
dan kondisi inkubasi yang digunakan dan juga bergantung pada lama
waktu inkubasi. Sel yang ditumbuhkan pada media tidak seluruhnya akan
tumbuh menjadi koloni pada tingkat yang sama, dan jika waktu inkubasi
yang digunakan pendek maka jumlah koloni yang diperoleh mungkin lebih
rendah dari jumlah maksimum koloni yang dapat terbentuk. Sebagai
catatan sangat mungkin dua atau lebih sel dapat membentuk hanya satu

koloni, sehingga untuk menggambarkan hasil yang didapatkan maka

viable count lebih dinyatakan sebagai jumlah colony-forming unit
dibanding dinyatakan sebagai jumlah viable cell (karena koloni yang
terbentuk mungkin mengandung lebih dari satu sel mikroba)
I.
Jawaban
pertanyaan
1.
kelebihan
dan
kekurangan
dari
metode
pour
plate
Kelebihan
Kelemahan
Hanya
sel
yang
masih
hidup
yang
dihitung
Beberapa
jenis
mikroba
dapat
dihitung
sekaligus
HasilDapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba
perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel sebenarnya, karena beberapa
sel yang berdekatan mungkin akan membentuk satu koloni
Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai
yang
berbeda
Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk
koloni
yang
jelas
Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relative lama sehingga
pertumbuhan
koloni
dapat
dihitung
2.
Aturan-aturan
dalam
standar
plate
count
(SPC)
Jumlah
Koloni
30300
koloni
- Beberapa jumlah koloni yang bergabung dihitung satu koloni
Gabungan
satu
garis
tebal
dihitung
satu
koloni
- Jika lebih kecil dari 30 koloni, pengenceran terendah yg dihitung
- Jika lebih besar dari 300 koloni, pengenceran tertinggi yg dihitung
- Jika antara 30-300 dari dua tingkat pengenceran dan perbandingan
antara hasil tertinggi dan terendah dari pengenceran tsb lebih kecil atau
= 2, dilaporkan rata-ratanya. Jika lebih besar dari 2 maka yang dilaporkan
adalah
hasil
yang
terkecil.
J.
Daftar
pustaka
GAUTHIER . M and BLAIS. B.W. 2005. CLOTH-BASED HYBRIDIZATION ARRAY
SYSTEM FOR DETECTION OF TOXIN GENES ASSOCIATED WITH MAJOR
FOODBORNE PATHOGENIC BACTERIA. Journal of Rapid Methods and
Automation in Microbiology 13 (2005) 243256. Blackwell Publishing
HSIN-YI PU and SHAW-JYE WU. 2005. A MICROTRAY-BASED AGGREGATION
ASSAY FOR THE RAPID DETECTION OF POLYMERASE CHAIN REACTION
AMPLICONS PRODUCED FROM BACTERIAL PATHOGENS. Journal of Rapid
Methods and Automation in Microbiology 13 (2005) 257268. Blackwell
Publishing.
Irwin. P, et al. 2005. LUMINESCENT METHODS TO DETECT VIABLE AND
TOTAL
Campylobacter jejuni IN GROUND BEEF. Journal of Rapid Methods and
Automation in Microbiology 13 (2005) 5770. Blackwell Publishing

Posted by Andri Satolom on - Rating: 4.5

Title : UJI
KUANTITATIF
BAKTERI
DENGAN
METODE
POUR
PLATE
Description : PRAKTIKUM V A. Judul Praktikum: UJI KUANTITATIF BAKTERI PADA BAHAN
MAKANAN DENGAN METODE POUR PLATE B. Tujuan Praktikum Untuk me...