KROMATOGRAFI KERTAS

I. TUJUAN PERCOBAAN
Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari pemisahan senyawa sampel asam
amino menggunakan teknik kromatografi kertas dan menentukan jenis asam amino
yang terkandung dalam larutan sampel. Selain itu, praktikum ini juga bertujuan untuk
mempelajari cara pengukuran kadar air dan fungsinya.

II. DASAR TEORI

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan senyawa terlarut dalam
senyawa pelarut. Teknik kromatografi berkembang pada tahun 1903 dan telah
digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang berwarna. Sedangakan
kromatografi kertas sendiri dikembangkan oleh Consden, Gordon dan Martin pada
tahun 1941 (Plummer, 1978). Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan
dua fase yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Pemisahan suatu
senyawa tergantung pada gerakan relatif dari dua fase tersebut. Cara-cara
kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fase diam dan fase
bergerak yang dapat berupa zat padat atau zat cair (Sastrohamidjojo, 2002).
Berdasar fase diam dan fase bergeraknya teknik kromatografi dapat dibedakan
menjadi 4 jenis yaitu:
1. Kromatografi serapan, yaitu apabila fase bergeraknya zat cair dan fase
diamnya zat padat. Ada 2 macam kromatografi serapan yakni kromatografi
lapis tipis dan kromatografi penukar ion.
2. Kromatografi gas-padat, yaitu apabila fase bergeraknya gas dan fase
diamnya zat padat.
3. Kromatografi gas-cair, yaitu apabila fase bergeraknya berupa gas dan fase
diamnya adalah zat cair.
4. Kromatografi partisi, yaitu apabila fase bergeraknya zat cair dan fase
diamnya juga zat cair. Salah satu nacam kromatografi partisi yakni
kromatografi kertas.
(Conn and Stumpf, 1976)
Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi dimana fase bergerak
maupun fase diamnya berupa zat cair. Setetes dari larutan cuplikan yang mengandung
campuran yang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong kertas saring dan kemudian
senyawa tersebut akan meluas membentuk noda membulat. Bila noda telah kering,
kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang berisi pelarut sebagai fase ferak.
Pelarut bergerak melalui serat-serat kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan
komponen-komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam aliran
pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauh atau
setelah waktu yang ditentukan, maka kertas diambil dari bejana dan kedudukan
permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-
senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagi pita-pita atau noda-noda yang
terpisah. Jika senyawa-senyawa tak berwarna maka harus dideteksi dengan cara fisika
atau secara kimia yakni dengan menggunakan pereaksi atau juga dengan deteksi
menggunakan sinar ultraviolet atau teknik radiokimia (Sastrohamidjojo, 2002).
Prinsip kerja kromatografi kertas uaitu pemiasahan senyawa-senyawa solute
atau zat terlarut di dalam 2005 atau lebih solvent (pelarut) yang berlainan dengan
menggunakan kertas sebagai medium penyangganya. Kemudian berdasarkan macam
perambatan fase bergeraknya, kromatografi kertas dapat dibedakan menjadi 3 macam
yaitu:
1. Ascending chromatography, yang solventnya merambat ke arah atas
2. Descending chromatography, yang solventnya merambat ke arah bawah
3. Circulair chromatography, yang solventnya bergerak melingkar atau
mendatar
(Heasley et al. 1997)
Metode yang digunakan untuk identifikasi suatu senyawa menggunakan teknik
kromatografi kertas adalah penghitungan Rf. Rf atau racing factor merupakan
perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh senyawa yang diidentifikasi dengan
jarak yang ditempuh oleh pelarut (solvent). Pada tiap-tiap senyawa mempunyai nilai
Rf yamg berbeda-beda dan hal inilah yang dijadikan dasar pengidentifikasian suatu
senyawa (Plummer, 1978).
Dalam melakukan teknik kromatografi kertas perlu diperhatikan beberapa hal
antara lain:
1. metode yang digunakan (penaikan, penurunan, atau mendatar)
2. macam kertas
3. pemilihan dan pembuatan pelarut (solvent)
4. penempatan cuplikan
5. metode deteksi dan identifikasi
 (Plummer, 1978)
Macam kertas yang digunakan dalam teknik kromatografi kertas adalah kertas
khusus, yaitu kertas yang banyak mengandung selulosa. Berdasarkan sifat selulosa
yang mempunyai daya serap tinggi terhadap suatu larutan, maka kertas berbahan
selulosa sangat cocok digunakan dalam pelaksanaan teknik kromatografi kertas ini.
Kebanyakan kertas yang digunakan dalam teknik kromatogrfai kertas adalah kertas
Whatmann. (Sasrohamidjojo,2002)
Kemudian penggunaan pelarut haruslah disesuaiakan dengan senyawa yang
akan dipisahakn, untuk senyawa polar maka dibutuhkan pula pelarut yang bersifat
polar. Hal ini sesuai hukum like dissolve like, dimana dua senyawa yang mempumyai
kepolaran yang sama akan saling tarik menarik (Heasley et al. 1997). Beberapa
pelarut atau solvent yang digunakan dalam teknik kromatografi kertas antara lain:
Tabel 1. Pelarut-pelarut dalam teknik kromatografi kertas
Pemisahan Pelarut Perbandingan
Asam-asam Fenol, air Larutan jenuh
amino n-buthanol, as. cuka, air 4:1:5
n-buthanol, as. cuka, air 12 : 3 : 5
n-buthanol, pirimidin, air 1:1:1
Karbohidrat Etil asetat, pirimidin, air 2:1:2
(gula) Etil asetat, n-PrOH, air 6:1:3
Etil asetat, as.cuka, air 3:1:3
Asam-asam n-buthanol, 1,5 M NH3 Larutan jenuh
lemak
Fe, Cl, Br, I, Pirimidin, air 9:1
(garam Na)
Hg, Pb, Cd, n-buthanol, 3 M HCl Laruatan jenuh
Cu, Bi
(Sastrohamidjojo, 2002)
Penggunaan pelarut untuk senyawa-senyawa organik dipilih senyawa-senyawa
bersifat polar agar lebih mudah larut dalam air daripada dalam zat-zat cair organik.
Dalam pemisahan asam-asam amino sasngat baik digunakan campuran berupa n-
buthanol, asam cuka dan air. Pelarut n-buthanol sebenarnya bukan merupakan pelarut
asam amino, akan tetapi bila dijenuhkan dengan air maka akan menjadi pelarut asam
amino yang baik. Penambahan asam cuka dan pemberian lebih banyak air akan
menjadikan kenaikan kelarutan asam-asam amino sehingga lebih mudah untuk
berpisah (Sastrohamidjojo, 2002)
Beberapa kelebihan menggunakan teknik kromatografi kertas dalam usaha
pemisahan sekaligus pengidentifikasian suatu senyawa adalah pertama merupakan
metode pemisahan yang cepat dan mudah serta menggunakan peralatan yang mudah
dan sederhana. Kedua, hanya membutuhkan campuran cuplikan yang sangat sedikit
dan justru tidak menggunakan dalam jumlah yasng besar, dan ketiga pekerjaan dapat
diulang-ulang. Keuntungan lainnya adalah dengan menggunakan teknik kromatografi
kertas dalam menentukan suatu senyawa dapat digunakan berbagai cara antara lain
dengan penentuan Rf dimana spesifik untuk suatu senyawa (Kalthoff and Sandel,
1952).
Dalam menganalisis kandungan kimia suatu sampel berupa bahan segar, perlu
dilakukan pengukuran kadar air. Pengukuran kadar iar dilakukan dengan
mengeringkan bahan segar atau bahan setengah kering dalam oven, sampai
didapatkan berat konstan. Penghitungan persentase kadar air sesuai rumus berikut:

Berat segar – berat kering x 100 %

Berat segar

III. METODE
A. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini antar lain: petridish glass,
jangka, pipet kapiler, hairdryer, botol penymprot, benang katun, oven, pinset,
penggaris, gunting serta pensil. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam
percobaan ini yaitu larutan solute yang berupa campuran asam-asam amino, larutan
solvent: n-buthanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 4 : 1 : 1, 6 asam amino
standar (histidin, alanin, leusis, metionin, arginin,tirosin), kertas Whatmann no.1 dan
regen Ninhydrin.
B. Cara Kerja
Kertas Whatmann digunting sebesar tutup petridish, lalu dibuat lingkaran
berjari-jari 1 cm dari titik tengah kertas menggunakan jangka. Kertas Whatmann
dibagi menjadi 8 bagian yang sama besar denagn menggarisnya menggunakan pensil.
Pada tiap pertemaun anatara lingkaran 1 cm dan garis yang membagi kertas dibuat
lingkara-lingkaran kecil serta diberi nomor secara urut. Pada tengah kertas dilubangi
dan dimasukkan benang katun lalu diikat pada salah satu ujungnya agar tidak lolos
dari kertas Whatmann, benang disisakan sepanjang 4-5 cm.
Di tiap-tiap lingkaran kecil ditetesi dengan menggunakan pipet kapiler 6 macam
sampel asam amino dan 2 larutan sampel. Penempatan larutan-larutan tersebut yakni:
 1. sampel
2. asam amino metionin
3. asam amino histidin
4. asam amino tiroksin
5. sampel
6. asam amino alanin
7. asam amino arginin
8. asam amino leusin
Larutan sampel yang diletakkan pada lingkaran nomor 1 dan 5 merupakan larutan
yang jenisnya sama dan dilakukan dengan tujuan sebagi ulangan.
Setelah itu kertas Whatmann dimasukkan pada tutup petridish dan kemudian
tutup tersebut dipasang pada petridish yang telah diisi dengan larutan solvent kurang
lebih 10 ml sehingga ujung benang tercelup ke dalam solvent. Dibiarkan selama 45
menit, kemudian tutup diangkat, batas daerah resapan solvent ditandai dan setelah itu
dikeringkan dalam oven selama 3 menit pada suhu 105 ºC. Setelah kering kertas
Whatmann disemprot dengan reagen Ninhydrin dan dikeringkan kembali dalam oven
kurang lebih selam 3 menit. Noda-noda berwarna ungu akan tampak kemudian diukur
jarak masing-masing bagian tengah jarak tengah rambatan (berwarna ungu) baik
larutan sampel maupun larotan asam amino standar. Kemudian dihitung nilai Rf-nya
dan dibandingkan antar larutan-larutan tersebut unruk menentukan asam amino apa
saja yang menjadi komponen larutan sampel.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, didapatkan Rf untuk masing-
masing larutan baik larutan sampel maupun asam amino standar sebagi berikut:
Tabel 2. Rf larutan sampel dan asam amino standar
No. Larutan Rf
1. Sampel
Rf 1 0,09
Rf 2 0,30
Rf 3 0,78
2. Metionin 0,37
3. Histidin 0,19
4. Tiroksin 0,56
5. Sampel
 Rf 1 010
Rf 2 0,30
Rf 3 0,55
6. Alanin 0,30
7. Arginin 0,15
8. Leusin 0,65

Kemudian dapat dicari rata-rata Rf tiap sampel sebagai berikut:

Rf 1 = 0,09 + 0,10 = 0,095 (Arginin = 0,10)

2
Rf 2 = 0,30 + 0,30 = 0,30 (Alanin = 0,30)
2
Rf 3 = 0,78 + 0,55 = 0,66 (Leusin = 0,66)
2
Pada percobaan pengukuran kadar air, didapatkan hasil seperti berikut:
Tabe 3. Hasil pengukuran kadar air

No Berat kering Botol (g) Berat awal 45’ pertama (g) 45’ kedua (g) 45’ ketiga (g)
(g)

1. Sampel 1 13,99 2,65 1,97 1,18 0,77

2. Sampel 2 24,82 1,79 1,31 0,61 0,39

Kadar air sampel 1 = 2,65 – 0,77 x 100 % = 70,9 %

2,65
Kadar air sampel 2 = 1,79 – 0,39 x 100 % = 78,2 %
1,79

B. Pembahasan
Nilai Rf merupakan nilai perbandingan antara jarak yang ditempuh oleh solute
(zat terlarut) dengan jarak yang ditempuh solvent (pelarut).
Jarak yang ditempuh solute
Rf = ------------------------------------
Jarak yang ditempuh solvent
Kertas yang digunakan dalam percobaan ini adalah kertas Whatmann no. 1
karena merupakan kertas yang banyak mengandung selulosa (96 %), dan sangat
efektif sebagai media perambatan asam amino yang mempunyai berat molekul (BM)
cukup besar sehingga asam amino tersebut dapat merambat dengan baik. Kertas
Whatmann termasuk media penyangga suatu larutan dengan kecepatan perambatan
sedang serta mempunyai ketebalan yang tipis, hal ini akan mempermudah
pengamatan walaupun jumlah asam amino yang diteteskan sangat sedikit.
Prinsip perambatan pada kertas adalah gaya kapiler dari kertas yaitu pada
poro-porinya yang besar sehingga molekul terutama yang dalam wujud cair dapat
melewatinya. Fungsi kertas dalam pemisahan terutama mempunyai pengaruh pada
kecepata aliran pelarut. Efek-efek serapan disebabkan oleh sifat polar dari gugus-
gugus hidroksil dan sejumlah gugus karboksil dari selulosa akan dapat menaikkan
efek-efek pertukaran ion.
Kemudian selama perlakuan dengan kertas Whatmann, diusahakan agar tidak
ada kontak langsung antara kulit dengan kertas atau kertas terlipat. Hal ini agar tidak
terjadi penempelan asam amino atau senyawa lain yang berasal dari tubuh kita, misal
dari pengeluaran keringat sehingga menyebabkan kontaminasi pada kertas.
Dalam percobaan ini menggunakan solvent yaitu campuran n-buthanol ,air,
dan asam asetat dengan perbandingan 4:1:1. Yang menjadi fase diam atau stationary
adalah air. Sedang yang menjadi fase gerak atau mobile adalah n-buthanol. Fungsi
dari penyemprotan Nynhidrin (indanatrioan hidrat) adalah sebagai pereaksi
yangdigunakan untuk mendeteksi asam-asam amino. Pada suhu kamar pereaksi ini
baru memberikan warna pada asam amino kira-kira setelah 24 jam. Namun, pada
pemanasan pada suhu 100 ºC warna akan timbul kira-kira setelah 4 menit saja.

Inadanatrion hidrat + asam amino  kompleks warna ungu

Ada beberapa faktor yang deapat mempengaruhi jarak tempuh suatu senyawa
pada teknik kromatografi kertas ini, yaitu:
1. Pelarut
Karena pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil
dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan jarak tempuh suatu
larutan.
2. Ukuran dari bejana
Volume bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer, jadi mempengaruhi
kecepatan penguapan komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar
 digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, lalu akan merubah koefisien
partisi.
3. Suhu
Perubahan pada suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
4. Kertas yang digunakan
Pengaruh utama kertas pada harga jarak tempuh larutan timbul dari perubahan ion
dan serapan yang berbeda untuk setiap kertas. Selain mempengaruhi kecepatan
aliran, jenis kertas juga akan memprngaruhi keseimbangan partisi.
5. Sifat dari campuran
Berbagai senyawa mwngalami diantara volume yang sama dari fase tetap dan fase
bergerak akan mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap yang lain
dan akhirnya mempengaruhi jauh dekat jarak yang ditempuhnya.
Pada percobaan ini timbul 3 noda pada masing-masing sampel. Sehingga
untuk masing-masing sampel dapat diketahui 3 jenis asam amino penyusunnya.
Caranya adalah dengan mencari rata-rata nilai Rf kedua sampel tersebut pada ketiga
noda yang terbentuk. Rf 1 sampel menunjukkan angka 0,09 dan 0,10. Jika dirata-rata,
hasilnya Rf 1 adalah sebesar 0,095. Hasil ini mendekati Rf Arginin sebesar 0,10
sehingga dapat dikatakan salah satu asam amino penyusun sampel adalah Arginin. Rf
2 sampel menunjukkan angka 0,30 dan 0,30. Jika dirata-rata, hasilnya Rf 2 adalah
0,30. Hasil ini mendekati Rf Alanin sebesar 0,30 sehingga dapat dikatakan Arginin
merupakan salah satu asam amino penyusun sampel. Rf 3 sampel menunjukkan angka
0,78 dan 0,55. Jika dirata-rata, hasilnya Rf 3 sebesar 0,30. Hasil ini mendekati Rf
Leusin sebesar 0,65 sehingga dapat dikatakan asam amino ketiga yang menyusun
adalah Leusin.

V. KESIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa asam amino
yang terkandung dalam larutan sampel adalah Arginin, Alanin dan Leusin.
Kromatografi kertas termasuk teknik kromatografi partisi dimana fase geraknya
adalah n-butanol dan fase diamnya air. Prinsip kerja kromatografi kertas yaitu
pemisahan senyawa-senyawa solute di dalam 2 atau lebih pelarut yang berlainan
dengan menggunakan kertas sebagai media penyangganya.
Kandungan air pada sampel 1 dan 2 berturut-turut adalah 70,9 % dan 78,2 %.
Analisis kandungan kimia suatu sampel dilakukan pada bahan segar, sehingga fungsi
pengukuran kadar air adalah untuk mengetahui tingkat kesegaran sampel melalui
persentase kadar airnya.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Conn, E.E. and P.K. Stumpf. 1976. Outline of Biochemistry. 4th edition. John Willey
and Sons Co., Inc. New York. p.590-595.

Heasley, V.L., V.J. Christensen and G.E. Heasley. 1997. Chemistry and Life in
Laboratory. 4th edition. Prentice Hall Co., Inc. USA. P. 56-70.

Kalthoff, I. M. and E. B. Sandel. 1952. Textbook of Quantitative Inorganic Analysis.

3rd Edition. The Mac Millan Co., Inc. New York.p. 654-662.

Plummer, D.T. 1978. An Introduction to Practucal Biochemistry. 2th edit. Mc Graw

Hill Book Co., Ltd. New York. p. 70-87.

Sastrohamidjojo, H. 2002. Kromatografi. Edisi kedua. Penerbit Liberty. Yogyakarta.

Hal. 1-24.
LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK BIOKIMIA
ACARA VI
KROMATOGRAFI KERTAS

Disusun oleh :
Nama : M.A.Fathoni
NIM : BI/7660
Gol/Kel. : I B/ 2
Asisten : M. Rica A.

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS BIOLOGI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2007