Metode analisis

6.1 Elemental Analysis

Berdasarkan hasil berbagai studi elusidasi struktur di masa lalu, beberapa proposal
yang saling bertentangan untuk molekuler molekul nystatin telah dibuat dalam literatur. Di
antara ini, bukti eksperimental terbaru mendukung komposisi unsur yang sesuai dengan rumus
empiris C47H75N017 (MW 926.13) untuk kompleks antibiotik yang belum terselesaikan;
rumus yang sama juga didalilkan untuk nistatin A159, komponen utama murni dari kompleks
nistatin, diisolasi oleh arus balik
distribusi.
Mengingat temuan bahwa nistatin bukan senyawa individu melainkan campuran
variabel dari beberapa konstituen aktif secara kimia, tugas sekarang untuk kompleks antibiotik
harus dilihat dengan cadangan, seperti yang digambarkan oleh kurangnya kesepakatan umum
antara data mikroanalisis eksperimental dan komposisi unsur teoritis untuk rumus empiris yang
diusulkan (lihat Tabel VIII untuk daftar analisis unsur yang dikutip dalam literatur).

6.2 Neutralization Equivalents

Nistatin telah dititrasi, baik sebagai basa ((dengan natrium metoksida dalam piridin dan
metanol), setara netralisasi berikut ditentukan:
6.3 Identification Tests

Nistatin dapat diidentifikasi dengan karakteristik IR dan absorpsi serapan UV, serta pola
difraksi sinar-X (lihat Bagian 2.1, 2.2 dan 2.4).
The Federal Register menggambarkan tes identitas untuk nistatin yang melibatkan rekaman
spektrum W dari nistatin dalam kisaran 220-320 nm dan penentuan absorbansi pada lima
maksimum penyerapan yang dipilih
Serangkaian tes identifikasi kimiawi non spesifik yang dikutip dalam literatur2 tercantum di
bawah ini.

Selain itu, nistatin mendekolorisasi larutan bromine-water, bromine-carbon tetrachloride,

iodine potassium iodide, dan potassium permanangate. Namun, itu tidak memberikan tes
positif dengan biuret, Fehling, besi klorida, Millon, ninhidrin, Tollens, dan reagen 2,4-
dinitrofenilhidrazin.

6.4 Color Reactions

Beberapa reaksi warna yang khas untuk nystatin telah dilaporkan '(lihat tabulasi di bawah).

Tes lain yang cocok untuk identifikasi nistatin melibatkan reaksi warna yang umum untuk
sejumlah besar macrolides polyene. Ke dalam kategori ini milik pembentukan karakteristik
dari kloroform-diekstraksi, konstituen warna kuning gelap pada pemanasan nistatin dalam
larutan natrium hidroksida, penampilan sementara dari warna merah-violet dengan asam sulfat
pekat, dan pembentukan warna biru pada penambahan asam hidroklorat pekat atau asam
trikloroasetat ke larutan alkohol dari nistatin

Laubiel mencatat bahwa warna merah muda terbentuk dengan memanaskan larutan alkohol
dari nistatin di hadapan resorsinol dan asam hidroklorat pekat (Selivas reac- tion) untuk
temperatur refluks; pada pengenceran campuran, komponen warna dapat diekstraksi menjadi
isoamil alkohol. Meskipun reaksi ini terbukti sangat sensitif dan mungkin cocok untuk
mendeteksi nistatin pada tingkat sekitar. 50 ug, metode ini tidak spesifik seperti beberapa
antibiotik lainnya menghasilkan reaksi warna yang sama.

Prosedur terkait, yang dijelaskan oleh penulis yang sama dan diklaim lebih spesifik untuk
nistatin, melibatkan reaksi larutan nistatin alkoholik dengan campuran asam hidroklorat pekat
dan garam klorida encer; intensitas komponen warna hijau yang terbentuk di reaksi ini
dilaporkan memungkinkan deteksi nistatin pada level yang identik dengan yang dikutip di atas.
Prosedur ini telah dievaluasi oleh Szucs sebagai tes identitas untuk penentuan nistatin dengan
adanya serangkaian bahan eksipien yang biasa ditemukan dalam formulasi tablet.

Reaksi warna disesuaikan untuk digunakan dalam analisis kuantitatif nistatin dengan metode
uji kolorimetrik yang tercakup dalam Bagian 6.6.

6.5 Direct Spectrophotometric Analysis

Sifat penyerapan ultraviolet nystatin dibahas dalam Bagian 2.4.
Karena struktur halus spektral yang berbeda dari antibiotik macrolide polyene, pengukuran
absorbansi ultraviolet diterima secara luas sebagai alat yang paling bijaksana dalam metodologi
analitis. Metode spektrofotometri kuantitatif untuk penentuan nistatin, memanfaatkan
penyerapan karakteristik kromofor tetraena terkonjugasi dengan pita serapan intens dekat 291,
304 dan 318 nm, telah digunakan dalam berbagai penyelidikan, termasuk diferensiasi cepat
nistatin dari macrolides polieter lainnya yang diturunkan. dari spesies Streptomyces dalam
studi stabilitas dan kimia transformasi.

Meskipun metode ini ditemukan oleh beberapa penulis untuk berkorelasi secara wajar dengan
aktivitas biologis antibiotik, namun sebagian besar penelitian telah menetapkan hubungan
marjinal yang tidak memuaskan atau hanya antara tes spektrofotometri dan biologi,
kemungkinan besar sebagai hasil dari variasi substansial dalam keadaan kemurnian dan
homogenitas produk yang diperiksa, khususnya sehubungan dengan perbedaan rasio
komponen aktif

Kurangnya kesepakatan yang memadai antara kedua metode analitis telah sangat mengurangi
kegunaan prosedur spektrofotometri ultraviolet sebagai alat untuk penilaian kemurnian produk.
Namun demikian, metode spektrofotometri sedang digunakan, untuk alasan kenyamanan,
dalam banyak aplikasi kontrol proses, terutama dalam pengukuran konsentrasi nistatin dalam
kaldu/broth fermentasi, produk yang tidak kotor/unpurified dan berbagai sampel recovery.

6.5.1 Fermentation Liquids and Products

ia menyerap nistatin pada 304 nm telah digunakan untuk menentukan konsentrasi nistatin
dalam kaldu fermentasi. Uji ini tidak mencerminkan stabilitas nistatin menjadi asam dan panas,
tetapi cocok untuk penggunaan proses control.
Uji spektrofotometri langsung lain untuk penentuan nistatin dalam kaldu fermentasi,
berdasarkan pengukuran perbedaan kepunahan pada 304,5 dan 312 nm, dilaporkan oleh
Doskochilova dan Gess. Metode desscribed diklaim memberikan hasil yang sebanding dengan
yang diperoleh dengan uji biologis, menggunakan strain actidione-tahan Candida albicans
(BUCAV 44) sebagai organisme uji dalam metode budidaya piring. Kesepakatan yang
memuaskan antara kedua metode spektrofotometri dan biologi dilaporkan dipertahankan
selama keseluruhan proses fermentasi. Namun, pada fermentasi berkepanjangan di luar
pencapaian aktivitas antibiotik maksimum, kedua metode mulai menyimpang dari satu sama
lain, dengan uji biologis menunjukkan penurunan tajam aktivitas cairan kultur daripada yang
dipantulkan oleh metode spektrofotometri. Para penulis menjelaskan perbedaan ini dengan
kemungkinan dekomposisi antibiotik pada fermentasi yang diperpanjang, hilangnya bioaktif
bersamaan, tetapi retensi selama dekomposisi kromofor polyene bertanggung jawab untuk
penyerapan ultraviolet nistatin.
Prosedur pemeriksaan spektrofotometri alternatif untuk penentuan nistatin, yang
dikembangkan oleh Sherman et al. mencoba mempertanggungjawabkan keberadaan zat ballast
pengabsorbsi ultraviolet dalam cairan fermentasi dan intermediet yang tidak dimurnikan yang
sebaliknya cenderung mempengaruhi keakuratan yang diinginkan dari metode pengujian
kuantitatif berdasarkan pengukuran kepunahan. Metode diferensial yang diusulkan, berlaku
untuk kedua kaldu dan sampel produk terisolasi, melibatkan pengukuran ion nukatin yang telah
punah (dalam campuran metanol / dimethylsulfoxide) pada maksimum penyerapan pada
kisaran 302-306 nm, ditambah penentuan kepunahan untuk minimum pada kedua sisi
penyerapan puncak. , yaitu, dekat 295 dan 312 nm, masing-masing. Rincian prosedur
kuantitatif yang dikembangkan untuk penentuan kaldu nistatin dan kemurnian produk massal
dalam kaitannya dengan sampel standar diuraikan di bawah ini:

(a) Nystatin in Broth

Prosedur
Ukur 20 ml kaldu utuh yang dicampur dengan baik dan pindahkan ke tabung ulir sekrup 6 "x
1". Untuk deaerate sampel kaldu, putar selama 5 menit pada 2000 rpm dalam centrifuge yang
sesuai, dan lagi campurkan isi tabung reaksi pada Vortex Mixer selama 15-30 detik. Pipet 2 ml
dari sampel yang dicampur dengan baik ke dalam 100 ml labu ukur, tambahkan 75 ml
dimethylsulfoxide dan agitasi pada rotary shaker dengan kecepatan sedang selama 15 menit.
Bawa ke volume dengan dimethylsulfoxide, kocok dengan tangan untuk mencampur dan
menyaring campuran dengan gravitasi melalui kertas saring What-man # 4.

Pipet 2 ml filtrat jernih ke dalam labu ukur 100 ml, tambahkan ke volume dengan metanol
absolut dan aduk rata. Bacalah sampel terhadap reagen kosong (2 ml dimethylsulfoxide,
dibawakan hingga 100 ml dengan metanol absolut) pada spektrofotometer yang sesuai dalam
1 cm sel silika. Tentukan absorbansi maksimum untuk nistatin di wilayah 302-306 nm, dan
tentukan absorbansi pada minima pada sisi puncak ini (di kisaran 296 dan 312 nm).

Standardisasi
Timbang secara akurat sekitar 5 mg serbuk nistatin standar dan pindahkan ke dalam labu ukur
500 ml. Tambahkan 5 ml dimethylsulfoxide dan larutkan bubuk. Bawa ke volume dengan
metanol mutlak dan aduk rata. Baca solusi standar terhadap reagen kosong dalam 1 cm sel
silika pada spektrofotometer yang sesuai. Simpan pertahankan lebar celah konstan dan
pertahankan pengaturan yang sama untuk sample assay. Tentukan absorbansi maksimum
nistatin dalam kisaran 302-306 nm dan minima di setiap sisi puncak ini.
(b) Produk Nistatin
Prosedur Timbang secara akurat 85-105 mg nystatin ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan
10 ml dimethylsulfoxide dan kocok untuk melarutkan bubuk. Bawa ke volume dengan metanol
mutlak dan aduk rata.

Pipet 1 ml larutan jernih ke dalam labu ukur 100 ml, tambahkan ke volume dengan metanol
absolut dan aduk rata. Bacalah sampel terhadap metanol absolut sebagai reagen kosong pada
spektrofotometer yang sesuai dalam sel silika 1 cm. Tentukan absorbansi maksimum untuk
nistatin di daerah 302-306 nm, dan tentukan absorbansi pada minimum di kedua sisi puncak
ini (dalam kisaran 296 dan 312 nm).

6.5.2 Pharmaceutical Preparations

Aiteanu dan Medianu memeriksa stabilitas nistatin dalam N, N dimethylformamide (DMF) / campuran etanol dan
menemukan solusi tersebut stabil selama 24 jam, seperti yang disimpulkan dari pengukuran koefisien extinction
untuk maksimum penyerapan pada 291, 304, dan 318 nm.

6.5.3 Other Applications

Aplikasi khusus dari teknik spektrofotometri ultraviolet untuk pemeriksaan transformasi kimia nistatin
telah dilaporkan oleh Bolshakova et al. penulis yang terakhir memeriksa penambahan yodium
monoklorida dan bromin ke nistatin dengan kombinasi metode kromatografi spektrofotometri, titrimetri
dan lapis tipis dalam upaya untuk mengkorelasikan aktivitas biologis dengan kandungan tetraena dari
sejumlah besar produksi nistatin. batch. Rincian lebih lanjut dibahas dalam Bagian 6.10.

Wayland dan Weiss mengembangkan sistem uji identitas kimia untuk karakterisasi antibiotik yang spesifik dan
positif dalam disk sensitivitas untuk melengkapi informasi kuantitatif yang diperoleh dengan teknik pengujian
mikrobiologi. Sistem ini cocok untuk microquantities yang terlibat dalam disk antibiotik, secara positif
mengidentifikasi sifat kimia dari antibiotik dalam sampel disk yang tidak diketahui dan diskrining dari antibiotik
disk lain. Dalam skema ini prosedur uji kimia - yang melibatkan urutan kolorografi, TLC dan uji kromatografi
kertas, dalam kombinasi dengan respon mikrobiologi dan data potensi - nistatin diidentifikasi oleh karakteristik
puncak penyerapannya pada 291, 304, dan 318 nm.

Survei umum metode spektrofotometri untuk Penentuan antibiotik di daerah ultraviolet dan inframerah
telah diterbitkan oleh Unterman pada tahun 1965.

6.6 Colorimetric Analysis

Beberapa metode kolorimetri telah diterbitkan untuk penentuan nistatin sebagai bahan curah dan dalam
formulasi farmasi.

Metode paling awal yang dijelaskan oleh Laubielg7 dan Szucs adalah prosedur semi-kuantitatif
berdasarkan pembentukan komponen warna yang berbeda (lihat juga Bagian 6.4).

Karakteristik pewarnaan juga dibentuk pada perlakuan larutan dimetilformamida nistatin dengan natrium
hidroksida encer atau asam hidroklorat pekat1 ''. Reaksi terakhir, dijelaskan oleh Ozsos, menghasilkan warna biru
muda pada penambahan 0,25 ml HC1 pekat ke larutan 25-100 unit nistatin dalam 0,1 ml DMF, hanya digunakan
sebagai uji kualitatif dalam identifikasi nistatin, khususnya dalam formulasi salep.

Reaksi warna yang dihasilkan dari campuran natrium hidroksida encer ke larutan DMF dari nistatin yang
dilaporkan oleh Unterman, bagaimanapun, telah dikembangkan sebagai prosedur kuantitatif yang cocok untuk
analisis antibiotik dalam formulasi tablet.

Unterman juga menemukan bahwa nystatin menghasilkan warna kuning kemerahan ketika direaksikan dalam
larutan DMF dengan AlC13, dan mengusulkan bahwa reaksi digunakan sebagai metode kuantitatif untuk
penentuan antibiotik. Kemudian menyusun kondisi reaksi optimum, membentuk hubungan linier antara
konsentrasi nistatin dan absorbansi komponen warna pada 435 nm dan berdasarkan pada kesepakatan yang baik
antara data pengujian kolorimetri dan biologi yang disesuaikan metode ini untuk pengujian kuantitatif antibiotik
dalam sediaan farmasi.

Reaksi warna yang berbeda, juga dilaporkan oleh Unterma, melibatkan pembentukan kompleks
berwarna kuning-coklat pada pengobatan nistatin dengan titanium metanolik anhidrat 6% larutan
tetraklorida. Karakteristik spektrum absorpsi untuk kompleks ini berbeda dari antibiotik induk, tetapi
mempertahankan daya serap unik maksimum pada 318 nm; reaksinya belum disesuaikan untuk
penggunaan kuantitatif. Namun, sebuah reaksi warna terkait yang dijelaskan oleh Mazor dan Papay,
berdasarkan pada pembentukan kompleks warna coklat kemerahan pada penambahan larutan TiC14
di DMF ke larutan nistatin dalam pelarut yang sama, telah diusulkan sebagai metode untuk
penentuan kolorimetri nistatin.

Kompleks yang dihasilkan dengan rasio molar nistatin: titanium 1: 3 menunjukkan absorbansi kuat pada
450 nm dan formasinya mematuhi Lambert- Hukum Beer. Sebagai kompleks berwarna tidak lagi
menunjukkan penyerapan yang signifikan dalam rentang ultraviolet, penulis menganggap bahwa
nistatin terurai di bawah kondisi reaksi dan kompleks yang dihasilkan, pada kenyataannya, terbentuk
dengan salah satu produk dekomposisi.