Makalah Farmakognosi

Review Jurnal Purifikasi Dan Karakterisasi Protease Dari Bakteri

Hasil Isolasi Dari Wheytahu

Disusun oleh:
Cikita Putri Taji Aprillianti

201310410311082

Luh Ayu Rizka Rata Ningtyas

201310410311082

Shang Ayoe Lail Sabet

201310410311084

Nuradria Nazala

201310410311085

Abd Hakim Azhr

201310410311091

Azaria Rusydianasari

201310410311096

Ida Isma Purwanti

201310410311101

Novi Kharisma Wati

201310410311104

Naniek Dwi Okvitasari

201310410311106

Nindya Alfa Dicha

201310410311107

BAB I
PENDAHULUAN
Protease merupakan satu dari tiga kelompok enzim terbesar dari industri enzim dan
diperkirakan sebesar 60% dari total enzim yang diperjual belikan di seluruh dunia (Rao et
al., 1998; Singh et al., 2001; Gupta et al., 2005). Protease adalah enzim yang dapat
menghidrolisis protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida
kecil dan asam amino (Bains, 1998). Industri pengguna protease diantaranya di bidang
pangan (sebagai pengempuk daging, penjernih bir, pembuatan keju dan pembuatan cracker
dan dibidang non pangan (industri deterjen, industri kulit, industri tekstil, biomedis sampai
industri pakan ternak) (Gupta et al., 2002).
Enzim protease dapat diperoleh dari jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba.
Keterbatasan kemampuan hewan dan tumbuhan

dalam memenuhi

permintaan

protease, telah mendorong berkembangnya protease mikroba. Mikroba memiliki peran

penting sebagai penghasil protease karena memiliki beberapa keunggulan antara lain,
mikroba memiliki siklus hidup yang singkat, efisiensi waktu dan tempat, produktivitas
tinggi dan memudahkan kita untuk melakukan manipulasi genetik (melalui rekayasa
genetika mikroba) maupun manipulasi dalam proses fermentasi (rekayasa bioproses).
Mikroba yang telah dikembangkan secara komersial sebagai penghasil protease antara
lain Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Aspergillus
oryzae, dan Aspergillus niger. Pada review jurnal ini digunakan limbah cair tahu (wheytahu)
sebagai sumber untuk mendapatkan isolat penghasil protease (bakteri proteolitik) karena
mengandung protein sekitar 1.75% (Enie dan Supriatna, 1993). Selanjutnya dilakukan
purifikasi dan karakterisasi enzim protease yang dihasilkan.

BAB II
PEMBAHASAN
Metode Penelitian
Tahapan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahap. tahap pertama adalah isolasi dan identifikasi
bakteri yang menghasilkan enzim protease dengan aktivitas protease tertinggi. Tahap
kedua adalah isolasi enzim kasar protease dan purifikasi parsial dengan pengendapan
menggunakan amonium sulfat, dilanjut proses dialisis. Tahap ketiga adalah karakterisasi pH,
suhu, KM dan V maks serta berat molekul enzim protease menggunakan elektroforesis SDSPAGE yang selanjutnya dikonfirmasi dengan zimogram (Mehzard et al., 2005).
Isolasi

Bakteri

Penghasil

Protease

(Rahayu,

1991,

dengan

modifikasi)

Sampel limbah cair tahu diambil kemudian dilakukan pengkayaan atau enrichment.
Hasil dari pengkayaan kemudian dilakukan pengenceran untuk ditumbuhkan pada media
produksi protease padat (metode spread) yang mengandung kasein dan diinkubasi pada
suhu 37 C selama 24 jam. Uji positif ditandai dengan adanya zona bening yang
terbentuk di sekeliling koloni akibat adanya hidrolisis kasein menjadi nitrogen terlarut.
Koloni tunggal yang menghasilkan zona bening kemudian dimurnikan. Setelah didapatkan
isolat yang positif menghasilkan protease, dilakukan uji secara kualitatif dan kuantitatif
serta karakterisasi bakteri meliputi uji morfologi koloni dan uji biokimia.
Produksi enzim (El-safey dan Raouf, 2004)
Produksi enzim dilakukan dengan menumbuhkan bakteri ke dalam 45 ml media cair dengan
komposisi skim milk 2%, pepton 0.5%, yeast ekstrak 0.1%, glukosa 2%, NaCl 0.1%,
KH2PO4 0.008%, MgSO4.7H2O 0.01% dan (NH4)2SO4 0.04% (El-safey dan Raouf,
2004) dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 17-18 jam (akhir fase logaritmik). Kultur
starter sebanyak 50 ml dimasukkan dalam 450 ml media produksi protease cair dan
diinkubasi dalam shaker waterbath pada suhu 37 C, 120 rpm sampai substrat habis. Larutan
hasil produksi enzim protease disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm pada suhu 4 C
selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan merupakan enzim protease kasar. Supernatan
(enzim kasar) ini kemudian diuji aktivitas (Sigma, 1999) dan kadar protein (Bradford,
1976).

Pemurnian Enzim Protease (El-safey dan Raouf, 2004)

Enzim protease dimurnikan dengan menggunakan metode pengendapan amonium sulfat.
500 ml ekstrak kasar enzim protease

ditambahkan amonium sulfat 50%. Penambahan

tersebut disertai dengan pengadukan pada suhu 4 C selama semalam. Kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm pada suhu 4C selama 15 menit. Supernatan
dibuang dan endapannya merupakan enzim setengah murni. Enzim tersebut kemudian
didialisis dengan menambahkan buffer fosfat pH 7 dan dimasukkan ke dalam kantong
selofan.

Kemudian

direndam dalam

buffer

fosfat

0.025

pH

dan diaduk

menggunakan stirrer pada suhu 4 C selama satu malam. Buffer perendam diganti setiap 6
jam sekali sampai semua garam terpisah. Dialisis dihentikan bila semua garam amonium
sulfat telah keluar dari membran dengan mengujinya menggunakan larutan BaCl2 dan HCl.
Tiga tetes BaCl2 0.1 M dan 3 tetes HCl 0.1 M ditambahkan ke dalam larutan buffer yang
ada di luar kantung selofan. Ion-ion sulfat (SO42-) akan membentuk endapan putih BaSO4
(Sundin, 2008). Larutan enzim semi murni selanjutnya diuji aktivitas dan kadar proteinnya.
Karakterisasi Enzim (Schomburg, 1990)
Karakterisasi enzim protease meliputi pH, suhu optimum serta K M dan Vmaks. Penentuan
pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim protease setengah murni pada pH
yaitu pada 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8, dan 8.5 sedangkan untuk penentuan suhu optimum digunakan
variasi suhu pada 25, 30, 37, 40, 45, dan 50 C. Penentuan suhu ini menggunakan interval 5
C, namun suhu 37 C juga digunakan karena merupakan suhu optimum untuk
pertumbuhan mikroba. Penentuan KM dan Vmaks dilakukan dengan menguji aktivitas enzim
protease semi murni pada konsentrasi substrat kasein 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 dan
0.65%. Penentuan berat molekul dilakukan dengan menggunakan metode Sodium Dodesil
Sulfat Poliakrilamid Gel Elektroforesis (SDS-PAGE), lalu untuk mengkonfirmasi pita
protein aktif yang mempunyai aktivitas protease menggunakan metode zimogram (activity
staining method).

Dalam

stacking

dan separating gel 12.5%

gel 3%

penelitian ini

digunakan

SDS-PAGE

(Laemmli,

1970).

diskontinyu dengan
Untuk

zimogram

konsentrasi gel sama, namun terdapat penambahan kasein 0.05% ke dalam separating
gel (Mehzard et al., 2005).

Hasil Penelitian
Isolasi dan Skrining Isolat Bakteri Penghasil Protease
Berdasarkan hasil isolasi,diperoleh 30 isolat bakteri yang berpotensi sebagai bakteri
penghasil

protease.

Kemudian

skrining dilakukan terhadap 30 isolat dengan metode

kualitatif (pembentukan zona bening) dan kuantitatif (aktivitas enzim). Hasil skrining
diperoleh satu isolat, LnA4, dengan zona bening lebar (diameter 10 mm) dan aktivitas
spesifik

tertinggi (0.123 U/mg). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat LnA4

mempunyai bentuk koloni bulat, bentuk tepi halus, elevasi cembung, warna koloni putih susu,
bentuk sel batang dan merupakan bakteri gram positif dan katalase positif.
Produksi dan Purifikasi Parsial Enzim Protease
Produksi enzim dilakukan pada jam ke-17 hingga ke-18 (akhir fase log) dimana
pada jam tersebut isolat LnA4 menghasilkan jumlah enzim protease yang optimum. Isolasi
enzim protease kasar dari isolat LnA4 dilakukan dengan sentrifugasi pada suhu 4 C.
Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan sel bakteri dengan ekstrak enzim kasar protease.
Selanjutnya ekstrak kasar enzim protease dipurifikasi secara parsial dengan metode
pengendapan amonium sulfat dan dialisis. Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan
pada penelitian ini adalah konsentrasi 50%. Diperoleh pada konsentrasi 50% yaitu sebesar
0.34 U/mg yang menunjukkan aktivitas spesifik tertinggi. Oleh karena itu pengendapan
dengan ammonium sulfat 50% dipilih sebagai konsentrasi yang sesuai untuk pengendapan
enzim protease. Setelah protein diendapkan dengan amonium sulfat dan dilarutkan dalam
buffer fosfat 0.05 M dan 0.025 M pH 7.0 selanjutnya dilakukan dialisis untuk
menghilangkan garam dan zat terlarut lainnya.
Keberadaan residu amonium sulfat maupun molekul-molekul non-protein lainnya
akan

mengganggu

mempengaruhi
mengendap

dan

sisi aktif

protease

dalam

mengikat

substrat sehingga

dapat

aktivitas protease. Penambahan amonium sulfat menyebabkan protein

aktivitas

enzim menjadi

meningkat

karena

menurunnya jumlah

kontaminan yang menghalangi sisi aktif enzim untuk berikatan dengan substrat. Menurut
(Aulanniam, 2005), penambahan amonium sulfat berpengaruh terhadap protein yang
terendapkan selama proses pemurnian. Ion-ion garam amonium sulfat akan berkompetisi
dengan protein untuk menarik molekul air. Ion-ion garam memiliki kelarutan lebih besar
dibandingkan dengan protein sehingga ion garam akan menarik molekul air dari protein
enzim. Protein-protein enzim akan berinteraksi membentuk gumpalan dan mengendap.

Proses ini dilakukan pada suhu rendah (4 C) sehingga protein akan mengendap tanpa
terdenaturasi.
Setelah protein diendapkan dengan amonium sulfat dialisis perlu dilakukan untuk
menghilangkan residu garam amonium sulfat dan zat terlarut lainnya. Keberadaan garam
amonium sulfat maupun molekul-molekul nonprotein lainnya akan mengganggu sisi aktif
protease dalam mengikat substrat sehingga dapat

mempengaruhi

aktivitas

protease.

Menurut Sorensen et al. (1999), salah satu cara memisahkan kelebihan garam amonium
sulfat adalah melalui dialisis protein. Molekul garam akan berdifusi keluar dari kantung
dialisis, karena molekul kecil cenderung berdifusi ke larutan dengan konsentrasi yang
lebih rendah. Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa tingkat kemurnian enzim mengalami
peningkatan setelah pengendapan dan dialisis secara berturut-turut yaitu 1.91 kali dan
12.96 kali dibandingkan nilai aktivitas spesifik enzim kasar. Dari data tersebut dapat
disimpulkan bahwa semakin tinggi tingkat kemurnian enzim maka semakin tinggi pula
aktivitas spesifik enzim protease.
Penentuan pH Optimum
Penentuan pH optimum enzim dari isolat LnA4 dilakukan pada kisaran pH 6, 6.5, 7, 7.5,
8, dan 8.5. Pada penelitian ini menunjukkan bahwa aktivitas protease optimum pada pH 7.5.
Saat pH optimum, enzim mempunyai konformasi sisi aktif yang sesuai dengan substrat
kasein yang menyebabkan terbentuknya kompleks enzim substrat yang maksimal, karena
gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada
tingkat ionisasi yang diinginkan, sehingga menghasilkan produk yang maksimal juga.
Kisaran pH optimum protease bervariasi tergantung dari jenis proteasenya, pH optimum
protease pada penelitian ini masih berada pada kisaran pH netral.
Penentuan Suhu Optimum
Aktivitas katalitik enzim juga dipengaruhi oleh suhu dimana pada suhu rendah reaksi
kimia berlangsung lambat dan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih
cepat. Penentuan suhu optimum dilakukan pada variasi suhu 25, 30, 37, 40, 45, dan 50 C
dengan waktu inkubasi 20 menit dan pada pH 7.5. Pada praktikum ini menunjukkan aktivitas
protease meningkat dengan meningkatnya suhu. Peningkatan aktivitas protease dari
isolat LnA4 ini mencapai nilai optimum pada suhu 37 C. Pada suhu optimum, tumbukan
antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzimsubstrat
semakin mudah dan produk yang terbentuk meningkat (Nelson dan Cox, 2000). Kenaikan

suhu

tidak

lagi

meningkatkan aktivitas

protease,

namun

sebaliknya

aktivitasnya

mengalami penurunan. Pada suhu diatas suhu optimum, akan mempercepat kerusakan
pada

konformasi

gugus

aktif enzim sehingga enzim mengalami hambatan dalam

berinteraksi dengan substrat dan aktivitas katalitk enzim akan menurun.

Penentuan KM dan Vmaks
Penentuan nilai KM dan Vmaks enzim protease dari isolat LnA4 dihitung berdasarkan
aktivitas enzim tersebut pada variasi konsentrasi substrat dengan pH optimum yaitu 7.5
dan suhu optimum 37C. Pada penelitian ini menunjukkan grafik transformasi LineweaverBurk dari isolat LnA4. Nilai KM dan Vmaks ditentukan dengan persamaan y = ax + b dari
hasil perhitungan diperoleh b = 1/ Vmaks dan a = KM / Vmaks sehingga nilai Vmaks
adalah 0.206 mg/mL/menit dan nilai KM adalah 0.267 mg/mL. Pada penelitian ini nilai
KM menunjukkan bahwa pada konsentrasi substrat sebesar 0.267 mg/mL reaksi berjalan
dengan kecepatan setengah kecepatan maksimum. Nilai Vmaksmenunjukkan kecepatan
pembentukan kompleks enzim substrat ES sama dengan kecepatan penguraiannya yaitu
sebesar 0.206 mg/mL/menit.
adalah

Pada Bacillus subtilis nilai Vmaks dan KM berturut-turut

0.209 mg/mL/menit dan 0.264 mg/mL. Nilai KM isolat

LnA4

0.267 mg/mL

memiliki nilai KM yang hampir sama dengan nilai KM Bacillus subtilisyaitu 0.264 mg/mL,
demikian juga nilai Vmaks dari isolat LnA4 0.206 mg/mL/menitmemiliki nilai yang
hampir sama dengan nilai Vmaks dari Bacillus subtilis yaitu 0.209 mg/mL/menit. Harga
KM yang makin rendah menunjukkkan bahwa enzim tersebut makin reaktif (memiliki
afinitas yang tinggi) sehingga juga mempunyai Vmaks yang lebih tinggi. Menurut
Aulanniam (2005) bahwa suatu harga KM yang rendah menunjukkan aktivitas enzim
yang tinggi terhadap substrat. Sebaliknya harga KM yang besar menunjukkan enzim
mempunyai aktivitas rendah terhadap substrat.
Penentuan Berat Molekul
Penentuan berat molekul enzim protease dilakukan dengan menggunakan SDS-PAGE
dan dikonfirmasi dengan zimogram. Berdasarkan hasil perhitungan, diperoleh 4 pita
protein dari isolat LnA4 yang memiliki berat molekul sebesar 73.96, 53.70, 36.70, dan
29.71 kDa. Dari empat pita protein yang diperoleh belum diketahui apakah semuanya
memiliki aktivitas protease. Oleh karena itu digunakan zimogram untuk mengkonfirmasi
pita aktif yang memiliki aktivitas. Berdasarkan hasil zimogram dapat diketahui bahwa
hanya ada satu pita protein yang menunjukkan aktivitas protease yaitu pada berat molekul

29.71 kDa. Adanya aktivitas protease pada zimogram ditunjukkan dengan terbentuknya
zona bening. Daerah yang membentuk zona bening merupakan daerah substrat kasein yang
telah didegradasi oleh enzim protease.

BAB III
PENUTUP
Kesimpulan
Hasil isolasi bakteri penghasil protease dari limbah cair tahu tertinggi yaitu isolat LnA4
yang merupakan bakteri Gram positif, katalase positif dan mempunyai sel yang berbentuk
batang. Hasil purifikasi parsial enzim yang diendapkan dengan ammonium sulfat
mempunyai nilai aktivitas spesifik enzim 7.13 U/mg dengan tingkat kemurnian 12.96 kali
dibandingkan enzim kasar. Enzim protease memiliki aktivitas optimum pada pH 7.5 dan
suhu

37

Nilai KM adalah

0.269

mg/mL dan

nilai Vmaks adalah

mg/mL/menit. Hasil elektroforesis SDS-PAGE dan zimogram

protein dengan aktivitas protease mempunyai berat molekul 29.71 kDa.

0.207

menunjukkan bahwa

DAFTAR PUSTAKA
Wardani, Agustin Krisna dan Lia. 2012. Purifikasi Dan Karakterisasi Protease Dari Bakteri
Hasil Isolasi Dari Wheytahu. Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 13 No. 3 [Desember 2012] 149156. Malang