Halaman 1

ARTIKEL ASLI
Peran Reaksi Rantai Polimerase (PCR)
Dalam deteksi resisten antibiotik
Staphylococcus aureus
Rajeh Ali
a,
* , Kamal Al-Achkar
Sebuah , 1
, Ayman Al-Mariri
b,1
, Mazen Safi
b,1
Departemen Biologi Tanaman, Fakultas Sains, Universitas Damaskus. Suriah
b Departemen Bioteknologi dan Biologi Molekuler, Komisi Energi Atom Suriah, Suriah
Diterima 24 Maret 2014; Diterima 15 Mei 2014
Tersedia online 20 Juni 2014
KATA KUNCI
S. aureus;
16S rRNA;
Gen Gap;
Gen nuk;
PCR;
Antibiotik
Abstrak Latar Belakang: Staphylococcus aureus terutama diperoleh dari infeksi
rumah sakit dan
Menunjukkan kemampuan mengembangkan resistensi terhadap banyak
antibiotik. Reaksi Rantai Polimerase
(PCR) digunakan untuk mengidentifikasi isolat resisten antibiotik. Penelitian ini
dilakukan di Al-Mujtahed,
Al-Mouwasat dan Rumah Sakit Anak-anak di Damaskus selama periode antara
Januari dan Juni
Pada tahun 2013.
Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui S. aureus di beberapa sampel
klinis dengan PCR dan studi
Resistensi bakteri terhadap beberapa antibiotik.
Bahan dan metode: fragmen DNA diamplifikasi dari DNA terisolasi. PCR dulu
Memperkuat urutan 16S rRNA, gen gap dan gen nuk tergantung pada enam primer
spesifik.
Produk PCR dideteksi dengan elektroforesis gel agarose. Uji kepekaan antibiotik
Dilakukan pada semua isolat dengan menggunakan metode difusi disk Kirby-
Bauer pada agar Mueller Hinton
Dan Luria Bertani (LB) Agar.
Hasil: Delapan puluh satu isolat S. aureus dikumpulkan dari sampel darah, sampel
urin dan
Sekresi bronkus. Hasilnya menunjukkan bahwa fragmen DNA 16S rRNA, gen gap
dan nukleotida
Gen masing - masing kurang lebih sama dengan 479 bp, 933 bp dan 270 bp, dan
hasilnya
Resistensi antibiotik untuk 10 antibiotik yang diuji adalah sebagai berikut:
Chloramphenicol (97,5%),
Tetracycline (50,6%), Cefuroxime (37,0%), Oxacillin (33,3%), Levofloxacin
(37,0), Eritromisin
(35,8%), Ciprofloxacin (32,1%), Rifampisin (7,4%), Vancomycin (3,7%),
Imipenem (0%).
* Penulis yang sesuai. Tel .: +963 999198105.
Alamat E-mail: rajihali@yahoo.com (R. Ali), ascientific1@aec.org.
sy (A. Al-Mariri), ascientific@aec.org.sy (M. Safi).
1 Tel.:+963 11 2.132.580.
Tinjauan rekan di bawah tanggung jawab Universitas Ain Shams.
Produksi dan hosting oleh Elsevier
Mesir Journal of Medical Human Genetics (2014) 15 , 293 -298
Universitas Ain Shams
Jurnal Mesir Genetika Manusia Medis
Www.ejmhg.eg.net
Www.sciencedirect.com
1110-8630 Ó 2014 Produksi dan hosting oleh Elsevier BV atas nama Ain Shams
University.
Http://dx.doi.org/10.1016/j.ejmhg.2014.05.003

Halaman 2
Kesimpulan: Penelitian ini menunjukkan bahwa PCR adalah metode yang spesifik
dan efektif untuk mengklasifikasikan
dan mengidentifikasi isolat S. aureus, yang menunjukkan meningkatnya resistensi
terhadap banyak
antibiotik.
Ó 2014 Produksi dan hosting oleh Elsevier BV atas nama Ain Shams University.
1. Perkenalan
S. aureus dianggap sebagai faktor penting infeksi baik
Didapat dari infeksi masyarakat atau rumah sakit. Bisa juga
Menyebabkan komplikasi serius, seperti pneumonia, septikemia,
arthritis dan osteomyelitis [1] . Selama lima dec-
ades, S. aureus dikloning sebagai methicillin-resistant (MRSA)
Mengakibatkan masalah medis dan kesehatan masyarakat di seluruh dunia
[2] . Ini bertanggung jawab atas penyakit yang disebabkan oleh produksi exotoxin
(Kejutan toksik dan sindrom kulit tersumbat staphylococcal). Saya t
Diisolasi dari invasi langsung, seperti saluran kemih infec-
tion (ISK) dan terisolasi dari Unit Perawatan Intensif [3,4] .
Selain itu, S. aureus bertanggung jawab untuk banyak supuratif
Lesi dan menunjukkan kemampuan mengembangkan resistansi
Ke banyak antibiotik terutama di antara pasien yang berada
di rumah sakit [5] . Methicillin-resistant S. aureus yang diberikan
Oleh kromosom mimisan staphylococcal mec (SCCmec)
Elemen, yang membawa gen mecA yang mengkodekan penisilin-
Mengikat protein homolog (PBP2a), dengan afinitas rendah
untuk b-laktam antibiotik [6] . Beberapa laporan mengungkapkan hal itu
S. aureus berkembang resistensi terhadap banyak kelas antibiotik [7] .
Munculnya antibiotik-resistance S. strain aureus
Mengakibatkan kesulitan pengobatan yang signifikan yang dipaksakan
Membebani sistem perawatan kesehatan dan sekaligus mengintensifkan
kebutuhan untuk antibiotik baru [8] . Baru-baru ini berbasis PCR
Metode molekuler dikembangkan sebagai cara alternatif untuk
identifikasi akurat [9] . Amplifikasi gen 16S rRNA
Urutan (479 bp) adalah metode yang paling umum digunakan
Mengidentifikasi dan mengklasifikasikan bakteri, termasuk stafilokokus
[10,11] . Laporan tersebut menunjukkan bahwa urutan dari gap tersebut
Gen (933 bp) terdiri dari 12 spesies yang relevan untuk manusia.
Gen kesenjangan mengkodekan protein pengikat transfer 42 kDa
(TPN) yang terletak di dalam dinding sel dari Staphylococci [12] .
Gen kesenjangan juga mengkodekan enzim dinding sel (Glyceraldehyde-
3-fosfat dehidrogenase) dan telah umum con-
sidered gen housekeeping konstitutif [12,13] . Identifikasi
S. aureus menggunakan PCR amplifikasi gen nuc
(270 bp) dianggap sebagai metode standar emas [14] . SEBUAH
Gen nuk mengkode enzim termonuklease di mana pengalaman-
Ments menyarankan peran utama untuk nuc1 dalam hal termo-
aktivitas nuklease di S. aureus [15] . Gen nuc di S. aureus
Mengkodekan enzim termonuklease dan amplifikasi nukleus
gen potensi untuk diagnosis cepat infeksi S. aureus [16] .
2. Bahan dan metode
2.1. Identifikasi bakteri
Dalam penelitian ini 81 isolat S. aureus diselidiki dari dif-
Sumber ferent, seperti sampel darah, sampel urin, bronkial
Sekresi. Penelitian ini dilakukan di Al-Mujtahed, Al-
Mouwasat dan The Children Hospitals di Damaskus. Iso-
Lates dikultur pada Luria Bertani Agar (LB Agar) dan
Agar Garam Mannitol (MSA). Pewarnaan Gram dilakukan untuk
Semua isolat yang kemudian diperiksa di bawah mikroskop.
2.2. Isolasi DNA
S. aureus dikultur pada 5 ml Luria Bertani kaldu dan incu-
Bated pada 37 ° C selama 24 jam. Setelah itu, 1,5 ml kultur
Disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Pelet
Ditunda kembali pada buffer 566 μl Tris-EDTA dengan cara berulang
Pipetting atau vortexing. 3 μl SDS 10% dan 3 μl 20 mg /
Ml proteinase K ditambahkan, dicampur dan diinkubasi selama 1 jam pada
37 ° C dengan gemetar (1000rpm) dalam mesin termomiks.
Setelah itu, 80 μl Cetyl trimethyl ammonium bromide
(CTAB) / larutan NaCl ditambahkan, dicampur dan diinkubasi
10 menit pada suhu 65 ° C dengan gemetar (1000 rpm). Volume kloro-
Bentuk / isoamil-alkohol sama dengan (700 μl) ditambahkan, dicampur,
Disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan (14.000 rpm) dan super-
Natant dipindahkan ke tabung segar. Setelah itu, sebuah volume
Fenol / kloroform / isoamil-alkohol sama dengan (600 μl) adalah
Dicampur selama 5 menit, disentrifugasi dan supernatan dipindahkan
Ke tabung segar, kemudian 0.6vol isopropanol (300 μl) adalah
Ditambahkan dan dicampur lembut sampai DNA diendapkan
Disentrifugasi selama 5 menit dan supernatan dibuang.
Supernatan dicuci dengan 1 ml etanol 70%, dicampur,
Disentrifugasi selama 5 menit, dan supernatan dibuang
Itu dikeringkan selama 10 menit pada kecepatan vac / 45 ° C. Akhirnya itu
Diganti kembali dalam buffer 100 μl TE. Konsentrasi DNA
Dibaca menggunakan 2 μl pada mesin Nanodrop dengan menggunakan buffer TE
sebagai
Kosong dan konsentrasi masing-masing mencapai 100 ng / μl
mencicipi.
2.3. Amplifikasi DNA dengan PCR
RRNA 16S diperkuat dengan sepasang primer spesifik, a
25 nukleotida primer forward: 16SF1 (5 -GGAATTCAAAGG
0

AATTGACG GGGGC-3 dan 29-nukleotida membalikkan pri

0)

mer: 16SR2 (5 -CGGGATC CCAGGCCCGGGAACGTATT-

0

CAC-3 [10] . Primer rRNA 16S memberikan produk PCR

0)

Sama dengan (479 bp). Gen gap diperkuat dengan sepasang

primer spesifik, 26-nukleotida primer forward: GF1 (5 -0

ATG GTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA-3 dan 25- 0)

nucleotide reverse primer: GR2 (5 -GACATTTCGTTATCA

0

TACCAAGCTG-3 [12] . Primer gen gap memberi a

0)

Produk PCR sama dengan (933 bp). Akhirnya gen inti itu
Diperkuat dengan primer tertentu, sebuah depan 21 nukleotida pri-
mer: NF1 (5 -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 dan 25-
0 0)

nucleotide reverse primer: NR2 (5 -AGCCAAGCCTTGAAC

0

GAACTAAAGC-3 [14] . Primer gen inti memberi a

0

Produk PCR sama dengan (270 bp). Campuran reaksi berikut-

Ture ditambahkan ke setiap sampel: 2 μl DNA (100 ng), 2 μl primer
(100 pmol), campuran PCR (1,5 ml MgSO 2,5 ml 10 · PCR buf-
4,

Fer, 0,5 μl dNTPs, 0,2 μl Taq polimerase) dan selesai untuk

25 Volume ml dengan H O. denaturasi awal pada 95 ° C selama 5 menit
2

Diikuti oleh 37 siklus amplifikasi (denaturasi pada

294
R. Ali dkk.

Halaman 3
95 ° C selama 30 detik, annealing pada suhu 55 ° C selama 30 detik dan
perpanjangan pada
72 ° C selama 60 detik) dan diakhiri dengan ekstensi akhir pada 72 ° C untuk
10 menit. Untuk visualisasi produk, 10 μl masing-masing
Reaksi PCR dicampur dengan 5 μl 5 · loading dye dan loaded
Pada gel agarosa 1,5% untuk elektroforesis dan visualisasi
Produk PCR yang diperkuat. Berat molekul 100bp
Tangga DNA digunakan untuk validasi panjang ampli-
Produk fied (Vivantis Technologies).
3. Tes Kecacatan Antibiotik
Uji kepekaan antibiotik dilakukan pada semua iso-
lates S. aureus dengan metode difusi disk. Setelah kaldu
budaya, isolat S. aureus diinkubasi pada 37 ° C selama
18-24 jam, kultur segar disiapkan untuk mengoles antibiotik
Tes kerentanan 100 μl dari masing-masing suspensi isolat tersebut
Dikultur pada agar LB atau agar Mueller Hinton dengan kapas.
Uji kecacatan antibiotik isolat dipelajari
Melawan sekelompok sepuluh cakram antibiotik yang berbeda. Piring
Diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 18-24 jam. Zona penghambatan diameter
Diukur dan dipelajari dengan menggunakan norma-norma Nasional
Komite Standar Laboratorium Klinik (NCCLS).
4. Hasil
4.1. Identifikasi bakteri
Isolat S. aureus dikultur pada LB agar dan MSA medi-
Ums Isolat menunjukkan koloni kuning pada media agar LB ( Ara
1 ). Mereka difermentasi manitol dalam media MSA dan diproduksi
koloni berwarna kuning yang dikelilingi oleh kuning ( Gambar 2 ). S. aur-
EUS diidentifikasi sebagai cocci positif Gram di anggur seperti cluster
Di bawah mikroskop
4.2. Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi PCR dari rRNA 16S, gen gap dan gen nukleus
dilakukan untuk semua isolat untuk mendeteksi spesies S. aureus.
Dalam penelitian ini enam primer spesifik digunakan untuk mendeteksi
Daerah rRNA 16S, gen kesenjangan dan gen nukleus. Pendeteksian dan
Identifikasi bakteri berdasarkan rRNA 16S mereka miliki
Banyak keuntungan Misalnya, setiap sel bakteri mengandung
Banyak salinan rRNA 16S dalam ribosomnya. Dalam penelitian ini
Produk PCR muncul sebagai DNA single band dengan ukuran
Sama dengan fragmen 479bp yang sesuai dengan rRNA 16S
( Gambar 3 ). Gen kesenjangan dikodekan ke enzim gliseraldehida-3-
Fosfat dehidrogenase ditemukan di dinding sel
S. aureus dan lainnya koagulase staphylococcus negatif. Ini
Studi menunjukkan produk PCR dari gap gen sebagai single band
DNA dengan ukuran sama dengan 933 bp fragmen ( Gambar 4 ). Inti
Gen yang dikodekan ke enzim thermonuclease digunakan untuk detec-
tion dari S. aureus menyebabkan bakteremia. Akhirnya produk PCR
Muncul satu pita DNA dengan ukuran sama dengan 270bp
fragmen yang sesuai dengan gen nuc ( Gambar 5 ). Semua isolat
S. aureus memberikan yang sesuai PCR band setara
Ke daerah rRNA 16S, gen gap dan gen nukleus.
4.3. Uji kepekaan antibiotik
Uji kepekaan antibiotik dievaluasi oleh disk diffu-
Metode sion untuk semua isolat S. aureus ( Gambar 6 ). Isolat S.
aureus menunjukkan tingkat yang berbeda resistensi terhadap beberapa antibi-
Otics. Zona penghambatan diameter diukur tergantung pada
NCCLS Gambar 7 ). Hasil uji kepekaan antibiotik
Untuk 10 antibiotik berbeda adalah sebagai berikut: Chloram-
Phenicol (97,5%), Tetracycline (50,6%), Cefuroxime (37,0%),
Levofloxacin (37,0), Eritromisin (35,8%), Ciprofloxacin
(32,1%), Rifampisin 7,4%), Oxacillin (33,3%), Vancomycin
(3,7%) dan Imipenem (0%), ( Tabel 1 & Gambar 8 ).
5. Diskusi
S. aureus menyebabkan banyak masalah di banyak rumah sakit di seluruh dunia
Dan ini menunjukkan peningkatan resistensi terhadap banyak antibiotik-
Otics. Dalam penelitian ini hasil kultur bakteri secara total
dari 81 isolat LB agar dan MSA mengungkapkan S. aureus dengan
Semua isolat tampak sebagai gram positif. Beberapa laporan menunjukkan
Bahwa beberapa laboratorium di negara berkembang tampil
skrining untuk dugaan S. aureus berdasarkan pertumbuhan pada
(MSA) dan / atau tes DNase [17] . Dalam penelitian ini S. aureus
Diidentifikasi dan diklasifikasikan berdasarkan PCR dengan menggunakan primer
khusus untuk
Gen housekeeping pada bakteri ini, seperti 16S rRNA
Daerah, gen kesenjangan dan gen nukleus. PCR tergantung pada diag-
protokol nostic digunakan untuk mendeteksi gen yang berbeda [18] . Saya t
Telah juga ditemukan fragmen dari daerah rRNA 16S
Dari semua isolat sama dengan 479 bp ( Gambar 1 A). RRNA 16S
Gambar 1
S. aureus pada LB Agar.
Gambar 2
S. aureus pada (MSA).
Peran polymerase chain reaction dalam mendeteksi Staphylococcus aureus
295

Halaman 4
dan 21 protein terdiri 30S subunit [19] . RRNA 16S
digunakan untuk mendeteksi isolat S. aureus pada pasien dengan otak
Abses dan laporan menunjukkan fragmen 16S rRNA
adalah sama dengan 479 bp [10,20] . Gen kesenjangan digunakan dalam hal ini
Penelitian untuk mendeteksi Staphylococcus sp., dan produk PCR untuk
kesenjangan fragmen gen di S. aureus adalah sama dengan 933 bp ( Gambar 1 B).
Gen gap mengkode enzim (gliseraldehid-3-fosfat
Dehidrogenase) dan analisis enzim mewakili high-
Metode throughput reproduktif yang memungkinkan identifikasi
spesies Staphylococcus dari yang berbeda [21] . Gen inti adalah awal
dalam identifikasi dan klasifikasi S. aureus dan di Pres- yang
ent mempelajari fragmen gen nuc itu sama dengan 270 bp ( Gambar 1 C).
Beberapa laporan menunjukkan bahwa gen inti dikodekan
Enzim thermonuclease dan fragmen panjang gen nukleus
adalah sama dengan 270 pb [22] . Dalam penelitian kami isolat S. aureus
Mengungkapkan resistensi yang meningkat terhadap banyak antibiotik, seperti
Kloramfenikol sementara mereka tampak sensitif terhadap antibiotik lain-
Otic seperti Vancomycin. 97,5% isolat S. aureus yang Chlor-
Tahan amfigenis, 50,6% tahan terhadap tetracycline dan
3,7% resisten vankomisin. Dalam laporan lain, persen-
usia Tetracycline tahan S. aureus isolat adalah sama dengan
47,4% atau 60,4% [23,24] . Sebagian besar isolat S. aureus yang sensi-
Bagi Vancomycin dan semua isolat sensitif terhadap Rifampi-
Cin. Laporan menunjukkan bahwa semua sampel klinis S. aureus
resisten terhadap Vancomycin [22,24] , sedangkan 3,85% dari
Gambar 3
Gel elektroforesis menunjukkan fragmen 16S rRNA dari S. aureus, M: DNA
marker, Sa S. aureus.
(1-5):

Gambar 4
Gel elektroforesis menunjukkan fragmen gen gap pada
S. aureus, M: DNA marker, Sa S. aureus.
(1-3):

Gambar 5
Gel elektroforesis menunjukkan fragmen gen inti dari
S. aureus, M: DNA marker, Sa S. aureus.
(1-3):

Gambar 6
Metode difusi cakram dengan zona hambatan untuk beberapa
antibiotik terhadap S. aureus.
Gambar 7
Metode difusi cakram dengan zona Chloramphenicol
Diameter sama dengan 0 mm dan diameter zona Vancomycin P20 mm.
296
R. Ali dkk.

Halaman 5
Sampel klinis tahan Rifampisin dan Rifampisin
adalah antibiotik penting dalam pengobatan infeksi S. aureus
dan TBC [25,26] . Sebagian besar laporan menyarankan Vanco-
mycin sebagai obat yang kredibel untuk mengobati S. aureus infeksi [27,28] .
Dengan demikian, hasil penelitian ini membuktikan bahwa PCR adalah a
Metode spesifik dan efektif untuk mengklasifikasikan dan mengidentifikasi
isolat S. aureus dan bahwa mereka menunjukkan peningkatan resistensi
Melawan banyak antibiotik.
6. Kesimpulan
Dalam penelitian ini hasil penelitian menunjukkan bahwa identifikasi dan
klasifikasi-
fying S. aureus oleh PCR adalah standar emas. Isolat dari
S. aureus menunjukkan peningkatan resistensi terhadap banyak antibiot-
Ics sebagai Chloramphenicol, Levofloxacin dan Eritromisin,
Sementara mereka sensitif terhadap antibiotik lain, seperti
Vancomycin dan Imipenem. Vancomycin masih yang paling
obat yang efektif terhadap infeksi S. aureus seperti yang dijelaskan perma-
Oleh dokter di rumah sakit di Damaskus.