LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOKIMIA

KROMATOGRAFI KERTAS

NIM

Nama
: Delanensy Kumalasari
: BI / 07678
GOL/Kelp
: II B / 02
Asisten
: Aloysius Dwi

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2007

KROMATOGRAFI KERTAS
I.

Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mempelajari teknik kromatografi
terutama kromatografi kertas. Serta menentukan jenis asam amino yang terdapat
dalam sampel.

II.

Dasar Teori
Kromatografi merupakan istilah umum untuk berbagai macam cara
pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase yang bergerak, dapat berupa
gas atau zat cair; dan fase diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Istilah
kromatografi pertama kali dipakai oleh TSWETT tahun 1903 untuk menggambar
daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom.Kromatografi merupakan
salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan
berkesetimbangan diantara dua fasa, fasa bergerak yang membawa cuplikan dan
fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak berupa gas,
disebut kromatografi gas. Sebaliknya jika fasa gerak berupa zat cair maka disebut
kromatografi cair (Sastroamijojo, 1991).
Menurut Sastroamidjojo (1991) Cara-cara kromatografi dapat digolongkan
sesuai sifat-sifat dari fasa tetap yang berupa padat atau zat cair. Jika fasa tetap
berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan dan jika
cair maka dikenal sebagai kromatografi partisi. Karena fasa bergerak dapat berupa
zat cair atau gas maka semua ada empat macam sistem kromatografi. Keempat
macam sistem tersebut adalah :
1. Fasa bergerak zat cair-fasa tetap padat
Dikenal sebagai kromatografi serapan yang meliputi :
-

Kromatografio lapis tipis

Kromatografi penukar ion

2. Fasa bergerak gas-fasa tetap padat

-

Kromatografi gas padat

3. Fasa bergerak zat cair-fasa tetap zat cair

Dikenal sebagai Kromatografi Partisi
-

Kromatografi Kertas

4. Fasa bergerak gas-fasa tetap zat cair

-

Kromatografi gas-cair

Kromatografi Kolom kapiler

Semua pemisahan dengan Kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa

senyawa-senyawa yang dipisahkan terdistribusi sendiri diantara fasa-fasa bergerak
dan tetap dalam perbandingan yang sangat berbeda-beda dari suatu senyawa
terhadap senyawa yang lain.
Pada praktikum kali ini yang dipakai adalah metode kromatogrfi kertas
(paper cromatography). Dalam kromatografi dikenal istilah stationer phase (fase
diam) dan mobile phase (fase gerak). Fase bergerak biasanya merupakan
campuran yang terdiri atas satu komponen organik yang utama, air dan berbagai
tambahan seperti asam-asam, basa atau pereaksi-pereaksi kompleks untuk
memperbesar kelarutan dari beberapa senyawa atau untuk mengurangi yang
lainnya (Sastroamijojo,1991). Sedang fase diam adalah salah satu pelarut yang
digunakan terikat secara fisikokimia pada kolom.(Wilson and Wolker,1997).
Kedua fase yang ada ini didasarkan atas solute yang terdistribusi secara merata
dan terjadinya sebuah ikatan terhadap kolom yang ada (Ewing, 1985).
Dalam identifikasi senyawa yang terpisah pada kromatografi kertas
didasarkan pada harga Rf (retordaction factor). Rf merupakan ratio antara
konsentrasi dari suatu campuran yang dipisahkan dalam dua pelarut yang
immiscible. Rf tersebut kemudian dibandingkan dengan harga Rf standar.
Harga Rf dapat dirumuskan sebagai berikut :
Jarak yang digerakkan oleh senyawa
Rf =
Jarak yang digerakkan oleh permukaan pelarut

(Sastroamidjojo, 1991)
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu Pelarut, suhu, ukuran dari
bejana, kertas dan sifat dari campuran tersebut.
Keuntungan menggunakan kromatografi kertas adalah sangat praktis dan
tidak memerlukan plat pendukung, serta menggunakan kertas yang mudah
diperoleh dalam bentuk murni sebagai kertas saring. Panjang serabut pada kertas
lebih panjang daripada serabut pada lapisan selulosa sehingga menyebabkan lebih
banyak difusi ke samping dan bercak lebih besar, lapisan pelarut selulosa lebih
rapat dan pelarut cenderung mengalir melaluinya lebih cepat dan menghasilkan
pemisahan lebih tajam (Gritter et al., 1991) dan juga cuplikan senyawa yang
dibutuhkan untuk analisis hanya sedikit, alat tidak begitu mahal, dapat

memisahkan senyawa yang amat berbeda, seperti senyawa organik alam dan
senyawa organik sintesis.
Beberapa lapangan yang menggunakan kromatografi kertas adalah klinik
dan biokimia yang berguna untuk memisahkan asam amino dan peptida dalam
menentukan struktur dari protein,pengujian urine dan cairan lainnya. Bidang
analitik umum yaitu untuk menganalisa polimer dan deteksi serta pengiraan
adanya logam-logam dalam tanah, pemisahan alkaloida dan pemisahan senyawasenyawa yang mengandung radioisotop (Sastroamidjojo, 1991)
Asam amino dapat digolongkan berdasarkan kecenderungan molekul untuk
berinteraksi dengan air. Asam amino dapat dibedakan menjadi asam amino dengan
gugus R non polar yang merupakan hidrokarbon dan bersifat hidrofobik. Gugus R
dari asam amino polar lebih larut dalam air atau lebih hidrofilik karena
mengandung gugus fungsionil yang membentuk ikatan hidrogen dengan air. Serta
gugus R polar tidak bermuatan, gugus R bermuatan negatif, dan gugus R
bermuatan positif.
Alanin, metionin, dan leusin merupakan asam amino dengan gugus R non
polar. Asam amino dengan gugus R polar antara lain tirosin (tidak bermuatan),
arginin, dan histidin (bermuatan positif). Arginin pertama kali diisolasi dalam
bentuk garam perak (argentum) dari hasil hidrolisis tanduk dan bersifat basa.
Leusin memiliki gugur R bercabang dan merupakan asama amino essemsial.
Histidin merupakan asam amino yang bersifat basa. Sedang tirosin merupakan
molekul asam amino yang mempunyai gugus fenol dan bersifat asam lemah serta
dapat diperoleh dari kasein (protein utama pada keju). Dan Alanin derta metionin
diperoleh dari hasil hidrrolisis fibroin untuk alanin dan kasein untuk metionin.
(Poedjiadi, 1994).
Selulosa yang terdapat dalam kertas merupakan medium yang ideal,
dimana menyebabkan pelarut dapat merambat diantara serabut selulose sebagai
fase gerak. Cara ini diperkenalkan pertama kali oleh Consden, Gordon, dan Martin
pada tahun 1941. pemilihan kertas dan solvent sangat penting dalam metode ini
(Plummer, 1978).
Pada umumnya kromatografi kertas menggunakan kertas Whatman nomor
1. Solvent yang digunakan tergantung pada solute atau sampel yang ada. Sering
digunakan solvent yang merupakan alkohol organik dan garam berlebih agar
memudahkan dalam pemisahan komponennya dengan pertukaran ion.

III.

Metode
a. Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini Petridish yang digunakan untuk
tempat solvent dan sebagai tempat meletakkan kertas Whatman. Jangka digunakan
untuk membuat lingkaran pada kertas Whatman. Pipet kapiler digunakan untuk
mengambil sampel larutan dan meletakkan larutan pada sebuah titik dikertas
kromatografi. Hair dryer digunakan untuk mengeringkan kertas Whatman setelah
diberi sampel. Botol penyemprot digunakan untuk tempat reagen Ninhydrin yang
akan disemprotkan. Benang katun digunakan untuk menyerap solvent pelan-pelan
yang ditempatkan ditengah-tengah lingkaran. Whatman sebagai media untuk
menghubungkan solvent dengan solute yang ada pada kertas. Oven sebagai tempat
untuk mengeringkan kertas Whatman dimana setelah terjadi percampuran antara
solute dan solvent. Pensil, pinset, penggaris, dan gunting digunakan untuk
membuat lingkaran serta garis pada kertas Whatman yang akan digunakan untuk
meletakkan solute.
b. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah solute yang
dipisahkan (campuran asam amino), solvent (campuran buthanol, acetic acid
galssial, dan air dengan perbandingan 4:1:1), 6 macam asam amino standard,
kertas Whatman No.1, dan reagen Ninhydrin. Solute merupakan campuran dari
asam amino yang akan diidentifikasi berdasarkan asam amino standard. Asam
amino standar yang digunakan adalah alanin, tirosin, arginin, metionin, histidin,
dan leusin.
c. Cara Kerja
Kertas Whatman digunting seluas tutup petridisk, kemudian dibuat
lingkaran dengan jari-jari 1 cm dari titik tengah lingkaran dengan menggunakan
jangka. Setelah itu lingkaran kertas Whatman tersebut dibagi menjadi delapan
bagian yang sama dengan digaris memakaipsi. Petemuan antara garis melingkari
garis lurus pembagi tersebut diberi lingkaran kecil. Selanjutnya lingkaran tersebut
diberi nomor. Titik tengah lingkaran dibuat lubang dan benang katun dimasukkan
melalui lubang tersebut. Benang katun tersebut diikat salah satu ujungnya agar
banang tidak lolos dari kertas Whatman dan disisakan benang sepanjang 4-5 cm.
Dengan menggunakan pipet kapiler, sebanyak 8 lingkaran tersebut ditetesi dengan

larutan sampel dan 6 macam asam amino standard. Larutan sampel yang akan
diidentifikasi diletakkan pada lingkaran nomor 1 dan 5. setelah itu, lingkaran
kertas Whatman dimasukkan pada tutup petridish dengan ikatan benang ada
diantara kertas dan cawan petri.
Kemudian sebanyak 10 ml solvent (campuran alkohol, asam asetat glasial,
dan air dengan perbandinga 4:1:1) dituangkan pada cawan petri dan ditutup
dengan tutup cawan petri yang sudah ditempeli kertas Whatman sehingga ujung
benang tercelup ke dalam solvent.keadaan tersebut dibiarkan selama 45 menit, lalu
tutup dibuika, dan kertas whatman diambil kemudian jarak solvent yang tampak
diberi tanda dengan pensil. Lalu kertas dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105 o
C selama 3 menit. Stelah kering, kertas disemprot dengan larutan Nynhidrin (0,2 g
Ninhydrin dilarutkan dalam 100 ml aceton) yang telah diletakkan pada botol
penyemprot. Kemudian kertas dikeringkan kembali dalam oven selama 3 menit.
Pada kertas tersebut akan tampak noda-noda asam amino berwarna ungu.
Jarak noda ungu asam amino dan solvent diukur dengan titik awal yang
merupakan pertemuan antara garis melingkar dan garis lurus pambagi. Pada
larutan sampel akan terdapat 3 buah noda ungu yang berarti bahwa dalam
campuran larutan tersebut terkandung 3 macam asam amino. Dengan diketahui
jarak solute dan solvent maka Rf dapat dihitung. Identifikasi asam amino pada
larutan sampel dapat dilakukan dengan perbandingan harga Rf asam amino yang
belum diketahui pada larutan sampel dan asam amino standar.

Gambar 1 : Kertas Whatman yang telah diberi garis

IV.

Hasil dan Pembahasan

Dari percobaan pengukuran kadar air dengan menggunakan bantuan
eksikator didapatkan hasil sebagai berikut:

Pengukuran kadar air sangat penting dalam penelitian biokimia terutama

yang menggunakan sempel berupa bahan segar. Contohnya adalah dalam
penentuan kandungan senyawa dalam suatu bahan. Pengukuran kadar air
dilakukan dengan mengeringkan bahan segar dalam oven sampai didapatkan berat
konstan. Kadar air dapat dihitung dengan menggunakan rumus sbb:
Kadar air :

berat segar berat kering

x 100%

berat segar

Eksikator adalah suatu wadah yang digunakan untuk menyimpan bahan

agar tetap kering. Botol timbang yang dikeluarkan dari oven dimasukkan dalam
eksikator agar kekeringannya terjaga. Juga untuk menghindari timbulnya uap air
yang akan membuat bahan menjadi basah kembali. Berat segar adalah berat basah
dari suatu bahan. Sedangkan berat kering adalah angka konstan yang diperoleh
ketika penimbangan bahan. Bahan yang sudah tidak mengandung air lagi kareana
air sudah diserap oleh silika gel yang terdapat dalam eksikator.

Pada percobaan yang dilakukan digunakan metode kromatografi kertas

untuk mengetahui kandungan asam amino yang terdapat dalam suatu sampel yang
terdiri dari campuran asam amino. Penentuan asam amino dilakukan dengan
membandingkan nilai Rf antara larutan sampel yang belum diketahui dengan

larutan asam amino standar. Asam amino standar yang digunakan dalam percobaan
adalah alanin, metionin, histidin, leusin, arginin, dan tirosin dengan nilai Rf yang
berbeda-beda. Perbedaan nilai Rf ini dapat dipengaruhi oleh sifat dan kelarutan
asam amino. Asam amino yang mudah larut cenderung memiliki nilai Rf yang
besar karena asam amino tersebut akan memiliki jarak perambatan yang lebih
jauh. Dengan solvent yang sama, jarak perambatan solute yang besar
menyebabkan nilai Rf besar karena nilai Rf tersebut berbanding lurus dengan nilai
jarak perambatan solute.Nilai Rf juga ditentukan oleh :
a. Pelarut, disebabkan karena pentingnya koefisien partisi, komposisi berubah,
Rf juga berubah
b. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan kecepatan aliran
juga berubah
c. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari
atmosfer dan mempengaruhi kecepatan penguapan komponen pelarut.
d. Kertas, berhubungan dengan ion dan serapan pada masing-masing kertas,
kertas mempengaruhi kecepatan aliran, yang selanjutnya mempengaruhi
keseimbangan partisi
e. Sifat campuran, berbagai senyawa mengalami partisi, diantara volumevolume yang sama dari fase diam dan fase bergerak, karakteristik larutan
saling mempengaruhi.
(Sastroamidjojo, 1991)
Kertas digunakan sebagai bahan penyangga. Kertas yang digunakan
adalah kertas Whatman No.1. Pemilihan kertas ini disebabkan kertas Whatman
mengandung selulose denagn persentase yang besar yaitu 96%, sehingga baik
digunakan sebagai medium dan dapat menimbulkan noda yang jelas sebagai akibat
dari gaya kapiler pada serabut selulosa. Kertas berpengaruh pada kecepatan aliran
pelarut. Efek serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugus hidroksil dimana ini
kemungkinan sangat penting dari sejumlah kecil gugus-gugus karboksil dalam
selulose dapat menaikkan terhadap efek-efek pertukaran ion. Kecepatan aliran naik
dengan penurunan kekentalan pelarut dan pada suhu tertentu ditentukan oleh
kerapatan dan tebal kertas. Kertas Whatman no.1 mempunyai kecepatan aliran
yang sedang.
Kertas Whatman tersebut tidak boleh disentuh dengan tangan, hal ini
karena tangan mengandung protein-protein yang nantinya dikhawatirkan akan
mengganggu terjadinya proses perambatan pada kertas. Disamping itu juga tangan

banyak digunakan untuk memegang larutan dalam percobaan kali ini sehingga
apabila kertas dipegang akan menghambat dalam pengamatan dan hasilnya akan
tidak sesuai.
Solvent yang digunakan dalam percobaan ini adalah campuran buthanol:
asam asetat glasial : air dengan perbandingan 4:1:1. Buthanol berfungsi sebagai
fase gerak yang bersifat non polar memilki Rf yang lebih besar dibandingkan asam
amino lainnya. Asam asetat glasial berfungsi sebagai asam yang mampu
menguraikan atau memisahkan asam-asam amino yang terdapat dalam sampel,
sehingga asam amino mampu memberikan reaksi masing-masing dan dapat
teridentifikasi jenis asam amino tersebut. Air berfungsi sebagai fasa diam. Hal ini
karena air dengan serabut selulosa sama-sama bersifat polar sehingga keduanya
akan saling terikat.
Kertas segera dikeringkan dengan hairdryer setiap meneteskan asam
amino, hal ini bertujuan agar kertas tidak berwarna hitam, karena larutan yang
diteteskan berupa asam. Penetesan asam amino dengan pipet kapiler pada kertas
dilakukan sedikit demi sedikit agar tercapai keseimbangan partisi selama
bergerak, sehingga tidak akan mengakibatkan pengamatan tidak jelas.
Pengeringan dengan hairdryer ini tidak boleh terlalu lama, karena panas yang
dihasilkan oleh hairdryer dapat merusak kertas.
Setelah ditunggu 45 menit untuk perambatan solvent, kertas kemudian
disemprot dengan Ninhydrin sebagai pereaksi dengan asam amino untuk
memperjelas bercak. Kemudian dilakukan Pemanasan dengan oven sehingga hasil
dapat jelas terlihat dan pengukuran dapat dilakukan dengan lebih mudah. Selain
itu pemanasan juga berfungsi untuk menguapkan fase gerak yang ada pada filter
paper. Reaksi asam amino yang mempunyai gugus -asam amino dengan reagen
Ninhydrin akan menghasilkan warna ungu sehingga dapat diukur jarak
perambatannya pada kertas.

V.

Kesimpulan
Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa
Kromatografi kertas merupakan salah satu cara yang sederhana untuk pemisahan
solute ke dalam solvent yang berlainan. Identifikasi asam amino dengan
menggunakan perbandingan nilai Rf dapat menentukan asam amino yang
terkandung dalam larutan sampel. Asam amino dalam larutan sampel adalah
arginin, leusin dan metionin.

VI.

Daftar Pustaka
Ewing, W. G. 1985. Instrumental Methode of Chemical Analysis. McGrawHill
International Education. Singapore. pp: 340-342
Gritter, K.J., D.M. Gabit, ad A.E. Scwarning. 1991. Komatografi. Edisi ke2.
Penerbit ITB. Bandung .Hal 157
Plummer, D.T. 1978. An Introduction to Practical Biochemistry.2 nd ed. Mc Graw
Hill Book Company. London. p. 78-81
Wilson,K and J.m.Wolker.1997. Principles and Techniques of Practical
Biochemistry. 4th ed. Cambridge University Press. London. pp: 462-527
Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. UI Press. Jakarta hal 95-99
Sastroamidjojo,H. 1991. Kromatografi. Liberty. Yogyakarta. hal: 13-25