HPLC Ii PDF
HPLC Ii PDF
Indah Solihah
Teknik Elusi
Isokratik:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak tetap (polaritas tetap) selama proses
kromatografi berlangsung
Gradien:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)
selama proses kromatografi berlangsung
2 HPLC-2011
Teknik Isokratik
3 HPLC-2011
Eluen= campuran A + B
50 % B
40 % B
4 HPLC-2011
30 % B
35 % B
5 HPLC-2011
Teknik Gradien
Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,
kemudian dilakukan
teknik elusi gradien
6 HPLC-2011
Hasilnya
7 HPLC-2011
Normal-Phase HPLC
[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]
Senyawa polar:
- terelusi belakangan (tR panjang)
- semakin non-polar fase gerak, tR senyawa
polar makin panjang
Solven:
- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform
Eluent strength:
- dimodifikasi dengan n-heksan
8 HPLC-2011
Reversed-Phase HPLC
Reversed-Phase HPLC
[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]
Senyawa polar:
- terelusi lebih dahulu
Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar
lebih kuat tertahan
Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-
hidrofuran
Eluent strength:
- dimodifikasi dengan air
(Kellner dkk., 1998)
9 HPLC-2011
Detektor
Bagaimana
Memilih detektor
dan
Apa pertimbangannya
???
Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2
golongan yaitu:
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat
secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan
detektor spektrometri massa;
detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Detektor HPLC
Bulk property detector (BPD) :
- mengukur sifat solute dan fase gerak
contoh : detektor indeks bias ( RI )
UV
Fluorescen
24 HPLC-2011
Luminescence
Fluorescensi
25 HPLC-2011
Fluorescene detection
• Compared to UV-VIS
detectors fluorescence
detectors offer a higher
sensitivity and selectivity excitation emission
that allows to quantify
and identify compounds
and impurities in complex Mobile phase
matrices to extremely low
concentration levels
(trace level analysis)
• Fluorescence detectors
sense only those
substances that fluoresce
suwedo hadiwiyoto basic principles of HPLC - 1 26
Detektor Indeks Bias
• Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda
• Detektor mengukur perbedaan antara indeks
bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg
keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan
oleh adanya solut.
• Detektor ini tidak dapat dipakai untuk pelarut
landaian karena indeks bias sistem berubah
selama kromatografi
• Sangat sensitif terhadap perubahan suhu
Refractive index (RI) detection
• The ability of a compound or
solvent to deflect light provides
a way to detect it
• The RI is a measure of
molecule’s ability to deflect
light in a flowing mobile phase
in a flow cell relative to a static
mobile phase contained in a
reference flow cell
• The amount of deflection is
proportional to concentration
• The RI detector is considered to
be a universal detector but it is
not very sensitive
HPLC-2011 31
Tujuan Derivatisasi
Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa
dengan pereaksi (agen) penderivat untuk
menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs
32 HPLC-2011
Syarat reaksi derivatisasi
1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap
baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa
berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri;
2. Proses derivatisasi harus cepat dan
menghasilkan produk yang sebesar mungkin
(100 %);
3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama
proses derivatisasi dan deteksi;
4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak
menganggu pemisahan kromatografi.
Captopril
HS CH3
O
N COOH
HS CH3
O
O
N COOH + Br C-CH2-Br
E
t
i
Captopril l p -Br fenacylbromide
a
m
i
35
n HPLC-2011
Hasil derivatisasi :
Captopril + p -Br Fenacylbromide
HS CH3
O
O O
N C-O-CH2-C Br
R-NH2
37 HPLC-2011
Derivatisasi dg Dansilklorid
+ R-NH2
- HCl
O=S=O O=S=O
Cl NH
R
Dansil klorid
HPLC-2011 Fluorescent derivative 38
Contoh Senyawa
Asli
Yang
Berfluorescensi
Kunang-kunang
40 HPLC-2011
Fluorescensi
41 HPLC-2011
Asam Salisilat
O
C
OH
H
O
As.Salisilat - Fluorescensi
O
C
OH
H
O
Papaverin HCl
H3CO
OCH3
N
H3CO .HCl
CH2 OCH3
Riboflavin
OH OH OH
CH2-CH-CH-CH-CH2OH
H 3C N N O
NH
H3 C N
O
46 HPLC-2011
Bentuk Kromatogram
47 HPLC-2011
Peak asymmetry - tailing
USP
HPLC-2011 48
Peak Asymmetry vs Tailing
Baca:
Snyder dkk., 1997
HPLC-2011 49
Kriteria Peak
HPLC-2011 50
Pengatasan Peak Tailing
Tambahkan 30 mM:
- Trietilamin (utk seny. basa)
- Amonium asetat (utk seny. asam)
Perhatikan:
pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan
53 HPLC-2011