LAPORAN PRAKTIKUM

KROMATOGRAFI

ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI

KOLOM

Disusun Oleh:

Sintia Ayu Widyawati

NIM 36.2015.7.1.1125

PRODI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS DARUSSALAM GONTOR

2017
I. Tujuan
1. Melakukan isolasi pigmen tanaman dengan kromatografi kolom

II. Dasar Teori

Kromatografi kolom adalah suatu teknik pemurnian yang
digunakan untuk mengisolasi komponen yang diinginkan dari suatu
campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (absorben padat)
ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak (cairan)
ditempatkan pada bagian atas kolom dan bergerak ke bawah melewati
kolom (karena gravitasi atau tekanan eksternal). Sampel yang akan
dianalisis dimasukkan ke bagian atas kolom. Eluen ditambahkan ke
dalam kolom dan bergerak ke bawah melewati kolom. Keseimbangan
terjadi antara komponen yang terabsorpsi pada absorben dengan
pelarut yang terelusi melewati kolom. (Basset.1994)
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan
diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada
dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Kolom
kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi
(gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca
yang dilengkapi kran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk
mengatur aliran pelarut. (Gritter.1991)
Klasifikasi kromatografi kolom berdasarkan interaksi komponen
dengan absorben adalah:
a. Kromatografi adsorbia adalah kromatografi yang adsorbsi,
komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada
permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom.
b. Kromatografi partisi, dalam kromatografi partisi komponen yang
dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lapisan cairan
tipis pada penyangga padat yang bertidak sebagai fase diam dan
eluen yang bertindak sebagai fase gerak.
c. Kromatografi pertukaran ion adalah kromatografi yang
memisahkan komponen yang berbentuk ion, komponen-komponen
tersebut yang terikat pada penukar ion sebagai fase diam secara
selektif akan terlepas.
d. Kromatografi filtrasi gel, dalam kromatografi filrasi gel, kolom
diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase diam. Pemisahan
berlangsung seperti proses pengayakan yang didasarkan atas
ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan. (Khopkar.2000)
III. Alat dan Bahan
A. Alat
1. Statif dan klem : 1buah
2. Gelas Beaker 250mL : 4buah
3. Gelas ukur : 7buah
4. Pipet tetes plastik : 5buah
5. Corong : 2buah
6. Lumpang dan alu : 1buah
7. Kolom : 1buah
8. Corong pisah : 1buah
9. Botol vial : 8buah
10. Pipet tetes : 1buah

B. Bahan
1. Silika gel
2. Daun bayam
3. Solven pro analysis: aseton, n-heksan, metanol
4. Kapas
5. Alumunium foil
6. Na2SO4 anhidrat

IV. Prosedur Kerja

A. Penyiapan Kolom dan Fase diam

Menyiapkan kolom untuk

kromatografi

Memasukkan kapas pada bagian

bawah kolom, kran dalam keadaan
tertutup

Mencampurkan 3gram silika dengan

pelarut n-heksan

Menuangkan bubur alumina ke dalam

kolom hingga ketinggian 10cm
 Membuka kran kolom dan
mengalirkan keluar n-heksan hingga
1cm di atas permukaan silika

Menutup kolom dengan alumunium

foil

B. Ekstraksi Daun Bayam

Memotong daun bayam sampai

berukuran kecil kemudian dihaluskan
di dalam mortar

Menmbahkan 5ml aseton

Menyaring ekstrak dengan corong

gelas dilapisi dengan kertas saring

Memasukkan anhidrat ke dalam kertas

saring

Membasahi kertas saring dengan

aseton

Ekstrak daun bayam

C. Pemisahan Ekstrak Daun Bayam

Memasukkan 5ml aquades, 5ml n-

heksan, 5ml ekstrak daun bayam ke
dalam corong pisah
 Mengocok ke arah dalam dan
mendiamkannya

Menunggu sampai terjadi pemisahan

Memisahkan pelarut dan ekstrak daun

bayam

Memasukkan ekstrak daun bayam ke

dalam vial

D. Persiapan Elusi

Menyiapkan eluen, 5ml n-heksan, 5ml

n-heksan:aseton (7:3), 5ml aseton,
5ml aseton: metanol (8:2), 5ml
metanol

Memasukkan ekstrak daun bayam ke

dalam kolom

Memasukkan eluen satu persatu

sesuai urutan sedikir demi sedikit

V. Data Pengamatan

No Perlakuan Pengamatan
Larutan ekstrak berwarna hijau
1 Ekstraksi daun bayam pekat
Pemisahan ekstrak dengan corong Larutan berwarna hijau sedikit
2 pemisah pekat
3 Kromatografi kolom 1. n-heksan: -bening
2. n-heksan : aseton
-warna bening
-coklat kekuningan (feofitin B)
 3. Aseton
-hijau kekuningan (xantofil)
-hijau muda pucat (klorofil B)
4. Aseton : metanol
-hijau tua (klorofil A)
5. Metanol
-hijau muda jernih (klorofil B)

VI. Pembahasan
Dalam praktikum ini dilakukan percobaan untuk mengetahui
pigmen daun bayam dengan kromatografi kolom. Yang pertama yang
harus dilakukan adalah pembuatan kolom dan fase diam yaitu dengan
menyiapkan kolom untuk kromatografi kemudian dimasukkan kapas
pada bagian bawah kolom, hal ini bertujuan untuk menahan fase diam
agar tidak turun dari kolom, karena kolom masih berpori sehingga
ekstrak daun bayam masih bisa mengalir.
Selanjutnya membuat adonan bubur alumina dengan pelarut n-
heksan, penggunaan n-heksan ini karena n-heksan dapat mengikat kuat
dengan alumina, jadi bubur alumina merupakan fase diam akan lebih
homogen, hal ini dilakukan dengan mencampurkan 3 gram silika
dengan pelarut n-heksan. Selanjutnya bubur alumina dimasukkan ke
dalam kolom sambil mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk
gelembung udara, kolom harus bebas dari gelembung gas karena bila
ada gelembung udara maka proses pemisahan yang terjadi tidak akan
sempurna sehingga akan terjadi penyebaran noda ketika hasil
kromatografi kolom diuji dengan KLT. Penuangan bubur alumina pada
kolom hingga ketinggian 10cm, kemudian membuka kran kolom dan
mengeluarkan n-heksan hingga 1cm di atas permukaan silika
kemudian kolom ditutup dengan alumunium foil.
Prosedur kerja selanjutnya adalah ekstraksi daun bayam, dengan
memotong daun bayam hingga berukuran kecil kemudian dihaluskan
di dalam mortar. Ditambahkan 5ml aseton. Penghalusan ini bertujuan
agar senyawa yang terkandung di dalam daun bayam mudah larut
dengan pelarut aseton, sebab semakin halus daun maka semakin luas
permukaan untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak
zat yang terekstrak. Aseton efektif untuk mengekstrak pigmen
tumbuhan karena sebagian besar pigmen tumbuhan seperti klorofil,
karoten dan xantofil memiliki sifat diantara polar dan non polar,
sehingga dapat larut dalam aseton yang merupakan pelarut semi polar.
Namun proses ini harus dilakukan dengan cepat karena enzim
klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis
reaksi antara klorofil dengan aseton sehingga jumlah klorofil dalam
daun akan berkurang, kemudian menyaring ekstrak dengan corong
gelas dilapisi dengan kertas saring dengan memasukkan anhidrat ke
dalam kertas saring hal ini bertujuan untuk mempermudah proses
ekstraksi dan kemudian membasahi kertas saring dengan aseton.
Dilanjutkan dengan pemisahan ekstrak daun bayam dengan corong
pisah, dengan memasukkan 5ml aquades, 5ml n-heksan, 5ml ekstrak
daun bayam ke dalam corong pisah, kemudian mengocok ke arah
dalam dan mendiamkannya agar antara pelarut dan fase organik dapat
terpisah kemudian ekstrak daun bayam disimpan di dalam vial.
Selanjutnya elusi pigmen daun bayam dengan kromatografi kolom,
setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun bayam
dimasukkan ke dalam kolom. Lalu memasukkan eluen ke dalam kolom
dan membuka krannya. Disini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun
bayam mulai bergerak turun dan mulai menetes. Tetesan yang keluar
dari kolom ini ditampung dalam vial dan mengganti vial ketika warna
yang keluar dari kolom berubah. Larutan berwarna ini adalah pigmen
dari daun bayam. Adapun pelarut yang digunakan adalah berdasarkan
kepolarannya yang paling kecil yaitu n-heksan, n-heksan : aseton (7:3),
aseton, aseton: metanol (8:2), dan metanol. Pelarut ini digunakan pada
kromatografi kolom secara berurutan.
Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut yaitu dengan
memasukkan 5ml n-heksan namun disini praktikan melakukan
kesalahan yaitu hanya memasukkan 1ml n-heksan seharusnya
memasukkan 5ml n-heksan. Dengan pelarut n-heksan menghasilkan
larutan berwarna bening. Selanjutnya n-heksan : aseton (7:3)
menghasilkan warna bening dan coklat kekuningan yang berarti
mengandung feofitin B. Selanjutnya 5ml aseton menghasilkan warna
hijau kekuningan yang berarti mengandung xantofil dan menghasilkan
warna hijau muda pucat yang berarti mengandung klorofil B.
Kemudian aseton : metanol (8:2) diambil 5ml menghasilkan warna
hijau tua yang berarti mengandung klorofil A dan yang terakhir 5ml
metanol menghasilkan warna hijau muda jernih yang berarti
mengandung klorofil B.
Dan pada dasarnya kromatografi kolom adalah teknik pemisahan
dengan menggunakan fase berupa padatan dan fase gerak berupa
cairan. Mekanisme pemisahan komponen dengan kromatografi kolom
mempunyai mekanisme yang sama seperti KLT. Pemisahan didasarkan
pada perbedaan kekuatan interaksi molekul anatara komponen yang
dipisahkan dengan fase diamdan fase gerak. Kromatografi kolom dapat
digunakan untuk mengidentifikasi suatu komponen yang terdapat
dalam suatu cuplikan.
 ` kromatografi kolom memiliki kelebihan diantaranya yaitu dapat
digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif, dapat digunakan
untuk menentukan jumlah komponen campuran, dan dapat digunakan
untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Selain itu, kromatografi
kolom juga memiliki kekurangan yaitu membutuhkan kemampuan
teknik dan manual untuk menyiapkan kolom dan juga membutuhkan
waktu yang lama.

VII. Kesimpulan
Pigmen yang terdapat pada daun bayam adalah:
1. Coklat kekuningan (feofitin B)
2. Hijau kekuningan (xantofil)
3. Hijau muda pucat (klorofil B)
4. Hijau tua (klorofil A)
5. Hijau muda jernih (klorofil B)

VIII. Daftar Pustaka

Basset.J.1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.
Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta
Day. R. A. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi IV. Penerbit
Erlangga Jakarta
Gritter.R.J.1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung
Khopkar.S.M. 2000. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press.Jakarta
Sudjadi.1998. Metode Pemisahan. Kanisius. Yogyakarta
Shevia.G.1990. Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan
Semimikro. PT. Kaliman Media Pustaka. Jakarta