7

HASIL

Kadar Air
Kadar air sampel daun sirsak adalah, 5.24 %. Kadar air dalam suatu bahan yang
dapat mengurangi aktivitas mikrob 3-7%. Kadar air pada kisaran tersebut juga
lebih stabil dan terhindar dari enzim oksidasi.

Kandungan Flavonoid
Kandungan flavonoid ditentukan dalam dua tahap, yaitu pada serbuk daun
dan ekstrak metanolik daun. Berdasarkan uji flavonoid dengan uji fitokimia secara
kualitatif, serbuk daun dan ekstrak metanolik daun sirsak positif mengandung
flavonoid. Secara kualitatif dapat dilihat dari intensitas warna ekstrak metanolik
dan serbuk yang tidak berbeda dari intensitas warna serbuk daun. Hal ini
menunjukkan bahwa pelarut metanol yang telah dipartisi dengan diklorometana
dan air efektif dalam mengekstrak flavonoid dari daun sirsak. Intensitas warna
flavonoid yang terkandung dalam daun sirsak dapat dilihat pada Gambar 1.

A B

Gambar 1 Hasil uji fitokimia flavonoid pada serbuk daun (A) dan ekstrak
metanol (B).

Ekstrak Flavonoid
Setelah terbebas dari senyawa nonpolar melalui maserasi dengan n-heksana,
ekstrak metanolik selanjutnya dipekatkan dengan alat pengering beku. Ekstrak
metanolik yang diperoleh dari hasil maserasi 650 g serbuk daun, rendemen yang
diperoleh 10.62%.
8
 

Efektivitas Ekstrak Metanol terhadap Proliferasi sel Vero

Ekstrak metanolik diujikan terlebih dahulu pada sel normal. Uji
pendahuluan ini dilakukan untuk menentukan konsentrasi yang diperlukan guna
diujicobakan pada sel kanker yang tidak merusak sel normal.
Uji pendahuluan dari ekstrak metanolik pada sel Vero menggunakan
berbagai konsentrasi, mulai dari 25000 µg mL-1 sampai 500 µg mL-1. Hasilnya
dapat dilihat pada Tabel 1. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin besar pula
penghambatannya pada proliferasi sel Vero. Penghambatan ekstrak metanolik
daun sirsak menurun pada konsentrasi 1000 µg mL-1 dan 500 µg mL-1 dengan
penghambatan masing-masing 47.65% dan 31.49%. Berdasarkan hasil ini, ekstrak
hasil fraksinasi daun sirsak yang diujikan adalah di bawah 500 µg mL-1 agar tidak
menghambat proliferasi sel normal.

Tabel 1 Penghambatan proliferasi ekstrak kasar daun sirsak terhadap sel Vero.

Konsentrasi ekstrak Rata-rata % Penghambatan

µg mL-1 serapan proliferasi
25000 0.032 80.37
15000 0.037 77.1
10000 0.033 79.96
5000 0.042 74.03
1500 0.046 71.98
1000 0.085 47.65
500 0.112 31.49

Kaempferol Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Ekstrak metanolik daun difraksinasi atau dipisahkan lebih lanjut untuk
mendapatkan flavonoid yang diinginkan, yaitu senyawa kaempferol. Dengan
eluen campuran asam format:air:metanol. Dihasilkan spot tunggal dengan nilai Rf
0.87 (Gambar 2A) dengan campuran pelarut ini. Ekstrak metanolik selanjutnya
dihidrolisis dengan HCl 1.8 N untuk melepaskan ikatan glikosida yang terikat
dengan flavonoid menjadi aglikonnya. Dari 5 g ekstrak kasar metanolik yang
dihidrolisis, diperoleh rendemen sebesar 34.61%. Nilai Rf yang sama, yaitu 0.72,
diperoleh juga dengan membandingkan senyawa standar kaempferol (Gambar
2B;a) dengan setelah ekstrak dihidrolisis (Gambar 2B;b).
 9
 

a b

A B

Gambar 2 Profil KL
LT eluen terbaik ekstraak kasar dauun sirsak (A
A) menggun
nakan
eluen HC
CO2H:H2O:MeOH dan
n profil KLT
T setelah hidrolisis (B).

Eksstrak kasar dipisahkann menggun

nakan KLTP
P dengan eluen dari hasil
H untuk meemperoleh senyawa kaaempferol. Hasil
KLT, yaittu HCO2H:H2O:MeOH
pemisahann dengan KLTP
K selaanjutnya diiuapkan hinngga pekatt dan dipeeroleh
rendemen sebanyak 23.45%.
2

dentitas Fla
Id avonoid
Flavvonoid yangg dicari, yaiitu kaempfeerol, diidenntifikasi unttuk mendap
patkan
gambaran yang jelaas tentang struktur senyawa yang
y diingiinkan. Sen
nyawa
flavonoid yang terkaandung di dalam
d daun sirsak dideeteksi dengaan menggun
nakan
spektromeeter UV-Viss dan KCKT
T. Kondisi untuk KCK
KT dilakukaan dengan kolom
k
C18, padaa laju alir 1ml/menit,
1 detektor UV
V 370 nm, dengan eluuen MeOH
H, dan
asam fosffat 0.5%. Hasil
H identiffikasi dengaan spektrom
meter Uv-V
Vis menunju
ukkan
satu puncaak serapan maksimum
m di daerah panjang
p geloombang 2500 sampai 30
00 nm
(Gambar 3).
3
10
 

Gambar 3 Spektrum UV-Vis ekstrak daun sirsak dalam metanol.

Hasil analisis menunjukkan bahwa ekstrak yang diperoleh memiliki waktu

retensi yang hampir sama dengan standar kaempferol (≥ 90%) yang diperoleh dari
Sigma-Aldrich, USA, sehingga diyakini bahwa senyawa yang diperoleh
merupakan senyawa kaempferol (Gambar 4). Gambar hasil KCKT menunjukkan
bahwa waktu retensi yang diperoleh dari ekstrak hasil KLTP ialah 3.395 dan
standar kaempferol memiliki waktu retensi 3.384.
A B
mV mV
K a e m p fe r o l/3 .3 8 4 /7 9 0 6 3 8

Detector A Ch2:370nm Detector A Ch2:370nm

45 15.0
40
12.5
35

30
10.0
25
K a e m p fe r o l/3 .3 9 5 /1 7 1 3 7

20 7.5

15
5.0
10

5
2.5
0

-5 0.0

-10
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min

Gambar 4 Kromatogram KCKT standar kaempferol (A) dan ekstrak hasil

KLTP daun sirsak (B).
 11
 

Penghambatan Proliferasi sel Vero dan sel Raji

Hasil pemisahan ekstrak daun sirsak dengan KLTP diuji daya hambat
proliferasinya pada sel Vero dan Raji. Konsentrasi ekstrak yang digunakan ialah
3, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 125, dan 250 µg mL-1. Konsentrasi tertinggi pada 250
µg mL-1 dipilih berdasarkan hasil uji in vitro pada ekstrak kasar terhadap sel Vero.
Hasil pada konsentrasi tersebut ialah konsentrasi tertinggi yang minimal
toksisitasnya terhadap sel Vero.

100

80
% Penghambatan

60

40
Sel Vero
20 Sel Raji
0
0 50 100 150 200 250
‐20

‐40 Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 5 Kurva penghambatan proliferasi ekstrak hasil KLTP daun sirsak

terhadap sel Raji (A) dan sel Vero (B).

Dari hasil uji pada sel Vero (Gambar 5), diperoleh bahwa kaempferol
sampai dengan konsentrasi 250 µg mL-1 minimal menghambat proliferasi sel
sebesar 19.77% sedangkan konsentrasi di bawah 100 µg mL-1 tidak ada
penghambatan. Akan tetapi, pada uji sel Raji pada konsentrasi di atas 100 µg mL-1
mengalami peningkatan hambatan proliferasi sampai dengan 76.36% pada
konsentrasi 250 µg mL-1 .
Dari pengamatan secara makroskopis, ekstrak kaempferol dapat mengurangi
populasi sel Raji yang berarti dapat menghambat pertumbuhan sel. Gambar 6
memperlihatkan bahwa populasi sel Raji yang diberi ekstrak kaempferol
berkurang dan terlihat mengalami perubahan morfologi.
12
 

A B

Gambar 6 Sel Raji tanpa pemberian ekstrak (A) dan sel Raji yang diberi ekstrak
kaempferol 250 µg mL-1 (B) (Perbesaran 8×10).

Berdasarkan hasil uji MTT, secara makroskopis (Gambar 7) pada sel Vero
menghasilkan warna ungu yang hampir sama dengan kontrol sel normal yang
tidak diberi ekstrak.
A B

Gambar 7 Sel Vero (kontrol) pada uji MTT (A) dan sel Vero setelah
pemberian ekstrak (B).

Berbeda dengan pemberian ekstrak kaempferol pada sel Raji (Gambar 8),
sel Raji menghasilkan warna ungu yang sedikit dibandingkan dengan kontrol sel
yang tidak diberi ekstrak. Dari gambar terlihat penurunan populasi sel
 13
 

dibandingkan dengan kontrol, namun tidak dapat dihitung berapa jumlah

penurunan sel yang mati, karena metode MTT tidak dapat digunakan untuk
menghitung jumlah sel yang mati, hanya dapat menentukan persen penghambatan
saja.
A B

Gambar 8 Sel Raji (kontrol) pada uji MTT (A) dan sel raji setelah
pemberian ekstrak (B) (perbesaran 8×10).

Berdasarkan hasil perhitungan nilai IC50, hasil uji penghambatan terhadap

sel Vero memperlihatkan bahwa ekstrak kasar baru dapat menghambat sel normal
di atas 500 µg mL-1 dengan nilai IC50 922.88 µg mL-1.. Dari uji kaempferol hasil
fraksinasi dengan KLTP pada sel normal dan sel kanker Raji, terlihat bahwa
persen penghambatan pada sel kanker Raji lebih besar daripada sel Vero bahkan
pada sel Vero dapat dikatakan tidak memiliki IC50 karena pada konsentrasi 250 µg
mL-1 ekstrak kaempferol hanya menghambat proliferasi sel sebesar 19.77%.
Berbeda dengan sel Vero, dengan pemberian ekstrak kaempferol 125 µg
mL-1 pada sel Raji, diperoleh 48.18% sel Raji yang mengalami kematian, dan
pada dosis 250 µg mL-1 persentase sel Raji yang mati meningkat dengan tajam,
yaitu 76.36% dengan IC50 110.82 µg mL-1. Nilai IC50 dari ekstrak kasar dan
ekstrak kaempferol dapat dilihat pada Tabel 2.
14
 

Tabel 2. Nilai IC50 dari ekstrak kasar dan ekstrak kaempferol terhadap sel
Vero dan sel Raji
Perlakuan Persamaan garis R2 IC50
Ekstrak metanolik pada sel y=11.13 Ln x-25.99 0.759 922.86
Vero
Ekstrak kaempferol pada sel y=7.52 Ln x-29.04 0.763 -
Vero
Ekstrak kaempferol pada sel y=13.97 Ln x-15.77 0.866 110.82
Raji