KROMATOGRAFI KOLOM DAN LAPIS TIPIS

(PEMISAHAN DAN PEMURNIAN -KAROTEN DARI EKSTRAK WORTEL)

A. Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan kali ini dapat dilihat sebagai berikut :

1. Melakukan tehnik-tehnik dasar kromatografi kolom dan lapis tipis pada proses

isolasi dan pemurnian senyawa bahan alam.

2. Menjelaskan perbedaan prinsip dasar kromatografi kolom dan lapis tipis.

B. Landasan Teori

Pemilihan teknik kromotografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan

dan keatsirian senyawa yang akan dipisahkan. KLT merupakan metode pilihan untuk

memisahkan semua kandungan yang larut dalam lipid, yaitu lipid, steroid, karotenoid,

kuinon sederhana dan klorofil. Sebaliknya, teknik KGC (Kromatografi Gas Cair),

penggunaan utamanya ialah pada pemisahan senyawa atsiri, yaitu asam lemak,

hidrokarbon dan senyawa belerang (Harborne, 1987).

Fasa diam yang biasa digunakan dalam kromotografi lapis tipis (KLT) adalah

serbuk silica gel, alumina tanah diatome, selulosa, dan lain-lain yang merupakan

butiran yang berukuran kecil (0,063 0,125 mm) dilapiskan pada kaca, lembaran

alumina maupun plastik dengan ketebalan tertentu. Proses pengembangannya

dilakukan dalam wadah tertutup yang diisi eluen dan dijenuhi uap eluen agar

dihasilkan pemisahan yang baik dan dapat diulang. Kromotografi kolom lazimnya

digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa dalam skala preparatif. Pada
prinsipnya seseorang dapat secara mudah memilih ukuran dan isi kolom sesuai jenis

dan jumlah cuplikan yang akan dipisahkan (difraksinasi). Kromotografi kolom (KK)

dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau dengan tekanan lebih besar dari atmosfer

dengan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen. Untuk keberhasilan pemakai

dalam bekerja dengan kromatografi kolom, maka syarat utamanya adalah mengetahui

gambaran pemisahan cuplikan pada kromotografi lapis tipis (Anwar, 1994).

Komoditas pertanian sumber vitamin A salah satunya adalah wortel. Buah

wortel banyak mengandung protein, mineral, karoten, dan vitamin (Rubatzky, 1998).

Kandungan gizi terpenting pada buah wortel adalah pro-vitamin A yang berbentuk

-karoten, yang terdapat pada khloroplas dan khromoplas. -karoten merupakan

senyawa organik yang berantai karbon panjang dan bersifat non polar (Susilawati).

kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan suatu cara pemisahan komponen

senyawa kimia di antara dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam (Kartasubrata 1987).

Teknik tersebut hingga saat ini masih digunakan untuk mengidentifikasi senyawa-

senyawa kimia, karena murah, sederhana, serta dapat menganalisis beberapa

komponen secara serempak (Hernani 1999). Teknik standar dalam melaksanaka

pemisahan dengan KLT diawali dengan pembuatan lapisan tipis adsorben pada

permukaan plat kaca (Institut Teknologi Bandung 1995). Tebal lapisan bervariasi,

bergantung pada analisis yang akan dilakukan (kualitatif atau kuantitatif) (Eni hayani,

2005).

Pemisahan komponen secara kromatografi kolom dilakukan dalam suatu

kolom yang diisi dengan fase stasioner dan cairan (pereaksi) sebagai fase mobil untuk
mengetahui banyaknya komponen contoh yang keluar melalui kolom (Adnan 1997).

Pengisian kolom dilakukan dengan memasukkan adsorben dalam bentuk larutan

(slurry), dan partikelnya dibiarkan mengendap. Pemisahan komponen rimpang temu

kunci secara kromatografi kolom bertujuan untuk mengetahui komponen-komponen

senyawa kimia yang dapat terpisah dan kandungan senyawa aktifnya (Eni Hayani,

2007).
C. Alat dan Bahan

1. Alat

Kolom kromatografi Cutter

Statif dan klem Evaporator

Gelas kimia 250 ml Alat refluks

Pipet ukur 25 ml Erlenmeyer

Filler dan corong Chamber

Batang pengaduk Pipet tetes

Pipa kapiler elektromantle

Rensil Aluminium foil

Penggaris Kertas Saring

2. Bahan

Sampel wortel

Silika gel/alumina

Tissue

Aseton

n-heksan

Plat KLT

Kapas
Prosedur Kerja

1. Kromatografi Kolom

n-heksan

- dimasukkan dalam kolom

- ditambahkan campuran silika gel dan n-
heksan sambil diaduk

Fasa Diam

- dibiarkan mengeras sambil ditambahkan

secara kontinu pelarut n-heksan : aseton
- dimasukkan campuran ekstrak wortel yang
diimpregnasi
- dibiarkan zat terelusi melalui fasa diam
- ditampung eluat yang keluar dari kolom

Eluat

- dipekatkan dengan evaporator

Eluat Pekat
2. kromatografi Lapis Tipis

Eluat Pekat
- ditotolkan pada plat KLT pada batas yang
diberikan

Eluat pada Plat KLT

- dimasukkan dalam chamber berisi pelarut n-

heksan : aseton perbandingan 8:2
- dibiarkan eluat terelusi
- diamati bercak atau noda pada plat KLT
dibawah lampu UV
- ditandai bercak atau noda tersebut dengan
pensil
- dihitung Rf-nya

Hasil pengamatan
E. Hasil Pengamatan

1. Rangkaian Alat

Kolom Kromatografi

Klem
Pelarut (Fasa Gerak)

Sampel
Kertas Saring
Statif Silika Gel (Fasa Diam)
Kertas Saring
Kapas

Gelas Kimia
2. Data Pengamatan
Eluat

4 cm ( eluen)

3,75 cm
3,7 cm

A B C
Perhitungan :

Eluen : n heksan : aseton( 8:2)

jarak noda
Rf1 = jarak eluen
 3,7cm
= 4 cm = 0,95 cm

jarak noda
Rf 2 = jarak eluen

3,75cm
= 4 cm
= 0,9375 cm

jarak noda
Rf 3 = jarak eluen

3,75cm
= 4 cm
= 0,9375 cm

F. Pembahasan

Teknik dasar dalam pemisahan KLT yaitu larutan campuran senyawa yang akan

dipisahkan ditotolkan pada bagian bawah pelat yang telah ditandai dengan

menggunakan pipet mikro/pipa kapiler. Plat kromatografi kemudian dikembangkan

dengan dicelupkan pada chamber yang berisi zat pengelusi. Pengembangan tersebut

menyebabkan masing-masing komponen senyawa dalam sampel akan bergerak ke

atas dengan kecepatan yang berbeda.

Wortel sudah lama dianggap berkhasiat memperbaiki penglihatan. Hal ini

disebabkan wortel kaya beta-karoten. Zat itu di dalam tubuh akan diubah menjadi

vitamin A, zat gizi yang sangat penting untuk fungsi retina. Selain berperan sebagai

provitamin A, beta-karoten dipercaya sebagai pelindung terhadap kanker karena ia

merupakan anti oksidan. Zat anti oksidan sangat berguna untuk melawan zat Radikal

Bebas yang berasal dari zat-zat racun. Radikal Bebas adalah awal dari penyakit,
termasuk disini adalah penyakit jantung yang sangat ditakuti. Dengan adanya zat anti

oksidan yang antara lain adalah Beta Karoten, dapat jauh mengurangi resiko terkena

panyakit jantung. Mengingat kegunaannya yang sangat besar maka -karoten telah

banyak diisolasi dari tumbuhan seperti wortel.

Hal inilah yang dipelajari dalam percobaan ini yaitu pemisahan dan

pemurnian senyawa -karoten hasil isolasi dari ekstrak wortel. Pemisahannya

dilakukan dengan cara kromatografi kolom dan lapis tipis. Kadar -karoten dalam

wortel dapat diamati dari warnanya yaitu makin jingga warna wortel, makin tinggi

kadar beta-karoten wortel. Hal ini disebabkan -karoten merupakan pigmen berwarna

kuning. Kromofor dalam -karoten merupakan sistem 11 ikatan rangkap terkonjugasi

geometris trans. Sifat kromofor dari struktur senyawa ini mudah dikenali di bawah

lampu UV sehingga memudahkan identifikasi dalam kromatografi lapis tipis.

Dalam percobaan ini, isolasi -karoten dilakukan dengan metode refluks dan

evaporasi. Sampel yaitu serbuk wortel dilarutkan dalam pelarut kloroform dan

direfluks sehingga terjadi reaksi di mana senyawa-senyawa karotenoid yang

terkandung dalam wortel menguap bersama pelarutnya. Ekstrak yang terbentuk

kemudian dipisahkan dari pelarutnya dan dipekatkan dengan evaporator sehingga

akan terbebas dari pelarutnya.

Ekstrak pekat hasil evaporasi kemudian ditambahkan pelarut aseton, serbuk

silika gel, dan n-heksan secukupnya. Tujuan ditambahkannya silika gel pada ekstrak
karotenoid sebelum dipartisi dalam kolom adalah agar ekstrak teradsorpsi pada silika

gel yang memudahkan dalam proses elusinya oleh n-heksan. Silika gel memiliki

aktivitas kimia yang kecil namun memiliki luas permukaan yang besar sehingga

disukai untuk pemisahan senyawa-senyawa organik yang peka terhadap perubahan-

perubahan karena aktivitas permukaan yang mempunyai sifat katalitik. Silika gel

yang telah mengadsorpsi ekstrak karotenoid kemudian dimasukkan ke dalam kolom

berisikan eluen n-heksan sebagai fasa gerak dan adsorben silika gel sebagai fasa diam

sehingga terpartisi di antara keduanya. Dalam prosesnya, eluen n-heksan yang

ditambahkan mengalir sepanjang kolom sambil memperkolasi ektrak di celah-celah

fasa diam sehingga terpartisi dengan warna yang berbeda untuk komponen yang

berbeda.

Pada bagian bawah kolom yang digunakan dalam proses kromatografi, diberi

kapas dan kertas saring yang digunakan untuk menyangga isian yaitu adsorben silika

gel. Pengisian adsorben dan eluen harus seragam, di mana pengisian kolom yang

tidak seragam akan menghasilkan rongga-rongga di tengah-tengah kolom. Dibagian

atas isian juga diberi penahan kertas saring sehingga laju elusi dapat dikontrol dan

dibuat konstan. Hal ini disebabkan elusi yang terlalu cepat tidak akan mampu

mengadakan pemisahan yang sempurna, sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan

menyebabkan waktu retensi yang terlalu lama. Dari hasil fraksinasi dengan

kromatografi kolom tersebut diperoleh empat fraksi eluat yang warnanya terlihat

dengan jelas berbeda.

 Pada tahap selanjutnya, seluruh fraksi yang terbentuk dimonitor kandungan

kimianya dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Pada kromatografi jenis ini,

digunakan pelat sebagai fasa diamnya dan pelarut atau campuran pelarut sebagai fasa

gerak. Berbeda dengan kromatografi kolom, pada KLT digunakan suatu pelat tipis

yang berupa aluminium yang dilapisi dengan adsorben (silika gel). Pada prinsipnya,

kromatografi kolom berdasarkan pada gaya grafitasi sedangkan pada KLT

berdasarkan gaya kapilaritas karena penyerapan eluen naik ke atas permukaan silika.

Dalam percobaan ini, keempat fraksi yang terbentuk masing-masing ditotolkan pada

pelat KLT, yang kemudian dikembangkan dalam campuran pelarut atau eluen n-

heksan dan aseton dengan perbandingan 8 : 2. Campuran pelarut atau eluen sebagai

fasa gerak akan merembes atau bergerak naik sepanjang pelat sambil mengelusi

cuplikan. Setelah sampai pada batas yang ditentukan, elusi dihentikan.

Pada kromatografi lapis tipis, senyawa bergerak atau terpisah berupa bercak

(spot), di mana untuk senyawa berwarna spot ini dapat langsung diamati tetapi untuk

spot yang tidak terlihat dengan mata telanjang, maka dapat digunakan reagen tertentu

yang dapat memberikan reaksi warna atau dapat dilihat dengan menggunakan alat

bantu lampu UV. Dalam percobaan ini digunakan serium sehingga dapat terlihat

bercak pada pelat KLT. Dari gambaran bercak pada KLT terlihat adanya distribusi

pemisahan bercak ekstrak karotenoid dalam tiap-tiap fraksi yang diduga mengandung

-karoten. Analisis KLT menunjukkan kesamaan profil (komponen) pada fraksi II

dan III serta berbeda dengan fraksi I. Hal ini dapat terlihat dari nilai Rf pada fraksi I
sama dengan 0,95 dan nilai Rf pada fraksi II sama dengan fraksi III yaitu 0,9375. Hal

ini mungkin disebabkan oleh komponen yang terpartisi pada fraksi II memiliki

kesamaan dengan fraksi III. Dari hasil percobaan tidak dapat ditentukan senyawa -

karoten murni sebab diperlukan pemisahan lebih lanjut dan karakterisasi untuk

menentukan senyawa murni -karoten.

G. Kesimpulan

Berdasarkan tujuan dan pembahasan yang telah dikemukakan sebelumnya,

maka dapat isimpulkan bahwa :

1. Proses isolasi dan pemurnian senyawa bahan alam dapat dilakukan dengan

menggunakan teknik kromatografi kolom dan KLT.

2. Perbedaan prinsip dasar kromatografi kolom dan lapis tipis ialah teknik

pemisahan kromatografi kolom menggunakan kolom dan KLT menggunakan

plat/planar. Fasa diam pada kromatografi kolom berupa silika gel sedangkan fasa

diam pada KLT adalah alpisan tipis air yang terikat oleh udara lembab pada

silika gel/alumina. Mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom adalah

adsorpsi sedangkan pada KLT adalah partisi.

 DAFTAR PUSTAKA

Anwar, C. dkk., 1994, Pengantar Praktikum Kimia Organik, Universitas Gadjah

Mada, Yogyakarta.

Harborne, J.B., 1987. Metode Fitokimia. ITB. Bandung

Hayani, Eni., 2007, Pemisahan Komponen Rimpang Temu Kunci Secara

Kromatografi Kolom, Buletin Teknik Pertanian Vol. 12 No. 1.

Hayani, Eni., dan Sukmasari, may., 2005, Teknik Pemisahan Komponen Ekstrak
Purwoceng Secara Kromatografi Lapis Tipis, Buletin Teknik Pertanian Vol.
10. Nomor 2.

Susilawati, Nurdin SU., dan Fitriani, TR., 2008, Pengaruh Konsentrasi Gum Arab
dan Minyak Kedelai Terhadap Konsentrasi -Karoten, Stablitas dan Sifat
Organoleptik Sari Wortel (Daucus Carolata L.), Jurusan Teknologi Hasil
Pertanian, Universitas Lampung.
 TUGAS SETELAH PRAKTIKUM
Soal :
1. Cari dan jelaskan apa perbedaan struktur likopen dan -karoten serta pengaruhnya

pada perbedaan fungsi dan kereaktifannya.

2. Mengapa dari nilai Rf senyawa hasil isolasi dapat diketahui jenis senyawanya,

bagaimana cara mengetahui hal tersebut.

Jawaban :
1. Struktur Betakaroten :

Betakaroten

Struktur Likopen :

Likopen

Perbedaan : Cincin betakaroten ttak dengan posisi trans sehingga faktor steriknya

baik. Akibatnya cenderung stabil dan kurang relative. Pada likopen, letak cincin

ialah cis sehingga factor steriknya besar. Akibatnya, kurang stabil dan lebih

relatif.

2. Setiap senyawa memiliki nilai Rf yang berbeda, sehingga dapat diketahui jenis

senyawa hanya dari Rf. Dan apabila Rf senyawa yang dihasilkan sama dengan Rf
secara teori atau sama dengan Rf larutan pembanding, maka dapat dikatakan

bahwa hasil isolasi dari senyawa adalah yang diinginkan.