TEHNIK ANALISIS BIOMOLEKULER

“PCR”

Oleh:

Farras Shanda 105130103111003

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012
 Polymerase Chain Reaction atau yang biasa disebut PCR adalah metode
untuk amplifikasi (memperbanyak) potongan DNA secara in vitro pada daerah
spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Teknik ini mampu
memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram dari DNA
template. Proses ini mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat
semi konservatif.Polymerase Chain Reaction (PCR) ini dapat digunakan untuk
amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA
yang mengalami mutasi, pada bidang kedokteran forensik dan melacak asal-usul
sesorang dengan membandingkan “finger print”.

Kemudian tahapan dari PCR ini yaitu

1) Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai
tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan
putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini,
seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang
sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90 oC – 95 oC. Durasi
tahap ini 1–2 menit.

2) Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang
spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan
hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template.
Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 oC – 60 oC. Selanjutnya, DNA
polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat
kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi
selanjutnya, misalnya pada 72 oC. Durasi tahap ini 1–2 menit.

3) Reaksi polimerisasi (extension) atau Perpanjangan

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu
72 oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi
3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA
polimerase. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.

Adapun macam-macam tipe dan modifikasi dari PCR adalah sebagai berikut:

a. Real-Time PCR
Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan
dari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time
polymerase chain reaction atau Q-PCR. Dimana teknik ini digunakan untuk
mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi)
jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real time PCR
memungkinkan dilalukan deteksi dan kunatifikasi (sebagai nilai absolut dari
hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap
input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap
sequens spesifik dari sampel DNA yang dianalisis. Pada analisa PCR
konversional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan
pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose
setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan
Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat
reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada
grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari
probe(penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi
membutuhkan tahap elektroforensis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel
agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan
senyawa karsinogenik. Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum
reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung
setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus
amplifikasi selesai.

b. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan kinetic
polymerase chain reaction. RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR,
dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Pada metode PCR biasa sumber
sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel atau jaringan.
Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan DNA melainkan RNA.
Sebagaimana kita ketahui, RNA merupakan asam ribonukleat rantai
tunggal, sedangkan DNA adalah asam ribonuleat rantai ganda. Ciri khas
RNA adalah tidak terdapat gugus basa timin (T) melainkan diganti oleh
urasil (U). Proses RT PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase,
karena hanya enzim jenis ini yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan
RNA karena polimerase DNA hanya dapat mensintesis dengan
menggunakan cetakan DNA. Pertama-tama RNA diubah dulu menjadi
 DNA dengan menggunkan enzime reverse transcriptase yang disebut
dengan komplemen DNA (cDNA) . dalam hal ini disintesis cDNA dari
perpasangan anatar gugus basa U dan A serta G dan C. Dari cDNA inilah
dilipat gandakan segemn DNA yang mirip urutan basa nukleotidanya
dengan RNA, hanya U diganti kembali ke T. Karena adanya penambahan
proses sintesis cDNA, tahapan proses PCR bertambah pula. Tahap pertama
terjadi proses anneling untuk memasangkan primer untuk memperpanjang
segmen cDNA. Setelah terbentuk segmen cDNA ini, baru kemudian masuk
kepada proses PCR biasa. RT-PCR peting digunakan sebagai alat diagnostik
untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus, sebagai informasi untuk
studi epidemiologi.
c. Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi)
sampel DNA menggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang
menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan
menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka
kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer
yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang
sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Nested PCR dan PCR biasa
berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah
banyak. Dimana pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan
pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu hasil
fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan
dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih
lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi
PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu,
keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan
amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer.

Mekanisme kerja dari nested PCR sendiri yakni pada Fase

Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase
penempelan. Fase Penempelan, sepasang primer pertama melekat di kedua
utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer
tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk
PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di mana pasangan
primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuen DNA spesifik yang
berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan
memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya
adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR
pertama.

d. Multiplex-PCR
 Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran
PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang
spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen
sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang
tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu
untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set primer
harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan
ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup
untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan
elektroforesis gel .

e. PCR-ELISA
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap
asam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang
terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR
akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan
pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih
karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR.
PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah
berkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk
PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequen
tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara
beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna
untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak
menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah
kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan
polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung
variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.
Resume jurnal

Judul jurnal: Development of a real-time RT-PCR for the detection of Swine-

lineage Influenza A (H1N1) virus infections

Judul: Pengembangan real-time RT-PCR untuk mendeteksi infeksi sebuah Virus

pada garis keturunan Flu Babi A (H1N1)

Dalam jurnal tersebut dijelaskan bahwa influenza virus A, subtipe H1N1

yaitu virus dari babi-garis keturunan (H1N1 SWL) telah menyebar dengan cepat ke
berbagai daerah di dunia dengan bukti penularan berkelanjutan dalam beberapa
negara. Kemudian untuk itu diperlukan cepat untuk mendeteksi dan
mendiferensiasi virus influenza tersebut , karena untuk kesehatan masyarakat dan
manajemen untuk pengawasan penyakit itu sendiri. Nah untuk itu penelitian ini
bertujuan untuk mengembangkan real-time transcriptase polymerase reaksi cepat
dan sensitif rantai terbalik (RtRT-PCR) untuk konfirmasi dari virus H1N1 SWL
tersebut.
Cara dari penelitian ini yaitu dengan langkah menggunakan rtRT-PCR
untuk menargetkan gen matriks dari novel influenza H1N1 SWL dan divalidasi
terhadap sebuah panel influenz A (H1N1 dan H3N2), flu babi H1N1 dan influenza
A/H5N1 virus burung. Validasi berikut assay ini kemudian digunakan secara
prospektif untuk mendeteksi H1N1 spesimen SWL positif dari wabah terbaru di
Inggris dan Republik Irlandia tersebut. Hasil dari satu penelitian H1N1 SWL
matriks dengan menggunakan rtRT-PCR berhasil mendeteksi H1N1 spesimen
SWL klinis dan tidak bereaksi silang dengan influenza musiman A, subtipe H1N1
dan virus H3N2 dan influenza babi A (H1N1). H1N1 SWL uji matriks tidak
bereaksi silang dengan H5N1. Lalu H1N1 SWL uji matriks kemudian dibandingkan
dengan dua tes lainnya yaitu menggunakan serangkaian pengenceran dan panel dari
influenza A untyped klinis yaitu dengan diambil sampel positifnya. Jadi Hasil ini
menunjukkan bahwa rtRT-PCR sensitif atau lebih cepat dan bisa diterapkan pada
universal influenza A untuk mendeteksi virus H1N1 SWL, yaitu subtipe H1N1 dari
virus babi yang berasal dari garis keturunan.