Standar Mikrobiologi dan Uji

Mikrobiologi untuk Bahan

dan Produk Farmasi
Marlia Singgih Wibowo
Bahan Farmasi

 Bahan baku
 Air murni (Purified Water)
 Produk Farmasi Steril (Sterile
Pharmaceuticals)
 Produk Farmasi Non-Steril (Non-Sterile
Pharmaceuticals)
 Produk kosmetik, alat kesehatan, PKRT,
suplemen makanan
Mengapa diperlukan kualitas mikrobiologi
dalam produk farmasi?
Produk harus bermanfaat dan aman
Mikroorganisme patogen → Bagaimana
mikroorganisme patogen dapat mengkontaminasi
produk
Bagaimana mendeteksi mikroorganisme patogen
dan bagaimana menghitung jumlahnya
Analisis kualitatif dan kuantitatif
BAHAN BAKU FARMASI

Bahan baku untuk produk farmasi dapat

berupa bahan kimia atau bahan yang
berasal dari alam
Bahan yang berasal dari alam lebih
cenderung terkontaminasi mikroorganisme
lebih berat dibandingkan bahan sintetik
kimia
Kategori Bahan Baku Alam (Grigo, 1976)

1. Bahan baku hasil sintesis atau ekstrak bahan

alam yang sudah dimurnikan (rata-rata 10
cfu/g atau mL)
2. Bahan baku hasil sintesis dan dari bahan alam
(rata-rata 102 cfu/g atau mL)
3. Ekstrak tanaman (rata-rata 103 cfu/g atau mL)
4. Produk hewan atau tanaman yang sedikit
mengalami proses (rata-rata 104 cfu/g atau
mL)
5. Produk hewan atau tanaman yang tidak
mengalami proses (rata-rata 105 cfu/g atau
mL)
Mikroorganisme kontaminan yang sering
dijumpai dalam bahan baku alam
 Bacillus
 Enterobacteriaceae
 Staphylococcus
 Aspergillus
E.coli
 Penicillium
 Mucor
 Rhizopus

Salmonella
AIR

 Air minum (potable water) : tidak boleh ada

Coliform bacilli per 100 ml
 Air untuk injeksi :
 < 0,25 endotoksin unit (EU) per ml.
 Batas mikroba < 10 cfu per 100 ml
 Tidak ada Pseudomonas
 Air untuk sediaan non-steril :
o Kisaran dari <10 sampai < 100 cfu per 100 ml
o Tidak ada Pseudomonas
Produk Farmasi Steril
 Untuk produk parenteral, sediaan obat mata,
termasuk larutan lensa kontak , dan produk-produk
yang diberikan pada luka terbuka atau untuk proses
irigasi rongga tubuh.
 Uji sterilitas perlu dilakukan
 Syarat Steril : Sterility Assurance Level dengan
probabilitas sama atau lebih baik dari 10 -6, artinya
dalam satu juta sediaan steril hanya boleh
maksimum 1 yang tidak steril.
 Analisis sterilitas adalah berdasarkan tidak adanya
pertumbuhan mikroba pada media Fluid
Thioglycollate (FTM) dan Soyabean Casein Digest
(SCD)pada 30-35°C (bakteri) dan 20-25°C (fungi)
selama 7 dan 14 hari.
Produk Farmasi Non-Steril

 Tidak ada aturan tunggal yang mengatur,

tergantung pada farmakope negara masing-
masing
 Tidak mengandung mikroba yang dapat
menyebabkan infeksi akibat penggunaan obat
tersebut (medication-borne infection)
 TVC (Total Viable Count) dalam jumlah tertentu
dan tidak adanya patogen enterik dalam bahan
baku nya.
 Persyaratan Kualitas Mikrobiologi
Sediaan Farmasi versi FIP (1976)
Gol. Jenis Sediaan Persyaratan

1a Injeksi Steril – Farmakope

1b Obat mata, sed.utk bgn tubuh Bebas mikroba yang memp.daya hidup/g atau
yg bebas mikroba, sed.utk luka mL
bakar, tukak berat

2 Sed. topikal pada lesi kulit, Mikroba yg memp.daya hidup maks 102 /g atau
hidung, tenggorokan (resiko mL, dan tidak mengandung Enterobacteriaceae,
tinggi) P.aeruginosa, S.aureus

3 Sediaan lain Mikroba yg memp.daya hidup maks 103 – 104

bakteri anaerob, 102 ragi dan kapang /g atau mL,
Batas mikroba spesifik : tdk ada E.coli, dan tidak
mengandung Salmonella, P.aeruginosa,
S.aureus,
Enterobacteriaceae lain maks. 102 /g atau mL
Batas kontaminan mikroba pada bahan dan
sediaan obat asal tanaman (versi UNIDO,1990)
Bahan/ Bakteri Ragi dan Baketri Salmonella Staphylococcus
Sediaan kapang coliform

Sediaan < 104 /g < 102 /g - - -

obat asal
tanaman

Bahan < 107 /g < 104 /g - - -

obat asal
tanaman

Ket.: (-) tidak boleh ada

UNIDO (United Nation Industrial Development Organization)
Uji Mikrobiologi yang Tercantum pada
Farmakope Indonesia edisi IV
Uji secara Mikrobiologi
<51> Uji Batas Mikroba
<61> Uji Efektivitas Pengawet
<71> Uji Sterilitas
Uji dan Penetapan secara Biologi
<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12
<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat
<131> Penetapan Potensi Antibiotik secara
Mikrobiologi
<51> Uji Batas Mikroba
 Dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba
aerob viabel di dalam semua jenia perbekalan
farmasi, mulai dari bahan baku hinga sediaan jadi
 Untuk menyatakan bahwa perbekalan farmasi
tersebut bebas dari spesies mikroba tertentu
 Pengerjaan harus dilakukan secara aseptik
 Jika tidak dinyatakan lain, “inkubasi” adalah
menempatkan wadah di dalam ruang terkendali
secara termostatik pada suhu antara 30 – 35°C
selama 24 – 48 jam
 Istilah “tumbuh” ditujukan untuk pengertian adanya
dan kemungkinan adanya perkembangan mikroba
viabel
<61> Uji Efektivitas Pengawet
 Pengertian Pengawet Antimikroba : zat yang
ditambahkan pada sediaan obat untuk melindungi
sediaan terhadap kontaminasi mikroba.
 Pengawet terutama digunakan pada wadah dosis ganda
 Pengawet tidak boleh digunakan semata-mata untuk
menurunkan jumlah mikroba viabel sebagai pengganti
cara produksi yang tidak baik
 Kadar yang digunakan harus serendah mungkin
 Pengujian dalam farmakope dimaksudkan untuk menguji
efektivitas pengawet yang ditambahkan pada sediaan
dosis ganda yang dibuat dengan dasar atau bahan
pembawa cairan
 Pengujian dan persyaratan hanya berlaku pada produk
di dalam wadah asli yang belum dibuka , yang
didistribusikan oleh produsen
<71> Uji Sterilitas

 Digunakan untuk menetapkan apakah bahan atau

produk farmasi yang harus steril memenuhi syarat
berkenaan dengan uji sterilitas seperti yang tertera
pada masing-masing monografi bahan atau produk
 Untuk penggunaan prosedur uji sterilitas sebagai
bagian dari pengawasan mutu di industri, tertera
pada <1371> Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas
Bahan Kompendia
 Mengingat kemungkinan hasil positif dapat
disebabkan oleh pengerjaan yang salah atau
kontaminasi lingkungan, diberlakukan pengujian 2
tahap seperti yang tertera pada bagian :
Penafsiran Hasil Uji Sterilitas
 Prosedur alternatif dapat digunakan asal hasil yang
diperoleh sekurang-kurangnya setara keandalannya
→ Lihat Prosedur pada Uji dan Penetapan dalam
Ketentuan Umum
 Jika timbul perbedaan, dan adanya kontaminasi
terdapat pada hasil dari prosedur Farmakope, maka
hasil harus dinyatakan sebagai tidak memenuhi
syarat.
<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12

 Dilakukan menggunakan bakteri uji

Lactobacillus leichmanii dengan metode
turbidimetri
 Pembanding larutan baku Sianokobalamin BPFI
berkisar antara 0,01 – 0,04 ng per mL. Blanko
menggunakan air.
 Metode spektrofotometri pada panjang
gelombang 530 nm.
 Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku
<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat

 Dilakukan menggunakan bakteri uji

Lactobacillus plantarum dengan metode
turbidimetri
 Pembanding larutan baku Kalsium pantotenat
BPFI berkisar antara 0,01 – 0,04 µg per mL.
Blanko menggunakan air.
 Metode spektrofotometri pada panjang
gelombang 660 nm.
 Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku
<131> Penetapan Potensi Antibiotik secara
Mikrobiologi
 Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapat
ditunjukkan pada kondisi sesuai dengan efek
daya hambatnya terhadap mikroba uji
 Perbedaan kadar dan potensi
 Dua metode umum : cara lempeng dan cara
tabung
 Cara lempeng : menggunakan kertas cakram
atau selinder baja, efek difusi antibiotik pada
medium agar.
 Cara tabung : turbidimetri, efek larutan antibiotik
terhadap turbiditas mikroba
Tahapan analisis mikrobiologi
Penyiapan metode, alat dan bahan pereaksi
↓
Identifikasi sampel
↓
Sampling
↓
Analisis kualitatif
↓
Analisis kuantitatif
↓
Kesimpulan
Uji pada Pengawasan Kualitas Mikrobiologi
pada Produk Farmasi dan Makanan
Jenis Uji Mikrobiologi

Uji langsung
Teknik kultur
Metode Enumerasi
Metode Alternatif
Metode Cepat
Uji Langsung

 Pengamatan langsung
dengan mata
(makroskopik)
 Pengamatan di bawah
mikroskop (mikroskopik)
 Metode pewarnaan
 DEFT (Direct
Epifluorescent Filter
Technique)
 Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) :
morfologi mikroorganisme, warna spora, warna dan bentuk
koloni
 Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) : bentuk dan
motilitas mikroorganisme, bentuk dan warna hifa. Ada dua
jenis mikroskop : optik dan fase kontras
 Metode pewarnaan : pewarnaan gram untuk bakteri
 DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) : Sampel
disaring dengan filter, bakteri diwarnai dengan zat warna
tertentu lalu dilihat di bawah mikroskop epifluoresens
Morfologi Aspergillus niger
di bawah mikroskop
DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)
Filter membran polikarbonat
Zat warna senyawa fluorokromatis yang
berfluoresensi setelah berikatan
Acridine orange :
Ikatan denan dsDNA : hijau
Ikatan dengan ssRNA : oranye
Ikatan dengan sel hidup : kuning
Ikatan dengan sel mati : hijau terang
Teknik Kultur

Walaupun berbagai metode analisis cepat

dan sensitif telah dikembangkan untuk
identifikasi dan karakterisasi mikroba
patogen, teknik pembiakan mikroba di dalam
medium mikrobiologi masih diperlukan
terutama untuk konfirmasi identitas. Media
mikrobiologi yang sering digunakan
umumnya adalah medium padat atau cair.
Medium padat umumnya mengandung
agar.
Kultur pada media agar
 Tujuan Isolasi
 Tujuan Determinasi
 Tujuan Penyimpanan
 Tujuan Pertumbuhan
 Tujuan Produksi
 Tujuan Analisis
Metode Enumerasi

 Plate Count : metode perhitungan mikroba

yang ditumbuhkan di atas cawan petri
 MPN Count (Most probable Number) : metode
perhitungan relatif berdasarkan fenomena
kekeruhan
 Analisis Fisikokimia : metode perhitungan
mikroba berdasarkan komponen sel atau
metabolit yang dihasilkan
Metode Alternatif

 Uji Biokimia
 Dye-reduction Test
 Electrical Methods
 ATP Determination
 Biochemical Methods: Enzymes

An APIZYM strip

Enzymes tested for include: acid/alkaline phophatase,

trypsin, chymotrypsin, galactosidase, glucosidase,
glucuronidase, proteases, fucosidase.

M. Ryan
Biochemical Methods: Metabolites

Thin Layer Chromatography of Secondary Metabolites

(Example of Patulin production by Penicillium spp.)
Dye-reduction Test
 Berdasarkan reaksi redoks dari suatu zat warna (dye)
 Dye akan mengambil elektron dari suatu sistem biologi
yang aktif dan akan menghasilkan perubahan warna
 Umumnya bentuk teroksidasi akan berwarna dan bentuk
tereduksi tidak berwarna
 Contoh dye yang sering digunakan : metilen blue,
resazurin, trifeniltetrazolium klorida
Electrical Methods

Ketika mikroorganisme tumbuh, aktivitasnya akan

menyebabkan perubahan komposisi medium dan
oleh karenanya akan merubah sifat elektriknya.
Sifat elektrik yang dapat diukur : konduktansi,
kapasitans, dan impedansi
Penetapan ATP

ATP ditemukan dalam aktivitas sel hidup yang

melakukan metabolisme
Diukur melalui aktivitas enzim luciferase dan
substrat luciferin menghasilkan pendaran cahaya
(chemiluminesence)
ATP assay

Luciferin + Luciferace + ATP

Luciferin-Luciferace-AMP + PP + O2

Oxyluciferin-Luciferase-AMP + H2O

Oxyluciferin + Luciferase + AMP + hµ (560 nm)

Metode cepat

 Metode Imunokimia
 Metode Biologi molekuler
Metode Imunokimia
Prinsip analisis : berdasarkan reaksi Antigen-
Antibodi
Komponen sel atau metabolit sel mikroba
bertindak sebagai antigen, direaksikan dengan
pereaksi (suatu Ab yang spesifik) menghasilkan
kompleks Ag-Ab
Kompleks Ag-Ab divisualisasi dengan berbagai
cara yang dapat diukur (spektrofotometri,
spektofluorometri, dll.)
Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)

Konjugat
enzim pada
Antigen Ag-Ab
Kompleks Ag-
Ab
Substrat
Antibodi
Reaksi Produk
enzimatik berwarna
 Jenis Metode Imunokimia

EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay)

RIA (Radio Immuno Assay)
IFA (Immuno Fluoresence Assay)
LIA (Luminescence Immuno Assay)
Metode Molekuler

Cara Hibridisasi
Cara Amplifikasi
Teknik hibridisasi

Proses denaturasi dsDNA menjadi ssDNA

menggunakan pemanasan
Kombinasi ssDNA tersebut dengan suatu segmen
ssDNA lain yang telah di beri probe (label)
Hibrid DNA yang telah mengandung label dapat
dideteksi dengan berbagai
Teknik amplifikasi

 PCR (polymerase chain reaction) : reaksi polimerisasi

berantai
 DNA target didenaturasi menggunakan panas
 Pelekatan primer (suatu oligonukleotida pendek) yang
komplemen dengan salah satu ujung ssDNA
 Sintesis DNA yang diawali dari primer
 Proses pengulangan 20 – 50 x
Proses PCR
3’ 5’
5’ 3’

Denaturasi pada 94 °C
3’ 5’

5’ 3’
Annealing primer pd 72°C

3’ 5’

5’ 3’
3’ 5’
Polimerisasi
5’ 3’ pada 72 °C

3’ 5’ dsDNA baru

5’ 3’ dsDNA baru

Proses berulang
Denaturasi

Annealing

Polimerisasi
Proses setelah PCR

Setelah pengulangan 20 – 50 x diperoleh jumlah

fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat
di deteksi
Produk PCR dapat dideteksi dengan elektroforesis
DNA
Pita-pita DNA dibandingkan dengan marker DNA
 Elektroforesis DNA

DNA
marker Produk PCR
PCR Fingerprints of Replicates of an isolate
of Metarhizium anisopliae, After 2 Years of
Preservation with Mr Primer

L to R:1,18 100 bp ladder,2-6 lyophilised ,7-11 mycelial plugs in

water , 12-16 cryopreserved, 17 control
M. Ryan