Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson yng

menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :

1. Pewarnaan dengan Carbol Fuchsin 3 %
Pewarnaan pertama ini, akan sulit menembus dinding dari Bakteri tahan asam, sehingga
dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel bakteri tersebut sehingga warna carbol
fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun perlu diperhatikan, pemanasan dilalukan
jangan sampai mendidih cukup samapai menguap agar sel-sel bakteri tersebut tidak rusak.
2. Penambahan larutan asam alcohol 0,3 %
Penambahan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna
(decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah mampu menyerap
warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali tertutup dalam pada suhu semula.
Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam alcohol ditunggu samapai 5 menit. Saat
penambahan asam alcohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan dilunturkan kembali warna
carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu mengikat kuat seperti halnya bakteri BTA.
3. Pemberian zat warna Methylene Blue
Terakhir dilakukan penambahan Methylene blue. Methylene Blue merupakan pewarna
tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah
kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam alkohol.
Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang permeabilitas dinding
selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA terekstraksi oleh asam alkohol,
sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA
dinding selnya sudah terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak dapat masuk
sehingga sel bakteri BTA berwarna merah.
Waktu yang dipelukan untuk menunggu setiap warna juga berbeda. Hal ini dilakukan untuk
menghindari terjadinya kesalahan pada saat pembacaan preparat pada mikroskop.
1. Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan dilakukan
pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna pada dinding bakteri dan
dinding selnya kembali seperti semula setelah dilakukan pemanasan.
2. Menunggu selama ½ menit setelah penambahan larutan asam alkohol bertujuan agar zat warna
dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa.
 3. Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene blue bertujuan agar cat ini
dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BTA sehingga ada perbedaan warna antara
bakteri BTA dan Non BTA.
Setelah pewarnaan dan menunggu selama waktu diatas, dilakukan pembilasan dengan aquadest
yang bertujuan untuk membilas zat warna yang berlebih sebelum dilanjutkan dengan pewarnaan
berikutnya.

4.1.2. Hal yang perlu diperhatikan

Fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna yang tidak terikat
oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol jangan sampai berlebih karena akan
menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir sama dengan Non BTA yang
menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit dalam memberikan
alkohol (underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna sehingga
sel Non BTA bisa saja berwrna ungu mendekati warna sel BTA.
Kaca obyek harus selalu dicuci dengan aquades diantara penambahan pewarna untuk
menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna berikutnya.

4.1.3. Faktor yang membedakan BTA dan Non BTA

Perbedaan mendasar antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada komponen dinding
selnya. Dinding sel BTA mengandung lapisan lilin (lapisan lemak) yang sangat banyak sehingga
dalam proses penyrapan warna perlu dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel
tersebut sehingga pewarna dapat diserap. Namun dalam dinding sel bakteri non BTA lapisan
lemaknya tidak banyak sehingga untuk melakuka penyerapan warna tidak perlu dilakukan
pemanasan dan pelunturan warna pun sangat mudah dilakukan saat penambahan asam alkohol.
 PEWARNAAN BAKTERI
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberap macam. Pada bentuk basil,
pembagiannya meliputi basil tunggal, diplobasil, dan triptobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus ( satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (berbentuk
mirip buah anggur). Khusus pada spirilum hanya terbagi menjadi 2 yaitu setengah melengkung
dan tidak melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah atau ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan
pewarnaan ungu, sedangkan yang positif berwarna merah. (Anonymous, 2008). Hal ini bertujuan
untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain
itu, ada endospore yang yang bias diwarnai. Endospore adalah organism yang dibentuk dalam
kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut
dilingkungan sampai kondisi mnjadi baik (Nobi, 2008) teknik pewarnaan gram haruslah sesuai
prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahn identifikasi data apakah gram positif atau gram
negative, sehingga diperlukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaanya.
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan
bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi
atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram
tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
Mycoplasma sp (Tryana, 2008)
Struktur dasr bakteri terbagi menjadi dua, yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi: dinding sel, membrane plasma,
sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi kapsul, flagellum, pilus,
fimbria, klorosom, vakuola, gas, dan endospora.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengamati hal tersebut maka
dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling
utama dalam penelitian-penelitisn mikrobiologi. (Rizki, 2008)
Macam-macam pewwarnaa
1. Pewarnaan negative
Bakteri tidak diwarnai tapi mewarnai latar belakang
Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarna seperti spirochaeta
2. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru methilen atau air fukhsin)
Bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel.
3. Pewarnaan differensial
Menggunakan lebih dari satu macam zat wrna
Tujuan untuk membedakan antar baktericontoh pewrnaan gram, perwarnaan bakteri tahan asam.
4. Pewarnaan khusus
5. Untuk mewarnai struktur khusus / tertentu dari bakteri menjadi kapsul dan spora. Serta flagell.
Cara Pewarnaan Negative
Sediaan dihapus kemudian teteskan emrsi, kemudian lihat dimikroskop
 Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu
mengidentifikasi, kuman perlu diwarnai. Pewarnaan gram adalh suatu metode empiris untuk
membebaskan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besra, yakni gram positif, dan gram negative.
Berdasrkan sifat kimia dan fisikanya dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark, Hant Cristian Gram (153-1938) yang mengembangkan teknik
ini pada tahun 1984 untuk membedakan antara pneomokokus dan bakteriislebsiella pneumonia
(fizahazny, 2008)
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metal
ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal
ungu gelap. Setelah dicuci dengan alkool, sementara bakteri gram negatifnya tidak. Pada uji
pewarnaan gram, suatu pewarna menimbal di tambahkan setelah metal ungu yang membuat
semua bakteri gram negative, menjadi berwrna merah, atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tip bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka (Fizahazny, 2008)
Pewarnaan sederhana
Adalah pewarnaan yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya
digunakan satu jenis pewarnaan untuk mewarnai organism. Kebanyakan bakteri telah bereaksi
dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana, karena sitoplasma bersifat basofil (suka akan basa).
Zat-zat warna yang akan digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromatofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan
dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll),
dan bahan-baha lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (hadiutomo, 1990)
Pewarnaan negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tapi mewarnai
latarbelakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Cirri-ciri gram negative:
 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
 Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapt dalam lapisan
kaku,, sebelh dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
 Kurag rentan terhadap senyawa penisilin.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif:
 Struktur dindingnya tebal
 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
 Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
 Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme
untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk:
Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar
 Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organism yang serupa ( Suriawieia, 2002).

3.1.1 alat 3.1.2 Bahan

 Mikroskop aquades sterl
 Kaca benda biakan murni bakteri
 Mangkuk pewarna Alkohol 70%
 Kawat penyangga Larutan iodin
 Pipet Kristal violet
 Pinset Larutan Safranin
 Lampu spirtus Alkohol 95%
 Botol penyemprot
a. Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu lewtkan diatas nyala api lampu spirtus
b. Meneteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut
c. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakkan diatas tekanan
aquades itu. Kemudian ratakan perlahan-lahan.
d. Mengambil kaca benda lain yang bersih, lalu meletakkan diatas kaca benda sediaan sehingga
membentuk sudut 450
e. Menggeserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata. Biarkan
sampai kering.
f. melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut diatas nyala api lampu spirtus
dengan cepat.
g. Meletakkan sediaan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu
meneteskan Kristal violet diatas sediaan tersebut. Menunggu sampai 1 menit.
h. Mmembuang kelebihan zat warna tersebut kedalam mangkuk dan bilaslah sediaan dengan air
kran
i. Meneteskan larutan iodine diats sediaan itu, lalu menunggu selama 2 menitdengan air kran.
k. Membuang alcohol 95% diatas sediaan, lalu membiarkan selama 1 menit.
l. Membuang sisa alcohol kedalam mangkuk dan membilas sedian dengan air kran.
m. Meneteskan larutan safranin diatas sediaan , lalu membiarkannya selama 30 detik.
n. Membuang kelebihan larutan safranin kedalam mangkuk, lalu bilas dengan air kran.
o. Mengeringkan sediaan itu secara hati-hati dengan kertas penghisap lalu periksalah dibawah
mikroskop. Bila teknik pewarnaannya berhasil dengan baik, maka sel-selnya bakteri yang
bersifat gram positif akan berwarna ungu, sedangkan sel-sel bakteri yang bersifat gram negative
akan berwarna merah dan merah muda.

Pewarnaan bakteri untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar
belakang, sehingga dapat mempertajam bentuk sel-sel mikroba itu sendiri, dengan car mewarnai
sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya, yaitu warna Kristal violet pada pengecatan
digunakan bakteri Bacillus aereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri
tersebut berwarna ungu, yamg berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga
Nampak pada mikroskop. Zat wwarna yang umumnya digunakan adalah bersifat alkalin
(Anonymous. 2008)
Pengamatn gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan
bakteri garam positif atau bakteri gggram negate. Pada pengecatan ini digunakan 3 jenis bakteri,
yaitu: Bacillus aerus, salmonella typii, dan Eschercia colli. Pengecatan ini menggumakan 4 jenis
 larutan, yaitu: Kristal violet sebagai catwarna, larutan iodin sebagi pengintensifan cat utama,
alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai zat penetup. Berdasarkan percobaan dapat
Baccilus aerus, dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berartibakteri dapat mengikat
dengan kuat cat warna ungu dari Kristal violet. Pada saat gram positif ditambahkan dengan
kristel violet, maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel.
Dengan pemberian larutan iodin mak Kristal violet akan masuk sampai ke inti sel. Pemberian
alcohol menyebabkan pori-pori di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Pada
praktikum yang telah dilakukan dapat juga diidentifikasi bahwa bakteri berbentuk basil dan
memiliki bidang pandang mikroskopis. Bakteri ini ditemukan pada perbesaran 40x10
(Anonymous, 2010)

 Pewarnaan bakteri digunakan untuk memperlihatkan atau mempelajari kontras antar sel dan
latar belakangnya sehingga dapat mempertsjsm bentuk sel-sel mikroba.
 Pengecatan gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan gram
positif dan gram negative.
 Pada pengecatan, digunakan 4 larutan, yaitu: Kristal violet, iodine, alcohol. Dan safranin
 Bakteri yang bersifat gram positif dapat mengikat dengan kuat ungu dari krostal violet,
sedangkan bakteri yang bersifat gram negative tidak dapat mengikat warna ungu dari Kristal
violet biasa akan berwarna merah atau merah muda setelah diamati pad mikoskop.

DAFTAR PUSTAKA
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga
Suriawiria. 200 Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT. Garaemedia
Tryana, S.T. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan
Rizky.2008.http://ngecat bakteri makulrizki.blogspot.com/2008/02/materi kuliah html. Diakses
tanggal 24 Nopember 2010
Fizahazny. 2008.http// wordpress.com/ Pengantar Temtamg Bakterihtml. Diakses tanggal 25
Nopember 2010
Anonymous. 2008.http//.id Wikipedia. Org/wiki.pewarnaan, gram.
Anonymous: // makalh dan skripsi. Blogspot.com/2010/26 pewarnaan. Html pewarnann

Pewarnaan secara gram adalah pewarnaan yang sangat berguna dan paling banyak digunakan
dalam laboratorium mikrobiologi dan klasifikasi bakteri, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel.
Karena kemampuannya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari kelompok
lainnya, maka pewarnaan ini juga disebut pewarnaan diferensial.
Mikroorganisme terutama bakteri sulit dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya, karena
tidak mengasorbsi ataupun membiaskan cahaya.
Tehnik pewarnaan merupakan cara yang banyak dipergunakan untuk melihat struktur dan
morfologi bakteri. Terdapat beberapa tehnik pewarnaan diantaranya, pewarnaan sederhana
 merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam larutan warna contohnya
pewarnaan sederhana dan pewarnaan negative, kemudian pewarnaan diferensial, merupakan
pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu macam larutan warna, contohnya pewarnaan gram,
pewarnaan tahan asam, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan spora.
Sebelum melakukan prosedur pewarnaan terhadap bakteri, terdapat beberapa hal yang
perlu diperhatikan, seperti gelas objek dibersihkan dengan menggunakan alcohol 70% untuk
menghilangkan debu atau lemak, kemudian pewarnaan diferensial terlebih dahulu dibuat
preparat, dan fiksasi dapat dilakukan dengan melewatkan preparat ulas diatas nyala api, adapun
tujuan dilakukan fiksasi antara lain untuk melekatkan sel bakteri pada objek glass, mematikan sel
bakteri dan lain sebagainya.

1. Pewarnaan sederhana.
Pertama - tama membuat preparat ulas dengan cara :
1) Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan

menggunakan tisu atau kapas.

2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan dengan

api spritus agar kerja berjalan steril.

3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek.
4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar.
5) Fiksasi diatas api spritus.
Kemudian,
6) Beri atau tetesi larutan metylen blue, diamkan sebentar sekitar 20-30 detik.
7) Zat warna dituang, kemudian bilas dengan aqua dest mengalir.
8) Preparat dikeringkan di udara,
9) Amati dengan menggunakan mikroskop.
2. Pewarnaan gram.
Pertama – tama membuat preparat ulas dengan cara :
1) Bersihkan kaca objek dengan menyemprotkan alcohol 70 %, kemudian lap dengan

menggunakan tisu atau kapas.

2) Pindahkan suspense bakteri dengan menggunakan jarum ose keatas kaca objek, dekatkan dengan

api spritus agar kerja berjalan steril.

3) Campur dengan NaCl hingga merata. Oleskan campuran ini diatas kaca objek.
4) Biarkan preparat mengering di udara sebentar.
5) Fiksasi diatas api spritus.
Kemudian,
6) Beri atau tetesi larutan Kristal violet, diamkan sebentar lalu bilas dengan aqua dest mengalir.
7) Tetesi larutan lugol, diamkan sebentar lalu lunturkan dengan alcohol 96 % goyangkan sampai

tidak ada lagi zat warna mengalir di preparat.

8) Zat warna dibuang bilas dengan aqua dest mengalir.
9) Tetesi dengan larutan safranin diamkan sebentar.
10) Zat warna dibuang dengan membilas dengan menggunakan aqua dest mengalir.
11) Preparat dikeringkan dengan menggunakan kertas saring.
12) Amati dengan menggunakan mikroskop.

Pewarnaan yang dilakukan merupakan pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram.

Dimana pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang hanya menggunakan satu macam

pewarna saja, sedangkan pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang menggunakan pewarna

lebih dari satu macam.

Pada pewarnaan sederhana menggunakan satu macam pewarna metylen blue, sehingga

ketika diamati dengan menggunakan mikroskop maka pada bakteri E.coli akan terlihat bewarna

biru keungu-unguan, pada bakteri Streptococus kelihatan bewarna biru keungu-unguan, dan pada

bakteri ketiga yaitu bakteri Pseudemonas, ketika diamati ternyata bewarna ungu kebiru-biruan

pudar.

Sedangkan pada pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu macam pewarna seperti Kristal

violet, larutan lugol, dan larutan safranin. Pada pewarnaan gram apabilah bakteri berakhir

dengan warna merah maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negative, dan sebaliknya

apabilah tidak bewarna merah berarti merupakan bakteri gram positive.

Pada pewarnaan gram ini, ditemukan bahwa bakteri E. coli setelah diamati dengan

menggunakan mikroskop, terlihat bewarna merah, kemudian bakteri streptococcus tidak

bewarna, hanya ada sedikit warna merah yang merupakan pembiasan cahaya pada mikroskop,

begitu juga dengan bakteri Pseudomonas terlihat bewarna sedikit kemerah-merahan dan

kelihatan merah tambahan yang dihasilkan merupakan biasan cahaya dari mikroskop.

Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat disimpulkan bahwa :

a. Bakteri E.coli merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna merah pada

akhir pewarnaan gram.

b. Bakteri Streptococus merupakan bakteri gram positif karena tidak berakhir dengan warna merah

pada akhir pewarnaan gram dan berbentuk kokus yang merupakan cirri daripada bakteri gram

positif.
c. Bakteri Pseudomonas merupakan bakteri gram negative , karena berakhir dengan warna

kemerahan pada akhir pewarnaan gram, serta berbentuk basil yang merupakan cirri daripada

bakteri gram positif.

Cara Pewarnaan Bakteri

MACAM-MACAM TEKNIK PEWARNAAN BAKTERI

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air,
dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel
bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan.
Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan
dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor
yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat
warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat
juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri
tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian
warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian
sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya
mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk
dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.
(waluyo,2010)
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan
inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna
mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat
ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela,
dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan
suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek
karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).
2.1 Macam-macam pewarnaan
2.1.1 Pewarnaan
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia
dapat diketahui.
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun,
formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna
Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri
terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri
digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genus
Mycobacterium.
Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan
pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula
metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur
pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan
beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelezar,2008).
2.1.2 Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai
macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut.
Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara
umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik),
ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).
gambar pewarnaan sederhana
2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam
Pewarnaan differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan
pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram
positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan
Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti
Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua
genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang
umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti
pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
 Zat warna utama (violet kristal)
 Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
  Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
 Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram
positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi
suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan
bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
 Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat
didalam
 lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak
mengandung asam tekoat.
 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
 Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
 Peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang
sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.
Mengandung asam tekoat.
 Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
 Tidak peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Contoh bakteri gram posittif contoh bakteri gram negatif

Sumber: “http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram
Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi
sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya
karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat
tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu
bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).
Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab
tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam,
namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)
Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)
Sumber: www.google.com
3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan
spora, pewarnaan kapsul.
Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik
pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan
pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada
pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa
menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .
Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton

Sumber http://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite.jpg
Protokol pewarnaan diferensial endospores dan sel vegetatif adalah sebagai berikut:

Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori
membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil
menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol,
sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari
methylen blue.
Cara Kerja :
• Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.
• Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit.
• Dibuat sediaan dan dikeringkan.
• Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik
• Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.
• Sediaan dicuci dengan air.
• Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.
• Diperiksa dibawah mikroskop.
Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga
terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat
melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru
gelap.
4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :
 pewarnaan Neisser (granula volutin),

 pewarnaan yodium (granula glikogen).

5. Pewarnaan negatif
Tujuan
Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme
yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar
belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
Cara pewarnaan negatif
- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya
menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus
pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka
terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh
dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam
memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena
negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat
dengan latar belakang berwarna.

METODE PEWARNAAN BAKTERI

METODE PEWARNAAN BAKTERI

Jenis-jenis pewarnaan kuman yang dikenal adalah:
1. Pewarnaan negatif
2. Pewarnaan sederhana
3. Pewarnaan difrensial
4. Pewarnaan khusus

1.PEWARNAAN NEGATIF
Pewarnaan ini dipakai untuk yang sukar di warnai, misalkan Spirochaeta (Treponema, Leptospira dan
Borrelia)

2. PEWARNAAN SEDERHANA
Pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna. Misalkan Biru metilen, Air Fukhsin atau Ungu
Kristal selama 1-2 menit. Zat warna Anilin mudah di serap oleh kuman.

3. PEWARNAAN DIFFRENSIAL
Pewarnaan Diffrensial menggunakan lebih dari satu macam Zat warna:
A. Pewarnaan Gram: Pewarnaan Diffrensial yang sangat penting. Ditemukan oleh Christian Gram pada
tahun 1884.
B. Pewarnaan Tahan Asam (acid fast staining). Misalkan pewarnaan Ziehl-Neelsen dan Kinyoun-Gabbet
untuk membedakan kuman-kuman yang tahan Asam dari yang tidak Tahan Asam.

A.PEWARNAAN GRAM
Pewarnaan Differensial dimaksudkan untuk membedakan 2 jenis bakteri berdasarkan daya rekat dinding
bakteri terhadap zat warna. Salah satu jenis pewarnaan differensial adalah Pewarnaan Gram, yang
menggunakan 2 macam zat warna yaitu Zat warna Primer (Kristal Violet) dan Zat warna Sekunder
(Fucshin atau Safranin).
Bakteri dapat membentuk bulat/kokus/coccus dengan susunan berkelompok atau berantai, sebagian
besar bakteri ini bersifat Gram Positif. Bakteri berbentuk berbentuk batang/basil/bacil dapat bersusun
satu-satu, berantai ataupun bertumpuk seperti kayu bakar, sebagian besar bersifat Gram negatif.
• Cara Pewarnaan:
1.Sediaan yang sudah direkat diwarnai dengan karbol Kristal Ungu selama 5 menit.
2. Zat warna dibuang dan diganti dengan larutan Lugol dibiarkan selama 45-60 detik.
3. Larutan Lugol dibuang dan sediaan dicuci dengan Alkohol 96% selama 30 detik atau digoyang-
goyangkan sampai tidak ada zat warna yang mengalir lagi.
4. Sediaan dicuci dengan air dan diwarnai dengan air Fukhsin selama 1-2 menit. Sediaan dicuci,
dikeringkan dan diperiksa dibawah mikroskop.

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:

-Kuman Positif Gram berwarna Ungu
- Kuman Negatiif Gram berwarna Merah
Sifat kuman terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu
kuman.

B.PEWARNAAN BAKTERI TAHAN ASAM

Pewarnaan ini adalah segolongan bakteri yang sulit diwarnai, tetapi sekali diwarnai sulit dihapus.
Dinding sel bakteri tahan asam terdiri dari peptidogikan, arabinogalaktan, dan lipid, dimana 50% dari
lipid ini terdiri dari asam nikolat. Bakteri ini dimasukkan kedalam golongan mikrobacterium yang
sebagian besar bersifat satprofit, dikenal juga golongan atipik , sebagian kecil pathogen bagi manusia
yaitu Mycrobaterrium tuberculosis dan Mycrobacterium leprae. Dari pewarnaan BTA dapat dibedakan 2,
yaitu golongan bakteri tahan asam yang akan tetap mengikat zat pewarnaan primer (karbofuksin) dan
tidak akan dilepas pada pencucian alkoholm asam, serta tidak akan mengikat zat warna sekunder
( metilen blue), sedangkan bakteri tidak tahan asam akan melepaskan zat warna primer pada pencucian
alcohol asam dan akan mengikat zat warna sekunder.
Ada beberapa cara mewarnai bakteri tahan asam yaitu, menurut Ziehl-Neelseen, menurut Tan Thiam
Hok (1957) yang disebut juga pewarnaan Kinyoun Gabelt, serta pewarnaan dengan AURAMEN-PHENOL
FLUORCHROME.
• Cara Pewarnaan:
1. Metode ZIEHL-NEESEN
a. Buat sediaan dari sputum dengan cara, bersihkan kaca benda hingga bebas dari lemak, bakar ose
hingga pijar dan tunggu dingin sejenak, ambil sputum dengan ose kemudian oleskan diatas kaca benda
hingga didapat usapan yang rata dan tipis, tunggu dan keringkan dan difiksasi diatas api. Ose setelah
digunakan dibakar lagi hingga pajar.
b. Tuangi sediaan dengan karbol fuksin hingga tergenang, kemudian panaskan diatas api kecil sampai
keluar asap lalu tunggu selama 5 menit
c. Cuci dengan air mengalir
d. Celupkan kedalam H2SO4 selama 2 detik untuk kuman M. leprae
e. Celukan kedalam alcohol 60% sehingga tidak ada lagi zat warna merah yang larut
f. Tuangi preparat dengan methylen blue selama 1-2 menit
g. Cuci dengan air mengalir keringkan tetesi minyal imaersi dan amati dengan mikroskop pembesaran
10 X 100

2. Metode KINYOUN – GABBET

a. Buat sediaan sputum dan rekatkan
b. Sediaan dituangi larutan Kinyoun dan dibiarkan selama 3 menit
c. Dicuci dengan air mengalir
d. Preparat dituangi larutan Gabbet dan dibiarkan selama 1 menit
e. Cuci dengan air mengalir lalu amati dengan mikroskop dengan pembesaran 10 X 100

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:

1. Bakteri bersifat tahan asam akan berwarna Merah
2. Bakteri bersifat tidak tahan asam berwarna Biru

4.PEWARNAAN KHUSUS
A. PEWARNAAN KAPSUL BAKTERI
Kegunaan kapsul bakteri :
1. Mencegah kekeringan pada kondisi yang tidak menguntungkan
2. Meningkatkan kemampuan bakteri untuk menimbulkan penyakit, merupakan lapisan pelindung
yang menghalangi proses fagositosis oleh sel daraah putih.
Beberapa metode pewarnaan kapsul :
1. Pewarnaan Muir; kapsul bewarna biru dan badan bakteri berwarna merah.
2. Pewarnaan Hiss; kapsul berwarna biru muda dan badan bakteri ungu tua.
3. Pewarnaan Gins-Burri kombinasi pewarnaan negative dan sederhana, akan didapat hasil kapsul tidak
berwarna dan badan bakteri berwarna merah, karena kapsul mudah ditembus zat warna tetapi sukar
mengikat zat warna.

• Cara Pewarnaan:
1.Buatlah sediaan Bakteri pada salah satu ujung kaca benda
2. Teteskan satu tetes Tinta Cina disebelah suspense kuman
3. Campurkan kedua suspensi tadi dengan menggunakan ujung kaca benda lain, kemudian dengan kaca
benda tersebut ratakan suspensi kuman sepanjang kaca benda.
4. Keringkan sediaan dan direkatkan
5. Genangi dengan larutan karbol Fukhsin selama 2 menit
6. Cuci dengan air mengalir perlahan-perlahan dan keringkan diudara.
7. Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100, pada bagian yang tipis
Keterangan:
- Langkah 1-4 : Metoda Pewarnaan negative (Burri)
- Langkah 5-7 : Metoda Pewarnaan Gins

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:

- Kapsul bakteri : Tidak Berwarna
- Badan bakteri Asam : akan berwarna Merah
- Latar belakang : Hitam

B. PEWARNAAN SPORA BAKTERI

Beberapa genus bakteri dapat membuat endospora, yang diantaranya adalah dari genus bacillus dan
clostridium. Bakteri ini mengalami siklus diverensiasi untuk merespon keaddaan lingkungan buruk
seperti : kekeringan, kekurangan makanan, dll. Tiap sel membentuk satu endospora yang akan dilepaskan
bila sel induk mengalami otolisis. Spora adalah bagian dalam bentuk istirahat. Spora bersifat resisten
terhadap panas, kekeringan , dan zat kimiawi. Bila kondisi lingkungan telah baik kembali spora dapat
kembali melakukan gemisasi dan memproduksi sel vegetative.
• Cara Pewarnaan:
1. Buat suspensi bakteri didalam 1 ml NaCl 0,9% hingga keruh seperti susu
2. Masukkan karbol Fuchsin ke dalam suspensi bakteri tadi sama banyak (1:1)
3. Homogenkan, panaskan dengan api kecil (70%) selama 6 menit jaga jangan sampai mendidih
4. Siapkan kaca benda yang telah bersih
5. Buat preparat dari suspense tadi rekatkan dan dinginkan
6. Celupkan kedalam bejana yang berisi larutan H2SO4 1% selama 2-3 detik
7. Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan
8. Genangi dengan Metilen Blue selama 2-4 menit
9. Cuci dengan air mengalir perlahan-lahan, dan keringkan
10. Amati dengan Mikroskop pembesaran 10 x 100

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:

- Spora bakteri : Merah
- Badan bakteri asam : akan berwarna Biru

C.PEWARNAAN FLAGEL
o Flagel merupakan komponen tambahan dari sel yang menyerupai benang, terdiri dari protein
Flagelin
o Dikenal 4 jenis flagel :
 Monotrikh, flagel tunggal pada salah satu ujung, missal : Vibrio sp.
 Lofotrikh, terdapat 1/lebih flagel disalah satu ujung , Alcalingenes sp
 Amfitrikh, terdapat 1/lebih flagel di kedua ujung, cth: Alcalingenes sp
 Peritrikh, flagel terbesar diseluruh badan kuman, cth: Pruteus vulganis
Flagel merupakan organel sel yang tidak dapat dilihat dengan pewarnaan biasa. Ntuk itu pewarnaan
khusus atau dengan mikroskop electron. Salah satu pewarnaan yang digunakan untuk melihat flagel
adalah pewarnaan Gray serta beberapa pewarnaan lain diantaranya pewarnaan Novel, Zatnow, dan
Fontana-Tribondeau dengan menggunakan impregnasi Ag.

Pewarnaan Gray
Digunakan untuk pemantek / mordant untuk mneingkatkan afinitas flagel terhadap zat warna dan
memperbesar diameter flagel. Zat warna yang digunakan adalah Karbol Fuksin menjadi flagel dan badan
kuman berwarna merah.
Gerak Bakteri
Gerak bakteri dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara langsung dan secara biakan. Biakan yang
digunakan tidak mengandung gula karena adanya gula dapat meurunkan pH media sehingga gerak
bakteri akan terhambat. Biakan yang digunakan harus mempunyai konsisten setengah padat agar bakteri
dapat bergerak bebas. Biakan bakteri yang akan diperiksa harus lebih dari 20 jam dan perlu
diperhatikan bahwa suhu optimum untuk gerak bakteri dibawah 300 C.

• Cara Pewarnaan:
1. Metode Tetes Tegak
a. Kaca benda dibersihkan agar terbebas dari lemak
b. Disiapkan gelas penutup dengan memberikan vaksin pada keempat sisinya
c. Letakkan suspense bakteri pada bagian tengah kaca benda jangan ditipiskan
d. Tutup suspense tersebut dengan kaca penutup
e. Amati dengan mikroskop pembesaran 10 X 100

2. Metode Tetes Gantung

a. Kaca benda cekung dibersihkan agar terbebas dari lemak
b. Disiapkan kaca penutup dengan memberikan vaselin pada keempat sisinya
c. Letakan suspensi kuman dibagian tengah kaca penutup, JANGAN DITIPISKAN
d. Peganglah kaca benda cekung dengan bagian cekung menghadap kebawah, kemudian dekatkan kaca
benda ini perlahan-lahan pada kaca penutup sedemikian rupa sehingga bagian cekung melingkupi
suspensi bakteri. Tekan perlahan-lahan agar vaselin menyebar
e. Dengan hati-hati namun cepat baliklah kaca benda tersebut, kemudian amati dengan mikroskop
pembesaran 10x kemudian 40x

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:

- Gerak Positif: Bila bakteri berpindah tempat dengan cepat
- Gerak Negatif: Bila bakteri bergerak ditempat saja akibat gerakan molekul air (Gerak Brown)

3. Biakan Semi Solid

a. Disiapkan media semi solid SIM atau MIO
b. Ambil biakan bakteri dengan menggunakan ose jarum yang sebelumnya telah dipijarkan
c. Tusuk ose tersebut pada bagian tengah media hinnga dasar
d. Eramkan media tersebut dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 C

Hasil dapat dibaca sebagai berikut:

- Gerak Positif: Bila bakteri tumbuh menyebar akan terlihat kekeruhan atau turbiditas
- Gerak Negatif: Bila bakteri hanya tumbuh pada bekas tusukan.
(Sumber :
Tim Dosen Mikrobiologi Lingkungan Politeknik Kementerian Kesehatan Jakarta II jurusan Kesehatan
Lingkungan, Dra. Syarifah Miftahul El Jannah T . M. Biomed; Modul Praktikum Mikrobiologi Lingkungan,
Jakarta.)

Bakteri merupakan organisme yang sangat kecil (berukuran mikroskopis). Itu berarti bahwa
jasad renik ini tipis sekali sehingga tembus cahaya. Akibatnya, bakteri ini akan sangat sulit untuk
dilihat dengan teliti di bawah mikroskop. Oleh karena itu, agar dapat dilihat dengan jelas maka
bakteri tersebut haruslah diwarnai/dilakukan pengecatan terlebih dahulu.

SEJARAH PEWARNAAN BAKTERI

Pewarnaan bakteri sudah dilakukan sejak permulaan berkembangnya mikrobiologi di
pertengahan abad ke- 19 oleh Loius Pasteur dan Robert Koch. Pewarnaan bakteri dapat
dilakukan dengan satu macam zat warna ataupun lebih. Pewarnaan bakteri dengan menggunakan
satu macam zat warna disebut pewarnaan sederhana. Pewarnaan dengan menggunakan lebih dari
satu macam zat warna diberi nama sesuai dengan nama penemunya. Pada umumnya, ada dua
macam zat warna (bahan cat) yang sering dipakai, yaitu sebagai berikut:
 Zat warna yang bersifat asam; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam bentuk
garam natrium

 Zat warna yang bersifat alkalis, dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk
klorida.

Pada pewarnaan sederhana yang sering dipakai adalah methylen blue. Hasil pewarnaannya akan
lebih baik bila diberi sedikit KOH (Kalium Hidroksida). Larutan ini disebut Loffer methylen
blue.

Cara-Cara Pewarnaan
A. Pewarnaan Sederhana
Tujuan pengecatan ini ialah untuk membedakan bakteri dari benda-benda mati lain yang bukan
bakteri dan untuk melihat bentuk dan ukurannya. Larutan cat hanya terdiri dari satu bahan cat
yang dilarutkan dalam suatu bahan pelarut. Bahan-bahan yang banyak dipakai untuk keperluan
ini adalah karbol fuksin, kristal violet, dan methylen blue.

B. Pewarnaan Diferensial
Untuk pewarnaan ini digunakan lebih dari satu macam bahan cat. Dengan cara ini bahan-bahan
cat yang dipakai ada kalanya terpisah, atau ada kalanya dicampur dan digunakan dalam satu
larutan. Dua macam pewarnaan/pengecatan yang terpenting dari golongan ini ialah pengecatan
Gram dan pengecatan tahan asam seperti pengecatan Ziehl-Naelsen.
Sediaan (preparat) untuk proses pengecatan dibuat sebagai berikut.
1. Kaca objek dibersihkan sehingga bebas lemak
2. Pada bagian ujung kaca objek diberi tanda, sebaiknya di sebelah permukaan yang tidak
dicat
3. Dengan ose dibuat film yang tipis pada permukaan yang telah dibersihkan
4. Film dikeringkan di udara atau dengan hawa hangat dari api gas
5. Fiksasi dilakukan dengan cara menyentuhkan permukaan kaca objek tiga kali berturut-
turut pada ujung api
6. Setelah didinginkan preparat sudah siap untuk dicat

Yang dimaksud dengan fiksasi ialah melekatkan bakteri pada kaca objek, mematikan bakteri
dengan cepat agar sifat-sifatnya tidak banyak berubah. Fiksasi ini harus dilakukan setelah
preparat kering.

a. Pewarnaan Gram (Christian Gram)

Pewarnaan ini pertama kali dikemukakan oleh Christian gram (1884). Dengan pengecatan ini
film bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentin violet (karbol kristal
violet, karbol metilviolet) dan didiamakan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan
iodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pengecatan ini selesai,
semua bakteri akan berwarna ungu. Untuk lebih jelasnya berikut adalah tahap-tahap pewarnaan;
1. Sediaan diwarnai dengan karbol gentian violet selama 3 menit
2. Kelebihan zat warna dibuang tanpa dicuci direndam dalam lugol (J dalam KJ) selama 45
menit detik
3. Sediaan dicuci dengan alkohol 95% sampai tidak ada lagi zat warna yang luntur
4. Cuci dengan air mengalir untuk menghilangkan alkohol diwarnai dengan fuchsin selama
3 menit
5. Cuci dengan air mengalir
6. Keringkan di antara 2 kertas saring dan dilihat dengan mikroskop
Dengan pewarnaan Gram, ada beberapa bakteri yang dapat menahan zat warna ungu (karbol
kristal violet, karbol metilviolet) dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol
dan aseton. Bakteri yang memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Positif.
Sebaliknya, bakteri yang tidak dapat menahan zat warna setelah didekolorisasi dengan alkhol
dan seton akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecetan dengan zat
warna kontras akan berwarna sesuai dengan zat warna kontras. Bakteri yang memperlihatkan
reaksi semacam ini dinamakan bakteri Gram Negatif.

b. Pewarnaan Ziehl Neelsen

Pewarnaan ini juga disebut dengan pengecetan tahan asam. Disebut demikian karena pada
beberapa jenis bakteri sukar dilakukan pengecetan. tetapi sekali dapat tercat tidak mudah untuk
dilunturkan meskipun dengan menggunakan zat peluntur (decolorizing agent) asam (atau asam-
alkohol). Yang termasuk bakteri yang sukar dicat adalah dari genus Mycrobacterium
(Mycrobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium smegmatis). Bakteri
tahan asam sangat banyak mengandung lipida, asam lemak, dan kandungan inilah yang
mencerminkan sifat tahan asam pada golongan bakteri tersebut antara lain asam mikolat. Cara
pengecetannya ialah :
1. Film bakteri pada kaca objek yang telah difiksasi, disiram dengan karbolfuksin,
kemudian dipanaskan sampai keluar uap (tidak sampai mendidih). Pemanasan diulang
beberapa kali agar bahan cat tetap hangat kemudian didiamkan selama lima menit.
2. Dekolorisasi dilakukan dengan asam-alkohol dalam waktu yang singkat, kemudian cepat
dicuci dengan air.
3. Pengecetan dengan cat kontras dilakukan dengan metil biru dalam larutan KOH 1/10000
4. Setelah dicuci kembali dengan air preparat dikeringkan di udara.

Dengan pewarnaan ini, bakteri dibagi dalam 2 golongan, yaitu:

1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl neelsen disebut bakteri tahan
asam (acid fast)
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl Neelsen disebut bakteri tidak tahan
asam (non-acid fast)

c. Pewarnaan Neisser dan Albert

Di antara bakteri bentuk batang Gram positif, ada yang di dalam selnya ditemukan granula
polifosfat yang disebut juga granula metakromatik atau volutin bodies. granula ini bersifat
kromofil dan metakromatik yang berarti mempunyai aktivitas kuat terhadap zat-zat warna, dan
seringkali tampak lain dari zat warna yang diberikan. Berikut adalah langkah-langkah
pengecetannya:
1. Sebagai bahan cat disediakan tiga macam larutan, yaitu:
 Neisser A isinya methylen blue
 Neisser B isinya gentian violet

 Neisser C isinya chrysoidin (berwarna kuning)

 2. Untuk pengecetan pertama digunakan larutan A dan B yang dicampur sesaat sebelum
pengecatan dalam perbandingan dua bagian larutan A dengan satu bagian larutan B. Lama
pengecatan adalah setengah menit
3. Setelah campuran tersebut dibuang preparat dibilas dengan larutan dan larutan ini didiamkan
di atas film preparat selama ½ - 1 menit, kemudian dikeringkan dengan kertas saring.
Selain itu, untuk menonjolkan granula metakromatik ini dapat pula dilakukan pengecetan Albert,
yaitu:
1. Preparat dicat dengan larutan cat menurut Albert selama 3-5 menit
2. Setelah dicuci dengan air, preparat disiram dengan larutan iodium (menurut Gram) dan
ditunggu satu menit. kemudian dicuci kembali dengan air dan dikeringkan dengan kertas
saring.

Hasil Pengecetan:
1. Pada pengecetan Neisser: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma berwarna kuning
(krisoidin) atau tengguli/kecoklat-coklatan (Bismarck brown)
2. Pada pengecetan Albert: Granula berwarna biru-hitam, sitoplasma hijau
***Semua bakteri Gram negatif tidak tahan asam, sedangkan bakteri Gram positif ada yang
tahan asam dan ada yang tidak tahan asam***

Pewarnaan Bakteri

II. Tinjauan Pustaka

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut
sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya
bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel
bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal
violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat
bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies
bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan
antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram
negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah
metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.

a. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid)
kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah.
Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan
dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding
sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama.
Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan

penisilin
 Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)

Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatifRelatif sederhana

kompleks

Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan

perlakuan fisik

(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan
pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler.
Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi
tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini
disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna
tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam
alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan
jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram.
Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak
merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang
mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan
asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh
sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau
kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna
dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric
acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama
1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh
permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau
tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan
Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang
memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel
vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia
seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora
adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora
 tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan
transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan
dengan badan inklusi (Aditya, 2010)

a. Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan
menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul.
Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.

b. Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan
preparat.

c. Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga
terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

IV. Cara Kerja

Ø Disiapkan dua gelas benda dan penutupnya,

Ø Bakteri sempel A dan B diteteskan satu tetes pada masing-masing gelas benda,

Ø Sampel dipanaskan diatas api Bunsen hingga terfiksasi, jangan sampai pecah

Ø 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah
itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang,

Ø 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu,
gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang,

Ø 1 tetes etanol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah
itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang,

Ø 1 tetes safranin diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu,
gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang,
 Ø Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk
warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah
muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

V. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Tabel Hasil Pengamatan,

Pengamatan Warna
No Nama Hasil
Ungu Merah Muda

1 Bakteri Sampel A - ü Bakteri gram negatif

2 Bakteri sampel B ü - Bakteri gram positif

Praktikum ini memiliki tujuan agar praktikan terampil dalam melakukan pewarnaan gram untuk
bakteri gram positif dan negatif, mempelajari teknik pewarnaan gram untuk pengamatan mikroba,
mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dari hasil pengamatan dengan pewarnaan gram,
sera membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dan sekaligus menunjukkan
sifat bakteri tersebut.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri
dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan
listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna (Manurung, 2010).

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal
identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan
banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram
dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang
tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada
di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:

a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.

b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin,
fenol.

c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan
dalam 4 tahap yaitu:

a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.

Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang.
Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer
(utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga
mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel
mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri
gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan
gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram
positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan
dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30 detik bertujuan agar cat atau
pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel yang berupa
bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda yang berbeda. Kedua gelas benda
berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan
air sehingga hanya akan didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar
melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak akan terhapus apabila
dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung
bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.

Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan
selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Iodine
merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap
mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang
diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin
lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan
selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95%
merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat
warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan
bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol
pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri)
akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%

gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi,
pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)

gram - : lipid >> + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel
terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine tercuci)

Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik kemudia dibilas
dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa di
dalam gelas benda.

Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya, selanjutnya diteteskan 1
tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda
dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna
sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah
perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non
target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram
positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes
dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna
ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu
yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen
dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke
yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap gelas benda
dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna
yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan
air bilasan dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen
atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan
diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif ,
dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

Gambar skematik langkah kerja yang dilakukan oleh praktikan

Tabel prosedur pewarnaan gram
(Pradhika, 2008)

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam
terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk
membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda.
Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi
dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut
zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna
basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya
adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa
lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-
bagian inti sel (Rudi, 2010).

Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan
warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Dalam praktikum ini digunakan salah satu
pewarnanya yaitu safranin yang sesuai teori bersifat basa sehingga lebih mudah bersenyawa atau
bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri.

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada
metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
 pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram
negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010).

Hasil pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan bahwa bakteri sampel A memiliki warna
merah muda (gram negative), dan Bakteri sampel B memilki warna ungu (gram positif).

1. Escherichia coli

Gambar E. coli dengan perbesaran 1000 x

Klasifikasi ilmiah

Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : E. coli

Berdasarkan hasil pengamatan, terdapat bakteri Eschericia coli

pada air WC. Berbentuk E. coli adalah basil (batang) yang pendek.
Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah muda yang
berarti bahwa bakteri ini bersifat gram negatif.

Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae

yang termasuk bakteri gram negatif dan berbentuk batang yang
fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia,
yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari
bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan
 patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare, sindrom diare
lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus), infeksi usus, infeksi
saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang mengguntungkan
adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level
pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak
digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan
sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan
untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki pertumbuhan yang sangat
cepat dan mudah dalam penanganannya (Fajriana, 2008).

Infeksi E.coli O157:H7 yang patogen pada manusia yaitu yang bersifat
verotoksigenik yang telah menyebabkan 16.000 kasus penyakit melalui
makanan (Food Born Diseases) dan 900 orang meninggal per tahun di AS,
dengan perkiraan annual cost $ 200,000 hingga $ 600,000. Kejadian
wabah tunggal pada tahun 1993 di Western AS telah menyebabkan 700
orang menderita sakit dan 4 orang meninggal (Sartika, 2005).

VI. Kesimpulan

1. Pewarnaan yang digunakan dalam praktikum ini adalah pewarnaan Gram.

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri
gram positif dan gram negatif. Langkah-langkah utama dalam teknik
pewarnaan bakteri antara lain:

a. Pembuatan olesan bakteri

b. Fiksasi

c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna.

2. Teknik pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap

yaitu:

a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.

3. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel A dapat dikelompokkan
dalam bakteri gram negatif karena menunjukkan warna merah muda ketika
diamati di bawah mikroskop.

4. Dari hasil pengamatan warna bakteri, pada sampel B dapat dikelompokkan

dalam bakteri gram positif karena menunjukkan warna ungu ketika
diamati di bawah mikroskop.

VII. Daftar Pustaka

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri.

http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-
bakteri.html. 11 November 2010.

Dwijoseputro, d. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan.

Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http

//pewarnaan bakteri\Mikroum…Pewarnaan Gram « RIZQI FAJRIANA
BLOG’S.htm/. 11 November 2010.

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).
http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-
positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :

Gramedia.

Hardiningsih, Riani, Rostiati Nonta Refina Napitupulu, dan Titin

Yulinery. 2006. Isolasi dan Uji Resistensi Beberapa Isolat
Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas Vol 7 No. 1.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B.

Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005.
Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai
Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum.
Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri.

http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-
bakteri.html. 11 November 2010.

Pradhika, E. Indra. 2008. Morfologi Mikroba. http://ekmon-

saurus.blogspot.com/2008/11/bab-5-morfologi-mikroba.html. 11 November
2010.

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi.

Laboratorium Mikrobiologi UNS.
Reyza, Muhammad. 2008. Metode Pewarnaan
Gram.http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroba/pewarnaan/ 11
November 2010.

Rudi. 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya.

http://rudyregobiz.wordpress.com/bakteri-gram-dan-pewarnaannya-2/. 11
November 2010.

Sartika, Ratu Ayu, Yvonne M. Indrawani, dan Trini Sudiarti. 2005.

Analisis Mikrobiologi Escherichia coli O157:H7 pada Hasil Olahan Hewan
Sapi dalam Proses Produksinya. Makara Kesehatan Vol 9 No. 1.

Seri, Nesty Dwiyani. 2010. Bakteri Tahan Asam.

http://my.opera.com/chanlightz/blog/2010/07/13/bakteri-tahan-asam. 11
November 2010.

PEWARNAAN SPORA BAKTERI

PENGANTAR

Beberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di dalam tubuh vegetatif
bakteri tersebut, dapat berada di bagian tengah (central), ujung (terminal) ataupun tepian sel. Pelczar
(1986), menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi,
dihasilkan pada faselanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif.
Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi.
Santoso (2010) menyebutkan bahwa ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora, yaitu
genus Bacillus dan genus Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh vegetative bakteri
disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang terbentuk di dalam tubuh.
Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan
dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan.
Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan pada kondisi
yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat hidup dan
mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui
sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.
Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu yang
dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk & Wheeler
tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel
vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative ini berwarna merah.
Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi spora di dalam tubuh sel
vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di
dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora dipanaskan bersamaan
dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding
pelindung spora bakteri.
Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora bakteri, tidak lepas dari sifat
kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora bakteri mengandung asam dupikolinat.Yang mana
subtansi ini tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa ini khas dimiliki
oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah yang kemudian dimanfaatkan untuk di warnai
menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini larutan hijau malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986),
selain subtansi di atas, dalam spora bakteri juga terdapat kompleks Ca2+dan asam dipikolinan
peptidoglikan.
Proses pembentukan spora disebut sprorulasi, pada umumnya proses ini mudah terjadi saat kondisi
medium biakan bakteri telah memburuk, hal ini sesuai dengan kenyataan bahwa, sampel yang diambil
dalam praktikum ini berasal dari biakan bakteri yang dibuat beberapa minggu yang lalu, sehingga di
asumsikan, nutrisi di dalam medium telah hampir habis, sehingga diharapkan bakteri melakukan proses
sporulasi ini. Haapan ini terbukti benanr dengan kenyataan bahwa dari kedua sampel yaitu koloni 1 dan
koloni 2, keduanya sama-sama menghasilkan spora.
Namun menurut Dwijoseputro (1979) beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun tidak
dalam keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan karena bakteri
tersebut secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya memang memiliki satu
fase sporulasi. Masih menurut Dwijoseputro (1979) jka medium selalu diadakan pembaruan dan kondisi
lingkungan disekitar bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis bakteri dapat kehilangan
kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan karena struktur bakteri yang sangat
sederhana dan sifatnya yang sangat mudah bermutasi, sehingga perlakuan pada lingkungan yang terus
menerus dapat mengakibatkan bakteri mengalami mutasi dan kehilangan kemampuannya dalam
membentuk spora.
Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam beberapa tahapan, secara
singkat bagan proses pembentukan spora bakteri di atas dapat dijelaskan sebagai berikut:
1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora
2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar membran kini menjadi lapisan dalam
membran (calon) spora.
3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks)
4. Pembentukan korteks
5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika spora mendapatkan lingkungan
yang kondusif, maka ia bisa tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru. (sumber: FMIPA UPI)
Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-tahun bahkan berabad-abad jika
berada dalam kondisi lingkungan yang normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC,
namun spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1 jam
lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap menjadi spora, sampai kondisi
lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan
berkembangbiak secara normal (Volk & Wheeler, 1988).

PENDAHULUAN
Spora bakteri adalah bentuk bekteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh
buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai fungsi yang sama seperti kista amoeba, sebab bakteri dalam
bentuk spora dan amoeba dalam bentuk kista merupakan suatu fase dimana kedua mikroorganisme itu
berubah bentuk untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan.(Dwidjoseputro,
2001)
Sepanjang pengetahuan yang kita miliki sekarang, hanya golongan basillah yang dapat membentuk
spora, akan tetapi tidak semua basil mampu berbuat demikian. Beberapa spesies Bacillus yang aerob dan
beberapa spesies Clostridium yang anaerob dapat membentuk spora. Spora ini lazim disebut endospora,
dikarenakan spora itu dibentuk di dalam sel. (Dwidjoseputro, 2001)
Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat
resisten, dihasilkan oleh semua spesies Bacillus, Clostridium dan Sporosarcina. Bakteri yang mampu
membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak generasi sebagai sel vegetatif.
Namun pada beberapa tahapan di dalam pertumbuhannya, terjadi sintesis protoplasma baru dalam
sitoplasma vegetatifnya yang dimaksudkan untuk menjadi spora. (Pelczar,1986)
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang, hal ini bergantung pada spesies. Endospora
ada yang lebih kecil dan ada pula yang lebih besar daripada diameter sel induk. (Dwidjoseputro, 2001)
Letak endospora di dalam sel serta ukurannya selama pembentukannya tidaklah sama bagi semua
spesies. Sebagai contoh, beberapa spora adalah sentral yaitu dibentuk di tengah-tengah sel, yang lain
terminal yaitu dibentuk di ujung; dan yang lain lagi subterminal yaitu di dekat ujung. (Pelczar,1986)
Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi, jika keadaan medium memburuk, zat-zat yang timbul
sebagai pertukaran zat bertimbun-timbun dan faktor-faktor luar lainnya merugikan. Tetapi pada
beberapa spesies mampu membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi dapat
dicegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium yang baru. Beberapa spesies bakteri dapat
kehilangan kemampuannya untuk membentuk spora. Spora dapat tumbuh lagi menjadi bakteri biasa
apabila keaadaan di luar menguntungkan. Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora
mengembang dan kulit spora menjadi retak karenanya. Keretakan ini dapat terjadi pada salah satu ujung,
tetapi juga dapat terjadi pada tengah-tengah atau dekat tengah-tengah spora. Hal ini merupakan ciri
khas bagi beberapa spesies Bacillus. Jika kulit spora pecah di tengah-tengah, maka masing-masing
pecahan akan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri. (Dwidjoseputro, 2001)

PEWARNAAN SPORA BAKTERI

Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri terhadap pengaruh
buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik lagi bagi mereka, maka pecahlah bungkus spora dan
tumbuhlah bakteri. Spora lazim disebut endospora ialah karena spora itu dibentuk di dalam sel.
Endospora jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk dari pada bakteri biasa yaitu bakteri
dalam bentuk vegetatif. Sporulasi dapat dicegah, jika selalu diadakan pemindahan piaraan ke medium
yang baru.
Endospora dibuat irisan dapat terlihat terdiri atas pembungkus luar, korteks dan inti yang mengandung
struktur nukleus. Apabila sel vegetatif membentuk endospora, sel ini membuat enzim baru,
memproduksi dinding sel yang sama sekali baru dan berubah bentuk. Dengan kata lain sporulasi adalah
bentuk sederhana diferensiasi sel, karena itu, proses ini diteliti secara mendalam untuk mempelajari
peristiwa apa yang memicu perubahan enzim dan morfologi.
Spora biasanya terlihat sebagai badan-badan refraktil intrasel dalam sediaan suspensi sel yang tidak
diwarnai atau sebagai daerah tidak berwarna pada sel yang diwarnai secara biasa. Dinding spora relatif
tidak dapat ditembus, ini pula yang mencegah hilangnya zat warna spora setelah melalui pencucian
dengan alkohol yang cukup lama untuk menghilangkan zat warna sel vegetatif. Sel vegetatif akhirnya
dapat diberi zat warna kontras. Spora biasanya diwarnai dengan hijau malachit atau carbol fuchsin.
Spora kuman dapat berbentuk bulat, lonjong atau silindris. Berdasarkan letaknya spora di dalam sel
kuman, dikenal letak sentral,subterminal dan terminal. Ada spora yang garis tengahnya lebih besar dari
garis tengah sel kuman, sehingga menyebabkan pembengkakan sel kuman.

PROSEDUR KERJA
Metode : Klein
Tujuan : Untuk melihat spora bakteri
Prinsip : Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori
membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan
zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada
badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Cara Kerja :
• Dibuat suspensi kuman, ditambah dengan carbol fuchsin sama banyak.
• Dipanaskan selama 6 menit pada api kecil atau pada penangas air 80oc selama 10 menit.
• Dibuat sediaan dan dikeringkan.
• Dimasukkan kedalam H2SO4 1% selama 2 detik
• Dimasukkan kedalam alkohol sehingga tidak ada lagi warna merah mengalir.
• Sediaan dicuci dengan air.
• Diwarnai dengan methylen blue selama 1 menit kemudian dicuci dan dikeringkan.
• Diperiksa dibawah mikroskop.

Interpretasi hasil : Spora : warna merah dan Badan bakteri : warna biru.
 Diposkan oleh HENDRO di Minggu, September 09, 2012

Pewarnaan SPORa
Untuk mempermudah pengamatan, terutama pada spora bakteri dilakukan metode pewarnaan
spora agar peneliti ataupun pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan vel vegetatif
ataupun mengamati bentuknya. Menurut Waluyo (2004) endospora tidak mudah diwarnai dengan
zat pewarna pada umumnya. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora
dengan larutan Hijau Malakit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan
larutan Hijau Malakit. Pada pengecatan ini, sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam
endospora dengan perlakukan larutan Hijau Malakit. Teknik ini akan menghasilkan warna hjau
pada endospora dan merah pada sel vegetatif.
Pada pengecatan endospora dengan larutan Hijau Malakit, bakteri penghasil endospora
menunjukkan reaksi positif yaitu larutan Hijau Malakit akan berikatan dengan spora sehingga
saat pencucian akan tetap berwarna hijau dan cat penutup Safranin tidak bisa masuk/diikat oleh
endospora. Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka larutan Hijau
Malakit tidak dapat diikat (Fardiaz, 1992).

Prosedur pewarnaan spora bakteri adalah sebagai berikut:

1. Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan di atas nyala api spritus.
2. Teteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut
3. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa lalu letakkan
di atas tetesan aquades itu kemudian ratakan perlahan-lahan
4. Ambillah kaca benda lain yang bersih lalu letakkan di ats kaca benda
sediaan tersebut sehingga membentuk sudut 450
5. Geserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan
merata, biarkan sampai mengering
6. Lakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut di atas nyala api
lampu spritus dengan cepat
7. Teteskan larutan hijau malakit di atas sediaan itu lalu panaskan sediaan
tersebut diatas nyala api spritus selama 3 menit, jagalah jangan sampai
sediaan mendidih atau mengering, jika mengering, tambahkan tetesan
larutan hijau malakit. Selama pemanasan jepitlah sediaan dengan pinset.
8. Letakkan larutan hijau malakit di atas kawat penyangga yang diletakkan di
atas mangkuk pewarna, lalu biarkan sampai dingin
9. Cucilah kelebihan larutan hijau malakit dengan air kran dalam botol
penyemprot
10. Teteskan larutan safranin di atas sediaan tersebut, lalu biarkan selama satu
menit
11. Cucilah kelebihan larutan safranin pada sediaan itu
12. Keringkan seiiaan dengan kertas penghisap dan amatilah di bawah
mikroskop.
jika pewarnaan ini berhasl dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan
berwarna merah, jika sel membentuk spora maka spora akan
Nampak berwarna hijau.

Beberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di dalam tubuh
vegetatif bakteri tersebut, dapat berada di bagian tengah (central), ujung (terminal) ataupun
tepian sel. Pelczar (1986), menyatakan bahwa spora merupakan tubuh bakteri yang secara
metabolik mengalami dormansi, dihasilkan pada faselanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang
sama seperti asalnya, yaitu sel vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun
kimiawi.

Santoso (2010) menyebutkan bahwa ada dua genus bakteri yang dapat membentuk endospora,
yaitu genus Bacillus dan genus Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh
vegetative bakteri disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang
terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora merupakan sel
yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami penebalan serta memiliki beberapa
lapisan tambahan.

Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat bertahan pada
kondisi yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat membentuk endospore ini dapat
hidup dan mengalami tahapan-tahapan pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora
terbentuk melalui sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.

Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan pewarnaan tertentu
yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk
& Wheeler tersebut adalah dengan penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas
pengamatan, sel vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative
ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati, bahkan posisi
spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus
untuk mewarnai spora dan di dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan,
yaitu; spora dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat warna
tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.

Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora bakteri, tidak lepas dari
sifat kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora bakteri mengandung asam dupikolinat.Yang
mana subtansi ini tidak dapat ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa
ini khas dimiliki oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah yang kemudian
dimanfaatkan untuk di warnai menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini larutan hijau
malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986), selain subtansi di atas, dalam spora bakteri juga
terdapat kompleks Ca2+dan asam dipikolinan peptidoglikan.

Proses pembentukan spora disebut sprorulasi, pada umumnya proses ini mudah terjadi saat
kondisi medium biakan bakteri telah memburuk, hal ini sesuai dengan kenyataan bahwa, sampel
yang diambil dalam praktikum ini berasal dari biakan bakteri yang dibuat beberapa minggu yang
lalu, sehingga di asumsikan, nutrisi di dalam medium telah hampir habis, sehingga diharapkan
bakteri melakukan proses sporulasi ini. Haapan ini terbukti benanr dengan kenyataan bahwa dari
kedua sampel yaitu koloni 1 dan koloni 2, keduanya sama-sama menghasilkan spora.

Namun menurut Dwijoseputro (1979) beberapa bakteri mampu membentuk spora meskipun
tidak dalam keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi. Hal ini dimungkinkan karena
bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan pertumbuhan dan perkembangannya memang
memiliki satu fase sporulasi. Masih menurut Dwijoseputro (1979) jka medium selalu diadakan
pembaruan dan kondisi lingkungan disekitar bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis
bakteri dapat kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan karena
struktur bakteri yang sangat sederhana dan sifatnya yang sangat mudah bermutasi, sehingga
perlakuan pada lingkungan yang terus menerus dapat mengakibatkan bakteri mengalami mutasi
dan kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora.

Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam beberapa tahapan, secara
singkat bagan proses pembentukan spora bakteri di atas dapat dijelaskan sebagai berikut:
1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora
2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar membran kini menjadi lapisan
dalam membran (calon) spora.
3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks)
4. Pembentukan korteks
5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika spora mendapatkan
lingkungan yang kondusif, maka ia bisa tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru. (sumber:
FMIPA UPI)

Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-tahun bahkan berabad-
abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal. Kebanyakan sel vegetatif akan mati
pada suhu 60-70oC, namun spora tetap hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air
mendidih bahkan selama 1 jam lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora
akan tetap menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan
tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal (Volk & Wheeler,
1988).

Teknik pewarnaan bakteri

Teknik Pewarnaan Bakter

1. Mengamati Morfologi Bakteri

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang
ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan
bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat
warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya
ditingkatkan.

Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam
memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam
bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna
asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan
zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.

2. Jenis Pewarnaan

Pewarnaan pada bakteri di bagi menjadi tiga, yaitu :

2.1 Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana
karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan
bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat
basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat
alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna
basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol
fuehsin. yang man pewarnaan sederhan ini di bagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan

a. Pewarnaan Asam

Mewrupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan untuk hanya untuk
melihat bentuk sel. adapun zat warna yang di pakai dalam pewarnaan positif adalah biru metilen, dan air
furksin.

Cara kerja untuk melakukan pewarnaan bakteri yaitu sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan
bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu
padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri
dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object
glass tanpa merusak struktur selnya.

b. Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka
terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh
dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

Cara kerja pewarnaan negatif, yaitu ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung
kanan salah satu object glass. biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi,
lalu dicampurkan Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri Biarkan
preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di atas api.
.2 Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik
dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-
negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah
metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok
berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini
berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa
pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci
warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel,
bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila
komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah
warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada
hasil akhir tetap warna dasar. Jadi bahan zat warna yang di pakai dalam pewarnaan gram, yaitu kristal
violet, larutan iodin, alkohol 90 %, dan larutan safranin. Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram
merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang
dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

a. Bakteri Gram negatif

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri
ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
 Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi
organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel
gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).b.Bakteri
Gram Positif

Bakteri gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses
pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri
gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya
mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen
utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.

Cara kerja pewarnaan diferensial, yaitu Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api
bunsen teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut secara aseptik ambilah inokulum
bakteri yang akan diperksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan perlahan-lahan
ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering fiksasi
dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat letakkan apusan diatas kawat
penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan larutan kristal violet pada apusan dan
biarkan selama 30-60 detik cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan teteskan larutan iodin pada
apusan, biarkan selama 30-60 detik cuci larutan iodin dengan air mengalir, keringkan rendam atau basuh
dengan alkohol ... % selama ... detik teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik cuci dengan air
mengalir, lalu keringkan amati dengan mikroskop gambar bentuk morfologi

1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil
tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan
melengkung (Dwidjoseputro.1998).

Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu
teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-
penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro.1998).
 Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri
dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan
listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka
dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta
mengikuti aturan dasar yang berlaku (Lay.1994)

Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan
mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian bakteri.

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana
sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangkaian pengecatan

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga
kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan
struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan
yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan
yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan
bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan
ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan
asam (Dwidjoseputro.1998).

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih
dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Hadiutomo. 1990). Pada umumnya bakteri bersifat tembus
cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas
ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna
yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
 Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram
negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri
tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur
biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan
adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu
ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan
basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna
basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna
negatif (Hadiutomo. 1990).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna basa bagian
yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki muatan positif.
Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan
negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan didinding sel,
membran sel dan sitoplasmasewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan
berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas terlihat
(Dwidjoseputro.1998).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya
dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan
negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat
warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa
muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya
sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut pewarnaan positif

dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat
warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling
mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna.
 Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas
(Dwidjoseputro.1998)

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian
difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat
bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan
suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat.
Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu
mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali setelah
pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat dilakukan dengan cara
melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol. Fiksasi digunakan untuk :

1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai

2. Melekatkan bakteri pada glass objek

3. Mematikan bakteri

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan
kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat
warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit.
Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering
digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).

Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan
untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu
yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat
penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur
( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat
dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin,
kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai
 lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar
belakang hitam (Lay.1994).

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bioteknologi dari Denmark yang
bernama Christian Gram pada tahun 1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri
gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat
bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Pewarnaan
gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan itu merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi
bakteri (Lay,1994)

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48
jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan
tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini
menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri
gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga
terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994)

Cirri-ciri gram negative:

 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
 Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam lapisan kaku,
sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif:

 Struktur dindingnya tebal

 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
 Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
 Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu

 a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu

b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan

c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam

d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme
untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk :

 Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar

 Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
 Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa
3.3. Cara Kerja

3.3.1. Pewarnaan Sederhana

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen

2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat
glass menggunakan jarum ose

3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass

4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

5. Diteteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes

6. Dikeringkan dan dianginkan selama 1 menit

7. Dicuci dengan air mengalir

8. Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan

9. Diamati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri

3.3.2 Pewarnaan Negatif

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen
2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat
glass menggunakan jarum ose

3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass

4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

5. Diteteskan larutan zat warna tinta cina 1 tetes

6. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

7. Dicuci dengan air mengalir

8. Dikeringkan preparat dengan dianginkan, dan

9. Diamati dibawah mikroskop

3.3.3 Pewarnaan Gram

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen

2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat
glass menggunakan jarum ose

3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass

4. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

5. Diteteskan larutan zat warna crystal violet 2-3 tetes dan didiamkan selama 1 menit

6. Dikeringkan dan dianginkan preparatnya

7. Dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan

8. Diteteskan dengan larutan Lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci dengan air mengalir dan
diangin keringkan

9. Kemudian dicuci dengan dengan alkohol 95% selama 30 detik, lalu dicuci dengan air mengalir dan
dikering anginkan

10. Diberi larutan basic fuchsin atau safranin selama 2 menit

11. Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan

12. Diamati dibawah mikroskop

3.3.4 Pewarnaan Spora

1. Dibersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi di atas bunsen

2. Dipijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi juga sedikit aquades pada preparat
glass menggunakan jarum ose

3. Dipijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu diratakkan di atas preparat glass

4. Ditutup dengan kertas saring

5. Diteteskan malachite green kemudian difiksasi

6. Didiamkan selama 5 menit dan dibuang kertas saring

7. Dibilas dengan air mengalir dan kemudian dianginkan

8. Diteteskan safranin dan dikeringkan tanpa fiksasi

9. Diamati dibawah mikroskop

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1. Tabel hasil pengamatan pewarnaan

No. Teknik Pewarnaan Pengamatan

1. Pewarnaan Sederhana Keterangan :

Perbesaran 400
Berwarna Ungu
Berbentuk basil

2. Pewarnaan Negatif Keterangan :

Perbesaran 400
Berwarna Kuning
Berbentuk coccus

3. Pewarnaan Gram Keterangan :

 Perbesaran 400
Berwarna Merah
Berbentuk basil
Gram negatif

4. Pewarnaan Spora Keterangan :

Perbesaran 400
Berwarna Merah
Berbentuk coccus

4.2 Pembahasan

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satumacam zat warna dengan
tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya .
pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pasda umumnya antara lain kristal violet , metylen
blue , karbol , fuchsin , dan safranin(lay ,1994).

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana
bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu
metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel
bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak
berwarna(negatif) (Lay.1994).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram
positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan
tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna
crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan
tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi
dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : crystal violet, alkohol,
safranin, dan iodine (Lay.1994).

Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malachite green dan safranin,
yang dalam hasil pewarnaannya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel
vegetatifnya yaitu pada Bacillus subtitulis (Lay.1994).
 Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari satu
zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi
bakteri secara umum(Dwidjoseputro.1998).

Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana digunakan
larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam latar belakangnya
(Lay.1994)

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga
menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci
(Dwidjoseputro.1998).

Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green
dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah
pada sel vegetatifnya (Lay.1994)

Fuchsin carbon, merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam prosedur
pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobkateria karena memiliki
ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, carbol fuchsin juga digunakan
sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994)

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai
histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri,
jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).

Nigrosin adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan
campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak,
pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri.
Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap.
Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau
carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga
organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa
mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa.

Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam
air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air
 minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis
(Dwidjoseputro.1998).

Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan
sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini
adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan,
musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil safranin kedua
senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin
tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari
kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik (Sutedjo,1991)

Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik
dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan
bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994).

Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri dengan bentuk
basil dan berwarna ungu dalam pembesaran 400. Pada pewarnaan negatif, tidak ditemukan terlalu
banyak bakteri, ditemukan bakteri dengan bentuk coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya
berwarna biru gelap dan bakteri berwarna kuning. Pada pewarnaan gram ditemukan bakteri jenis gram
negatif dengan warna merah dan memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop hingga 400.
Sedangkan, pada perwarnaan spora yang menggunakan malachite green dan safranin, spora seharusnya
berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya warna merah dari safranin, yaitu sel
vegetatifnya dengan bentuk coccus pada perbesaran 400 di mikroskop.

Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan
sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri
yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat
warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air

5.1 Kesimpulan

Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :

 Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
 Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif berwarna
ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan terjadi pada dinding
selnya

 Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan differensial,pewarnaan

spora dan perwarnaan kapsul

 Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol fuchsin,
crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s iodida, dan safranin.

5.2 Saran

Sebaiknya pada praktikum dilakukan percobaab yang lain seperti pewarnaan kapsul, basil tahan
asam, dan perwarnaan fulton, diharapkan dengan mempelajari berbagai macam metode pewarnaan
lebih banyak mengenai tentang proses dan metode pewarnaan.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : Djambatan

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali

Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta

Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press

LAPORAN BAKTERIOLOGI : BAKTERI TAHAN ASAM

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikroorganisme di dunia ini ada yang menguntungkan dan ada juga yang merugikan.
Mikroorganisme yang menguntungkan dapat kita manfaatkan untuk kepentingan kesejahteraan
hidup manusia. Akan tetapi, banyak juga mikroorganisme yang tidak menguntungkan kita yaitu
dengan menyebabkan terjadinya penyakit pada tubuh manusia. Salah satu mikroorganisme yang
dapat menyebabkan atau menginfeksi manusia adalam Mycobacterium tuberculosis. Bakteri ini
dapat mengakibatkan penyakit tuberculosis pada manusia. Tuberculosis merupakan salah satu
penyakit yang mematikan dan berbahaya di dunia.
Percobaan tentang transmisi penyakit TBC pertama kali dilakukan oleh Klencke pada
tahun 1843. Klencke memproduksi TBC di dalam tubuh kelinci dengan inokulasi jaringan TBC
 secara intravena. Infeksi oleh kuman TBC juga dibuktikan oleh Villemin pada tahun 1865
dengan cara memproduksi penyakit ini pada kelinci dengan inokulasi jaringan TBC tipe human
dan bovine. Dia yang pertama kali mendemonstrasikan perbedaan resistensi kelinci terhadap
organisme tipe human dan bovine. Villemin menyimpulkan bahwa TBC adalah penyakit spesifik,
TBC disebabkan oleh agen inocilable, penyakit ini dapat menular dari manusia ke kelinci, TBC
adalah penyakit yang mematikan. Robert Koch merupakan penemu Mycobacterium tuberculosis
pada tanggal 24 Maret 1882, sehingga untuk mengenang jasanya bakteri tersebut diberi nama
baksil Koch. Bahkan, penyakit TBC pada paru-paru kadang disebut sebagai Koch Pulmonum
(KP). Bakteri ini berbentuk batang dan bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Batang
Tahan Asam (BTA) (Pelczar dan Chan, 1988).
Tuberkulosis (TBC) yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis yang menyerang
paru dan juga memberikan efek terhadap susunan saraf pusat, sistem limfatik, sistem sirkulasi,
sistem urogenital, tulang, tulang sendi, dan kulit. Penyakit ini diketahui dapat menyerang semua
bangsa burung, mamalia, primata, termasuk manusia. Selain Mycobacterium tuberculosis (tipe
human), dikenal juga spesies Mycobacterium bovis, dan Mycobacterium avium. Mycobacterium
bovis dan Mycobacterium avium jarang terjadi pada orangutan. Hanya terdapat sekitar 10%
laporan kasus TBC pada primata yang disebabkan oleh Mycobacterium bovis. TBC tipe Human
yang paling banyak ditemukan pada primata dan manusia (Sari 2004).
Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga
tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam.
Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna
pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen
pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium
tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif
terdapat bakteri TBC berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti
marmut, dan kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar
dan Chan, 1988).
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun
Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk analisis
tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum:
a. Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.
b. Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.
c. Collection sputum : sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam.
Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.
Tujuan dari praktikum ini adalah dapat melakukan pewarnaan BTA untuk menganalisis
adanya infeksi Mycobacterium tuberculosis.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum adalah sputum yang mengandung BTA,
pewarna Ziehl- Neelson (larutan karbol fuchsin 0,3%, alkohol asam 3% , dan methylen blue
0,3%.
1. Pembuatan sediaan apus sputum
a) Ose dipanaskan di atas api spirtus sampai merah dan didinginkan.
b) Sputum disiapkan (hati-hati, hindari droplet/percikan sputum), diambil sedikit dari bagian yang
kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen) menggunakan ose.
c) Sputum dioleskan secara merata pada object glass (ukuran 2x3 cm).
d) Ose yang telah digunakan dimasukkan ke dalam alcohol sambil digoyang-goyang sampai sisa-
sisa sputum bersih, kemudian dibakar.
e) Sediaan yang telah dibuat dikeringkan di udara terbuka sekitar 15-30 menit, jangan sampai
terkena sinar matahari langsung.
f) Sediaan diambil dengan pinset dan difiksasi elama 3-5 detik.
2. Pewarnaan atau pengecatan
a) Sediaan yang telah kering dilakukan fiksasi dan digenangi dengan carbol fichsin 0,3%,
dipanaskan di atas pembakar spirtus sampai menguap tatapi jangan sampai mendidih/kering
selama 5 menit.
b) Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
c) Warna merah dilarutkan pada sediaan sampai bersih dengan 3% alkohol-asam.
d) Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
e) Sediaan digenangi dengan larutan methylen blue selama 20-30 detik.
f) Sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.
3. Pembacaan dan Penilaian
a. Pembacaan
1. Sediaan yang telah kering ditetesi dengan minyak imersi, dilihat dengan mikroskop
dengan perbesaran 100 kali.
2. Sediaan di bawah mikroskop dicari dengan adanya batang panjang atau pendek yang
berwarna merah dengan latar belakang berwarna biru.

b. Penilaian
1. BTA negatif : apabila dalam 100 LP atau selama 15 menit pengamatan tidak dijumpai adanya
BTA.
2. BTA positif : apabila dalam pengamatan dijumpai adanya BTA.
BTA positif apabila dibuat sediaan langsung dan diwarnai dengan Ziehl-Neelsen atau Kinyoun
Gabbet, maka dapat dilakukan penilaian sebagai berikut :
Penilaian menurut IUATLD (International Union Againts Tuberculose Lung Disease)
o Negatif : tidak dijumpai adanya BTA
o Positif : ditemukan 1-9 BTA/100 LP
o Positif 1 : ditemukan 10-90 BTA/100 LP
o Positif 2 : ditemukan 1-10 BTA/1 LP
o Positif 3 : ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP.
Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan
anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan. Bakteri ini memilki
dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi lipoidal oleh karena itu bakteri ini
hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan
impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika
proses pewarnaan, bakteri tahan asam ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri
tersebut disebut bakteri tahan asam (Ball, 1997). Contoh dari bakteri tahan asam yaitu dari genus
Mycobacterium. Bakteri ini memiliki sejumlah besar zat lipoidal (berlemak) di dalam dinding
selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relative tidak permeabel terhadap zat-zat
warna yang umum sehingga sel-sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan
biasa, seperti pewarnaan sederhana atau pewarnaan gram (Dwijoseputro, 1994).
Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk filament.
Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan
bakteri gram positif. Namun, sekali mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka
warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria
 disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang juga memiliki
sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa
Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan
arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding
sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul
lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen,
menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga (Thomas, 1999).
Mikobakteria dapat tumbuh lebih cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 -
6.8 untuk tipe pathogen. Bakteri ini mempunyai susunan dinding yang melindungi bakteri jika
hidup di luar inangnya. Dinding sel mikobakteria menyebabkan penundaan hipersensitivitas dan
beberapa diantaranya resisten terhadap infeksi. Sel mikrobakteria dapat menunda reaksi
hipersensitifitas pada hewan yang sebelumnya sensitif. Sel mikobakteria terdiri dari tiga lapisan
penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida. (Mudihardi, 2005).
TBC (tuberculosis) adalah penyakit yang ditandai dengan timbulnya bintik-bintik
tuberkel pada alveolus akibat infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis yang menyebabkan
terganggunya difusi oksigen. Penyebab penyakit ini adalah bakteri kompleks Mycobacterium
tuberculosis. Mycobacteria termasuk dalam famili Mycobacteriaceae dan termasuk dalam ordo
Actinomycetales. Kompleks Mycobacterium tuberculosis meliputi M. tuberculosis, M. bovis, M.
africanum, M. microti, dan M. canettii. Dari beberapa kompleks tersebut, M. tuberculosis
merupakan jenis yang terpenting dan paling sering dijumpai (Thomas, 1999).
Tubercolosis merupakan salah satu penyakit yang mematikan didunia selain AIDS
bahkan merupakan penyebab utama kematian di negara berkembang. Oleh sebab itulah
diperlukan suatu metode yang efektif untuk mencegah penularan yang lebih luas lagi dan
penanganan yang tepat terhadap pasien yang positif terkena tuberculosis. Jumlah penderita TBC
menurut WHO, Treatment of Tuberculosis, Guidelines for National Programes (1997), mencapai
kira-kira 9 jt/tahun dengan kematian 3 juta orang. Penderita TBC sangat banyak di negara
berkembang mencapai 95 % dengan 75% adalah penderita usia produktif (15-50 tahun) (Depkes
RI, 2001).
Sumber penularan adalah penderita TBC yang dahaknya mengandung Mycobacterium
tuberculosis. Infeksi bakteri ini paling sering disebarkan melalui udara (air borne, droplets
infection). Penyebaran melalui udara berupa partikel-partikel percikan dahak yang mengandung
bakteri berasal dari penderita saat batuk, bersin, tertawa, bernyanyi atau bicara. Partikel
mengandung bakteri ini akan terhisap oleh orang sehat dan menimbulkan infeksi di saluran
napas. Bakteri Mycobacterium tuberculosis mencemari udara yang ditinggali atau ditempati
banyak manusia, karena sumber dari bakteri ini adalah manusia. Bakteri ini dapat hidup selama
beberapa jam pada udara terbuka, dan selama itulah akan beterbangan di udara hingga akhirnya
menemukan manusia sebagai tempat hidup (Clifton, 1958).
Menurut Chivers dan Ford (1978), gejala klinis TBC pada manusia yang dapat diamati
diantaranya:
- Batuk-batuk berdahak lebih dari dua minggu, batuk berdarah atau pernah mengeluarkan darah,
dada terasa sakit atau nyeri, terasa sesak pada waktu bernafas.
- Berat badan turun selama 3 bulan berturut-turut tanpa sebab yang jelas dan tidak naik dalam 1
bulan meskipun sudah dengan penanganan gizi yang baik.
- Nafsu makan tidak ada (anorexia) dengan gagal tumbuh dan berat badan tidak naik (failure to
thrive).
- Demam lama atau berulang tanpa sebab yang jelas, setelah disingkirkan kemungkinan penyebab
lainnya (bukan tifus, malaria atau infeksi saluran nafas akut), dapat juga disertai keringat malam.
- Gejala - gejala dari saluran nafas, misalnya batuk lama lebih dari 30 hari (setelah disingkirkan
sebab lain dari batuk), nyeri dada ketika bernafas atau batuk.
- Apabila bakteri TB menyebar ke organ-organ tubuh yang lain, gejala yang ditimbulkan akan
berbeda-beda. Misalnya, kaku kuduk, muntah-muntah, dan kehilangan kesadaran pada TBC otak
& saraf (meningitis TB).
- Pembengkakan tulang pinggul, lutut, kaki dan tangan, pada TBC tulang & sendi.
Semua gejala yang ditimbulkan diatas sering berkaitan dengan patogenitas organisme, pejalanan
penyakit, tingkat infeksi, dan beberapa faktor dari induk semang. Masa inkubasi tuberkulosis
sangat lama, kejadiannya berlarut-larut, dan gejala klinis yang nyata jarang terlihat dengan jelas
hingga penyakit ini berkembang lebih lanjut.
Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau
pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu optimal
37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan tambahan
makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam jaringan, basil tuberkel
adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm. Pada media buatan, bentuk kokoid
dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke spesies lain. Segera setelah diwarnai
dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan
pengobatan dengan iodine. Basil tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-
Neelsen. Media untuk membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif.
Media selektif berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi
yang berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media nonselektif
dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11), media telur inspisasi
(Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et al., 2001).
Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi beberapa
senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada aktivitas biokimia
yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada sebagian besar bakteri.
Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk saprofit cenderung tumbuh
lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk menghasilkan pigmen yang lebih
banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada bentuk patogenik. Mikobakteria
cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada bakteri lain karena sifat hidrofobik
permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel reisten terhadap kekeringan dan bertahan
hidup selama periode waktu yang lama dalam sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni,
pigmentasi, virulensi, temperatur petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan
atau seluler lainnya (Fardiaz, 1992).
Mikobakteria kaya akan lipid, bahan dari lilin dan fosfatida. Lapisan lilin pada dinding
sel ini menyebabkan bakteri ini tahan terhadap keadaan di luar tubuh induk semang. Bakteri
dapat tahan berbulan-bulan di luar tubuh induk semang, jika terbungkus eksudat, tinja, dalam
cairan atau dalam jaringan organ tubuh yang membusuk. Dalam sel, lipid secara meluas
berikatan dengan protein dan polisakarida. Muramil dipeptida (dari peptidoglikan) yang
diperkaya dengan asam mikolat dapat menyebabkan nekrosis kaseosa. Lipid pada beberapa
perluasan bertanggung jawab terhadap kecepatan asam, yang terganggu pada integritas dinding
sel dan kehadiran lipid tertentu. Kecepatan asam juga hilang setelah sonikasi sel mikobakteria
(Mudihardi, 2005).
 Cara diagnosa penyakit TBC dengan menggunakan pendekatan mikrobiologis adalah
dengan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA). Pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)
menggunakan beberapa teknik atau metode pewarnaan. Teknik pewarnaan tersebut antara lain
Tan Thiam Hok (Kinyoun Gabber), Ziehl-Neelsen, dan Fluorokrom. Metode Ziehl-Neelsen
merupakan pewarnaan standar untuk mengamati M. tuberculosis (Karuniawati et al.,2005).
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol fuchsin
0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol
fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang
dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan dahak.
Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri
sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga
carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol,
maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir
untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah,
sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga
sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri
tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994).
Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsen dapat
menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tahan asam (acid
fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak tahan asam
(non acid fast).
Teknik pewarnaan Tan Thiam Hok (Kinyoun-Gabber) menggunakan larutan Kinyoun dan
Gabber. Komposisi larutan Kinyoun yaitu fuchsin basis 4g, fenol 8ml, alkohol 95% 20ml, H2O
destilata (100ml) dan larutan gabbett yaitu methylen blue 1gr, H2SO4 96 % 20 ml, alkohol
absolut 30 ml, dan H2O destilata 50 ml. Pewarnaan yang lain yaitu pewarnaan Fluorokrom
(Auramine O). Sampel atau sediaan direndam dalam larutan Auramine (Merck) dan dibiarkan
selama 15 menit lalu dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Setelah itu, sediaan tadi direndam
dalam asam alkhohol, dibiarkan selama 2 menit dan dicuci dengan akuades dan dikeringkan.
Setelah kering sediaan direndam dalam poasium permanganat 0,5 %, dibiarkan selama 2 menit
lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan di udara (Kurniawati et al., 2005).
Metode pewarnaan yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu Ziehl-Neelsen.
Metode ini digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang
cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom.
Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan tidak
membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat
yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005).
Larutan kimia yang digunakan pada praktikum kali ini adalah alkohol asam 3% , carbol
fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam
alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin
agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis.
Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri akan
tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk., 1980).
Hasil praktikum kemarin diperoleh bahwa sputum yang diambil oleh kelompok 1
bernilai positif 2. Hal itu dikarenakan ditemukan bakteri basil berwarna merah berjumlah 2 buah
 dalam 1 LP dalam sediaan apus yang diamati di bawah mikroskop. Hal ini sesuai dengan standar
yang terdapat dalam IUATLD (International Union Against Tuberculosis Lung Disease) seperti
berikut :
- Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA
- Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP
- Positif 1 : Ditemukan 10-99 BTA/100 LP
- Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP
- Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP
Berikut ini adalah gambar hasil praktikum yang menunjukkan adanya Mycobacterium
tuberculosis.
A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, maka dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut :

1. Teknik pewarnaan bakteri tahan asam (BTA) ada tiga yaitu Tan Thiam hok (Kinyoun Gabber),

Ziehl-Neelsen, dan Fluorokrom.

2. Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari sputum penderita TBC dengan pewarnaan

Ziehl-Neelsen. Metode ini menggunakan carbol fuchsin 0,3 %, alkohol asam 3 %, dan methylen

blue 0,3%. Bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru.

3. Sediaan sputum pada kelompok satu menunjukkan hasil positif karena ditemukannya bakteri

tersebut dalam sediaan yang diamati.

DAFTAR REFERENSI

Ball, A.S. 1997. Bacterial Cell Culture : Essential Data. John Wiley & Sons, New York.

Chivers, D.J., Ford, E.H.R. 1978). Recent Advances in Primatology. Vol. 4 Medicine. Academic Press.
London.

Clifton, C. E. 1958. Introduction to the Bacteria Second Edition. McGraw-Hill Book Co. Inc., New York,
Toronto, London, and Kogakusha Co. Ltd., Tokyo.

Dwidjoseputro. 1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan, Malang.

Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan dan Sekolah Tenaga
Kesehatan Yang Sederajat. Citra Aditya Bakti, Bandung.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Jawetz, Melnick, Adelberg’s. 2001. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika, Jakarta.

Jutono, Soedono, S., S. Hartanti, Suhandi, D. S., K. Soesanto. 1980. Analisis Praktikum Mikrobiologi
Umum untuk Perguruan Tinggi. UGM Press, Yogyakarta.

Kurniawati et al., 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen, dan fluorokrom sebagai Metode
Pewarnaan Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopis Sputum. Makara Kesehatan. Vol
9, June 2005 : 29-33.

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada, Jakarta.

Pelczar, M. J., E. C. S. Chan. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 2. UI Press, Jakarta.

Sari, Y.S. 2004. Penyakit Infeksius yang menular Melalui Udara pada Orangutan (Pongo pygmaeus).
Karya Tulis. FKH-IPB. Bogor.

Thomas Dormandy (1999). The White Death: A History of Tuberculosis. ISBN 0-8147-1927-9 HB - ISBN
1-85285-332-8 PB

PEWARNAAN BTA ( Zeihl neelsen)

PEWARNAAN BTA
( BASIL TAHAN ASAM )
Metode Zeihl-Neelsen

IV. Dasar Teori

Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah dahak atau
sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc. Jika jumlah kuman
kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu tidak akan kelihatan di
bawah mikroskop.
Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan sebanyak
3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai berikut :
 Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa saja ke
poliklinik.
 Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur
 Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi
tersebut.
Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari kelenjar dalam
rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak terdapat kuman TB.
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna
karbol-fuchsin (fuchsin basayang dilarutkan dalam suatu campuran
phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol.
Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin
kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci
dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau).
Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa
Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan
berwarna sesuai warna kontras.
Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak
membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan
terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan
karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium
tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping
lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat
bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan
sebagai gram positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna
basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski
dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh
sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang mengandung 3 % asam
hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna
semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat tahan asam ini bergantung
pada integritas struktur selubung berlilin. Pada dahak atau irisan
jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena memberi fluoresensi
kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya
auramin, rodamin).

VI. Metode Kerja :

1. Pakailah masker
2. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
3. Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada goresan.
4. Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3 cm
sebagai pola.
5. Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan.
6. Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai membara mulai
ujung sampai kepangkal.
7. Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum yang kental
berwarna putih kekuninggan atau putih kehijauan, lalu diletakkan pada
kaca sediaan.
8. Sputum diratakan
9. Kemudian tangkai ose digoyangkan pelan-pelan untuk melepaskan sisa
partikel sputum yang melekat pada ose.
10. Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering barulah
dibakar sampai pijar.
11. Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan di atas nyala
api. sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu speritus sebanyak 3 X
selama 3-5 detik.
12. Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan menghadap
ke atas.
13. Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh permukaan kaca
sediaan.
14. Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara melewatkan
nyala api pada bagian bawah kaca sehingga keluar uap(jangan sampai
mendidih) selama 3 menit.
15. Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit.
16. Sediaan dicuci dengan air mengalir.
17. Tuangkan asam alkohol 70% di atas kaca sediaan sampai warna
merah dari fuchsin hilang.
18. Sediaan dicuci dengann air mengalir
19. Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan biarkan
selama 10-20 detik atau larutan methylen blue 0,1% selama 1 menit.
20. Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringkan pada suhu kamar.
21. Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop.
22. Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan, periksa dengan
okuler 10X dan objektif 100X.
23. Carilah basil tahan asam (BTA) yang berwarna merah dengan latar
belakang biru.
24. Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara
menggeserkan sediaan dari kiri ke kanan atau dari kanan ke kiripada
garis lurus.
25. Foto hasil pengamatan dan buatkan laporan
VII. Pembahasan
Pewarnaan Basil Tahan Asam (BTA) merupakan uji makroskopik yang
memiliki nilai diagnosa yang tinggi karena pemeriksaan tersebut dapat
memangkas isolasi bakteri yang akan memakan waktu sampai 8 minggu.
Cara pengambilan spesimen harus di perhatikan, contohnya dalam
pengambilan sampel darah atau dahak / sputum bukan hanya harus
dilakukan secara aseptik untuk menghindari kontaminasi, namun juga
harus diperhatikan waktu pengambilannya, karena infeksi bakteri
memiliki siklus tertentu. Hati-hati dengan hasil false positive dan false
negative. False positif maksudnya dalam sampel seharusnya tidak
ditemukan bakteri namun dalam pelaporan / pengerjaan ditemukan
 bakteri. Hal ini bisa terjadi bila dalam pengerjaan terjadi kontaminasi.
False negatif maksudnya dalam sampel seharusnya terdapat bakteri
namun dalam pengerjaan / pelaporan tidak ditemukan bakteri. Hal ini
bisa terjadi karena kurangnya ketelitian dalam penggunaan ose.
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang
sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka
lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu
pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali.
Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas.
Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil
warna biru dari methylen blue.
Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD sebagai
berikut :
• Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif
• Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah kuman yang
ditemukan.
• Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+)
• Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+)
Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+)
VIII. Hasil Pengamatan

IX. Kesimpulan
Setelah dilakukan pewarnaan di laboratorium secara mikroskopik,
dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen dapat dilakukan identifikasi bakteri
tahan asam, dimana bakteri akan terbagi menjadi dua golongan:
 Bakteri tahan asam, adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen
tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol,
sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Dibawah mikroskop
tampak bakteri berwarna merah dengan warna dasar biru muda.
 Bakteri tidak tahan asam, adalah bakteri yang pada pewarnaan Ziehl-
Neelsen, warna pertama, yang diberikan dilunturkan oleh asam dan
alkohol, sehingga bakteri akan mengikat warna kedua. Dibawah
miskroskop tampak bakteri berwarna biru tua dengan warna dasar biru
yang lebih muda.
 Interpretasi hasil : BTA : warna merah dan Non BTA : warna biru

PEWARNAAN TAHAN ASAM

A. Tujuan
1. Mempelajari dan mengenal cara pewarnaan tahan asam.
2. Melihat bentuk bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
B. Landasan teori
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin
basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam
klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin
kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan
akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies
Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-
lain akan berwarna sesuai warna kontras.
Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora.
Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh
asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium
tuberculosis dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira
0,4 x 3 µm.
Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat
diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif.
D. Cara Kerja
1. Menyiapkan 2 buah kaca objek yang bersih.
2. Membuat film.
3. Fiksasi.
4. Memberikan zat warna utama safranin.
5. Fikasasi.
6. Mendinginkan, kemudian cuci dengan air mengalir.
7. Mencuci dengan H2S04 sampai larutan pencucinya tidak berwarna lagi dan biarkan sampai
kering.
8. Setelah agak kering meneteskan metilen blue 1-2 menit.
9. Membuang kelebihan zat warna.
10. Membilas dengan air mengalir dan keringkan.
11. Mengamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 10 X 100. Bakteri “acid fast” berwarna
merah dan “ non acid fast” berwarna biru.
E. Hasil Pengamatan
1. Hasil pengamatan bakteri E.Coli

Pembesaran 10x
 Pembesaran 40x

2. Hasil pengamatan bakteri B. Substilis

Pembesaran 10x

Pembesaran 40x
F. Pembahasan

Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci
dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Akan tetapi ada juga preparat yang tahan
asam encer, misalnya bakteri-bakteri TBC dan basil-basil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa
itu adalah bakteri tahan asam. Ini merupakan cirri khas bagi suatu spesies.

Untuk menetukan sifat bakteri yang termasuk bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan asam
harus diwarnai dengan pewarnaan khusus. Pada umumnya, bakteri tahan asam merupakan
bakteri yang lapisan paling luar selnya terdiri dari lapisan lilin, sehingga menyebabkan zat warna
sukar masuk ke dalam sel bakteri.
Untuk mewarnainya maka lapisan lilin pada sel itu harus dihilangkan, yaitu dengan cara
pemanasan yang dimaksudkan supaya lilinnya meleleh, sehingga sel tersebut bias dengan mudah
menerima zat warna. Selain sukar menerima zat warna, bakteri than asam juga sukar menyerap
bahan penghilang zat warna (pencuci), sehingga walaupun dicuci dengan larutan asam encer, sel
bakteri ini akan tetap mengikat zat warna yang telah masuk. Sedangkan hasil bakteri yang telah
didapat menyerap biru saja, ini berarti bakteri merupakan bakteri tidak tahan asam.

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin
basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam
klorida dalam alkohol. Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri
yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang
terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat
dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium
bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae.
Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit
tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA).
Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).
Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium
dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena
dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan
pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang
 tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol
fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).
Uji bakteri tahan asam (BTA) pada praktikum kali ini menggunakan prosedur pewarnaan
Ziehl Neelson yaitu dengan memberi larutan pewarna carbol fuchsin, alkohol asam, dan
methylen blue. Bakteri genus mycobacterium dan beberapa spesies nocardia pada dinding selnya
mengandung banyak zat lipoid (lemak) sehingga bersifat permiable dengan pewarnaan biasa.
Bakteri tersebut bersifat tahan asam (+) terhadapa pewarnaan tahan asam. Pewarnaan tahan asam
dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam
menggunakan larutan ziehl-Neelsen A (cat karbol fuchsin), Ziehl-Neelsen B (alkohol asam :HCL
3% dalam metanol 95%) dan ziehl –neelsen C (cat biru metilen). Hasil pewarnaan maka bakteri
tahan asam akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.
G. Kesimpulan

Adakalanya, setelah suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci
dengan asam encer, maka semua zat warna terhapus. Akan tetapi ada juga preparat yang tahan
asam encer, misalnya bakteri-bakteri TBC dan basil-basil berspora. Maka dapat dikatakan bahwa
itu adalah bakteri tahan asam. Ini merupakan cirri khas bagi suatu spesies. Pewarnaan Ziehl
Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia
dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat
mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan alkohol
asam. Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam
karena larutan pemucat akan melakukan fuksin karbol dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak
berwarna

DAFTAR PUSTAKA
Jutono, dkk. (1980). Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi. Yogyakarta:
Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM. [25 Oktober 2012]

Lay, B. W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada. [25
Oktober 2012]
anonim. (2012). pewarnaan bakteri tahan asam. [online]. tersedia :
http://analisbantul.blogspot.com/2012/09/pewarnaan-bta-bakteri-tahan-asam.html. [ 15 januari
2013].

PENDAHULUAN
Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah dahak atau sputum. Dahak yang
diperiksa paling sedikit 3-5 cc. Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu
tidak akan kelihatan di bawah mikroskop.
Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu
pengambilan sebagai berikut :
• Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa saja ke poliklinik.
• Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur.
• Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi tersebut.
Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya
dalam ludah tidak terdapat kuman TB.

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin
basayang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam
klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin
kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan
akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies
Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-
lain akan berwarna sesuai warna kontras.

Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun
tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau
alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis
dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm.
Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat
diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa,
warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil
tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang
mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna
semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur
selubung berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena
memberi fluoresensi kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya
auramin, rodamin).

PROSEDUR KERJA
Metode : Zeihl neelsen
Tujuan : Untuk mencari BTA
Prinsip :
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang sukar ditembus cat.
Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat ditembus cat
basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali.
Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak
tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.

Prosedur Pembuatan Sediaan

• Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada goresan.
• Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3 cm sebagai pola.
• Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan.
• Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai membara mulai ujung sampai
kepangkal.
• Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum yang kental berwarna putih
kekuninggan atau putih kehijauan, lalu diletakkan pada kaca sediaan.
• Sputum diratakan seperti terlihat pada gambar :
• Dimasukkan ose kedalam botol yang berisi pasir dan olkohol 70 %(tinggi alkohol ± 3 cm diatas
pasir). Kemudian tangkai ose digoyangkan pelan-pelan untuk melepaskan sisa partikel sputum
yang melekat pada ose.
• Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering barulah dibakar sampai pijar.
• Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan di atas nyala api.sediaan dilewatkan
diatas nyala api lampu speritus sebanyak 3 X selama 3-5 detik.

Prosedur Pewarnaan
• Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan menghadap ke atas.
• Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh permukaan kaca sediaan.
• Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara melewatkan nyala api pada bagian bawah
kaca sehingga keluar uap(jangan sampai mendidih) selama 3 menit.
• Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit.
• Sediaan dicuci dengan air mengalir.
• Tuangkan asam alkohol 3% di atas kaca sediaan sampai warna merah dari fuchsin hilang.
• Sediaan dicuci dengann air mengalir
• Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan biarkan selama 10-20 detik atau
larutan methylen blue 0,1% selama 1 menit.
• Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringka pada suhu kamar.

Prosedur Pembacaan dan Interpretasi Hasil

• Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop.
• Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan, periksa dengan okuler 10X dan objektif
100X.
• Carilah basil tahan asaam (BTA) yang berwarna merah dengan latar belakang biru.
• Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara menggeserkan sediaan dari kiri ke
kanan atau dari kanan ke kiripada garis lurus.
• Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD sebagai berikut :
1. Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif
2. Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah kuman yang ditemukan.
3. Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+)
4. Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+)
5. Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+)
 Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorbsiatnupun
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme karena zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroorganisme dengan lingkungannya ditingkatkan.

Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang bayak digunakan dalam

laboratorium mikrobiologi guna pencirian don identifiknsi bakteri. Pewarnaan gram memilahkan
bakteri menjadi kelompok Gram positif dam Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna ungu
karena bnkteri tersebut mengiknt kompleks zat warna kristal ungu-iodium, sednngkan bakteri
Gram negntif berwnrna merah karena mengikat zat warna sekunder yang berwarna merah.
Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding sel bakteri don
perbedaan kandungan asam ribonukleat antnara bakteri Gram positif don Gram negatif.

Pewarnaan dengan zat warna yang mengandung yodium menyebabkan amilopektin

berwarna biru atau keunguan, sedangkan glikogen berwarna merah kecoklatan atau merah
keunguan. Dengan melakukan pewarnaan sangat memungkinkan kita untuk melihat bakteri
dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan morfologi
yang soma.

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokos, dan spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplokokus, sampai sthapylococcus
(bentukknya mirip buah anggur). Khusus pada spiral hanya di bagi dua yaitu setengah
melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan
gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram
negative ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (textbook,
2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat di
identifikasi dengan mudah, selain itu, ada endospora adalah organism yang dibentuk dalam
kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut
dilingkungan sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).

Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan
identifikasi data apakah gram positif atau gram negative sehingga diperlukan adanya praktikum
ini dilakukan agar mengetahui jalanya mekanisme pewarnaan gram. Pewarnaan Gram atau
metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan
untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai
larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan
pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938)
yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan
bakteri Klebsiella pneumonia. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan
menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif
(berwarna merah).

Perbedaan dua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat)
warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak
mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir
pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol
dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena
itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding
sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua
genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya
sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang
umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti
pewarnaan sederhana atau Gram.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram
positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri
gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

Menurut Pelzar et al (2005), macam-macam pewarnaan antara lain pewarnaan sederhana

yaitu dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis yang sudah di
fiksasi. Pewarnaan differentsial yaitu prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara
sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba dari pewarnaan gram adalah teknik pewarnaan
differensial digunakan untuk bakteri.

Menurut Pratiwi (2009), stain merupakan gram-gram yang tersusun atas ion positif dan
negative, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor (chromofor). Pewarnaan pada
dasarnya adalah prosdur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat
menonjolkan strktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Bakteri gram positif
akan mempertahankan zat warna krisktal violet dan karenanya akan tampak bewarna ungu tua
dibawah mikroskop. Adapun bakteri gram negates akan kehilangan zat Kristal violet setelah
dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat warna air
tochsin atau safranin akan tampak merah. Perbedaan warna ini disebabkan olh perbedaan
struktur kimiawi dinding selnya.(wapedia,2010)

Adakala suatu perlu diwarnai dua kali setelah zat warna yang pertama (ungu) terserap,
maka sediaan dicuci dengan alkohol, kemudian ditumpangi dngan zat warna yang berlainan,
yaitu dngan zat warna merah. Jika sediaan itu kemudian kita cuci dengan air lau dengan alkohol
maka dua kemungkinan dapat terjadi. Pertama, zat tambahan terhapus, sehingga yang tampak
ialah zat warna asli (ungu). Dalam hal ini sediaan (bakteri) kita sebut gram positif. Kedua zat
warna tambahan (merah) bertahan hingga zat warna asli tidak tampak. Dalam hal ini sediaan
(bakteri) jika kita katakana gram negatif (Dwioseputro, 1984)

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada
muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO.
Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian
sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagianbagian inti sel.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif
menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

1. Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
2. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk
melunturkan zat warna utama.
3. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang
telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok, salah satu di
antaranya, bakteri gram positif yang mempertahankan zat warna ungu Kristal dan karenanya
tampak ungu tua. Kelompok yang lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu Kristal ketika
dicucci dengan alkohol dan waktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah safranin,
tampak bewarna merah (Zubaidah,2006).

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan
Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna
untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka.

Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada
struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian
alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga
memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.
Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram
positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Stuktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu :

1. Struktur dasar (dimiliki hamper semua jenis bakteri )

Meliputi : dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribasom, DNA, dan granula
penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola gas dan endospora
Sthaplyococcus adalah bakteri gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang
berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua
jenis warna staphlycoccus yaitu : sthapylococcus aureus yang berwarna kuning dan
sthapylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karateristik yang dimiliki sthapylococcus
aureus diantaranya hemolytic pada darah segar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat
tumbuh paa suhu erkisar antara 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl padakonsentrasi
tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selin itu, biasanya s. aeureus
merupakan pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru,
radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan
endocarditis) serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins
menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepaskan super antigens ke dalam aliran
darah (kenneath, 2008)

Menurut kenneath (2008), Escherichia coli termasuk dalam family Enterobacteraceae

yang termasuk gram negative dan berbentuk batangyang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah
besar di dalam usus manusia, yaitu membatu sistem pencernaan manusia dan
melindunginya darbakteri pantogen, akn tetap pada strain baru dari e. coli merupakan pathogen
berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (
hus). Peranan yanag menguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indicator
pada percemaraan air serta mendeteksi patoge pada feses manusia yang disebabkan oleh
salmonella typi.( mikrolibrary, 2008). Endospora adalah organism yang dibentuk dalam kondisi
yang stress dan kurang nutrisi, yang memiliki kemunginan untuk tetap berlanjut dilingkungan
sampai kondisi menjadi baik (ncbi, 2008).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu
determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
- lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung
asam tekoat.
- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
- Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
- Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
- Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
- Peka terhadap streptomisin
- Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

- Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai
lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam
tekoat.

- Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

- Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
- Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
- Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
- Tidak peka terhadap streptomisin
- Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri.
Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan
mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara
yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies ini, disebut endospora. Endospora dapat
bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-
bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini
menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup,
pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk
dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan
spesies-spesies bakteri yang membentuknya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan
dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan
asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies.

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana,
pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-
jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel
microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural
hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam
pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.

Macam-macam pewarnaan:

1. Pewarnaan negatif
- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang

- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta

Cara pewarnaan negatif

- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat dimikroskop

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam
gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang
keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan sedehana

- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)

- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri
(kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai
sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-
pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

3. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam, dan penggunaan
pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah.

4. Pewarnaan structural/khusus

- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll

i) Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan
menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam
tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

ii) Pewarnaan spora

Dinding spora relative tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.

iii) Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk
presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

iv) Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA.

5. Pewarnaan diferensial

- menggunakan lebih dari satu macam zat warna

- Tujuan untuk membedakan antar bakteri

- Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan Asam

Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan
bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan
sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme
dengan sekitarnya.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram
negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh
komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak
mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui
memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut
relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode
pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME

A. PENDAHULUAN
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu
teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan
senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik
pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa
Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang
bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut
pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-
lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding
sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru,
kristal violet, safranin dan lain-lain.
Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut
pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik
bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang
menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri
misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam.
Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta
mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari
bakteri yang diwarnai.
mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang
tipis.
Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.
Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu
diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25
cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti
dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum
inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering
diudara.• Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat,
dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek
dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
B. DASAR TEORI
-pewarnaan gram
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok
berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini
berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa
pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci
warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel,
bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila
komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah
warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada
hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak
berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna.
Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud
dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah
dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila
diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks
bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar
belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna
(Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur
internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun
flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion
positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang
ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan
bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat
warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya
ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang
berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada
zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa
lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh
zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll.
Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk
pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah
(Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen
(pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan
yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah
pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan
dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi
kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif
ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral.
Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas
object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika
suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop.
Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak
struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan
pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya,
sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk
sel bakteri (Anonim, 2008):

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi.
Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak
sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan
membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara
dua lapis membran sel (Irawan, 2008).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine
lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization
sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam
penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga
sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24
jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada
gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu
dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat
gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri
yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel
vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia
seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah
membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008).
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai
bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit
dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan
teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan,
2008):
E. CARA KERJA
1. Sediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api bunsen
2. teteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut
3. secara aseptik ambilah inokulum bakteri yang akan diperksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu,
kemudian ratakan perlahan-lahan
4. ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering
5. fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat
6. letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan larutan
kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik
7. cuci warna dasar dengan air mengalir, keringkan
8. teteskan larutan iodin pada apusan, biarkan selama 30-60 detik
9. cuci larutan iodin dengan air mengalir, keringkan
10. rendam atau basuh dengan alkohol ... % selama ... detik
11. teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik
12. cuci dengan air mengalir, lalu keringkan
13. amati dengan mikroskop
14. gambar bentuk morfologi

DAFTAR PUSTAKA

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.

Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. htp://wordbiology.wordpress.com. Diakses pada hari Senin,
13 April 2008 pada pukul 19.00 WITA.
Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.
Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Teknik Pengecatan atau Pewarnaan Bakteri

Semua jenis mikroorganisme mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu
pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana
sel-sel bakteri tersebut disuspensikan (Sutedjo, 1991). Pengecatan dan pewarnaan merupakan
salah satu cara untuk mengamati sel-sel bakteri. Untuk membedakan berbagai macam tipe
morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat digunakan pewarna sederhana.
Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan
satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Sedangkan zat-zat warna
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu
fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
Preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua
zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-
bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu
spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Sejumlah besar koloni bakteri dan fungi menarik perhatian oleh warnanya yang mencolok,
disebabkan karena terjadi eksresi zat warna ke dalam medium atau fermentasi sel. Kemampuan
membentuk zat warna terfiksasi secara genetik, dan demikian merupakan penanda khusus.
Bentuk-bentuk pewarna mudah dikenal dan ditentukan identitasnya, zat warna dapat merupakan
derivat dari berbagai kelas; karotenoid zat warna fenazin, zat warna pirol, azakuinon dan
antosian (Hans, 1994).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam
terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna
untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna
berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat
dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Warna terletak pada muatan positif dari zat
warna, maka disebut zat warna basa. Warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna
asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Anionnya
pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO-. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh
faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan
zat warna penutup (Sutedjo, 1991).

Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada
muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO-.
Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian
sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel.
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri
tersebut disuspensikan, oleh sebab itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan
tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti. Pewarnaan akan
menyebabkan bakteri-bakteri tersebut kontras berwarna dengan sekelilingnya, sehingga akan
terlihat jelas. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas bentuk dan ukuran bakteri, melihat struktur luar dan dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, serta menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas dari
bakteri. Bakteri memiliki beberapa bentuk tubuh. Bentuk-bentuk tubuh dari bakteri yaitu:

1. Bentuk bola atau Cocci (tunggal = coccus)

2. Bentuk batang atau bacilli (tunggal = bacillus)

3. Bentuk spiral atau sprilli (tunggal = sprilum)

4. Bentuk koma atau vibrios (tunggal = vibrio) (Volk & Wheeler, 1993).

Sel–sel bakteri mempunyai muatan yang agak negatif bila pH lingkungannya mendekati netral.
Muatan negatif dari sel bakteri akan bergabung dengan muatan positif dari ion zat warna
 misalnya methylen blue, sehingga selnya akan berwarna. Perbedaan muatan inilah yang
menyebabkan adanya ikatan atau gabungan antara zat warna dan sel bakteri (Frobisher et all,
1974).

Satu sifat penting dari bakteri dalam hubungannya dengan mikrobiologi adalah kemampuan
beberapa jenis bakeri untuk memproduksi struktur internal yaitu endospora. Endospora ini
umumnya terbentuk secara tunggal dalam sel guna menanggulangi keadaan lingkungan yang
kurang baik. Spora yang sudah masak dilepas oleh alam ke lingkungan sekitarnya. Spora-spora
ini dapat dilihat di bawah mikroskop fase kontras dan nampak sebagai bagian yang bercahaya
terang baik di dalam atau di luar sel. Spora-spora ini tahan terhadap keadaan fisik atau kimiawi
yang ekstrim seperti suhu, kekeringan dan bahan-bahan kimia pembasmi kuman dan dapat
bertahan dalam keadaan tidur untuk beberapa tahun. Pada saat kondisi pertumbuhan
memungkinkan, spora-spora tersebut tumbuh menjadi sel-sel vegetatif normal (Buckle, 1987).

Sumber:
http://bocahpharmacy.multiply.com/journal/item/92/Bakteri_dan_Pengecatannya

Pewarnaan Gram ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli

histologik Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan Gram, bakteri-bakteri
dapat dibagi atas 2 golongan yaitu Gram positif dan Gram negatif. Gram
positif warnanya violet (ungu) karena mengikat zat warna utama “kristal
violet”. Sedangkan Gram negatif berwarna merah jambu karena melepaskan
zat warna utama dan menangkap zat warna penutup ”fuchsin”. Prinsip atau
pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu :
1. Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet yang warnanya
violet).
2. Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan
lugol (J-KJ).
3. Menambahkan zat decolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau
alkohol-asam.
4. Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya : larutan fuchsin, safranin,
dll.

Pulasan menurut Gram mempunyai banyak modifikasi, sebaiknya

pakailah salah satu cara saja diantara yang banyak. Kesalahan biasanya
 terdapat pada ”overstaining” dan ”overdecolozing”, yaitu terlalu lama
memberikan zat-zat warna atau pancucian dengan alkohol. Akibatnya Gram-
positif dapat menjadi Gram negatif. Teknik mewarnai hendaknya dikontrol
juga dengan melakukan pemulasan terhadap bakteri yang telah diketahui
Gramnya. Larutan-larutan zat warna yang digunakan senantiasa diperiksa,
apakah sudah terdapat kristal-kristal atau kotoran-kotoran lainnya.
Gunakanlah selalu larutan-larutan zat warna yang disaring dengan kertas
saring.
Perlu kita ketahui bahwa perbedaan sifat antara kedua golongan
bakteri tadi, tidaklah absolut tegas dan spesifik, melainkan tergantung juga
pada beberapa faktor, antara lain:
a) Bakteri-bakteri Gram positif sering kali tidak dapat menyerap dan mengikat
zat warna kristal violet, terutama apabila dibuat preparat dari bakteri-bakteri
biakan murni yang telah tua (rough).
b) Ada bakteri-bakteri tertentu yang sangat peka terhadap cara-cara yang
mengalami sedikit perubahan.
c) Selain daripada itu ada juga bakteri-bakteri yang bersifat ”gram variable”,
dll.
Gentian violet dapat diganti dengan crystalviolet atau methylviolet, jika
gentian violet tidak ada.

· Larutan Standard Gentian Violet.

Bubuk (kristal) gentian violet : 5 gram.
Alkohol 95-96% : 95 ml.
· Larutan Pakai.
Larutan standard gentian violet : 10 ml.
Karbol (phenol) 5% : 90 ml.
· Larutan Standard Fuchsin.
Bubuk (kristal) fuchsin : 5 gram.
Alkohol 95-96% : 95 ml.
· Larutan Pakai.
Larutan standard fuchsin : 10 ml.
Aquadest : 90 ml.
Bubuk digerus dalam mortir dengan alkohol sedikit demi sedikit, setelah
larut masukkan ke dalam botol (untuk gentian violet harus botol yang
cokelat atau sawo matang). Genapkan volume alkohol sampai volume yang
diperlukan. Biarkan 24 jam baru dapat dipakai. Jika hendak dipakai larutan
stam ini harus diencerkan dahulu 10x dan disaring. Filtrat ini dipakai untuk
pewarnaan.

· Larutan Lugol (J-KJ).

Jodium kristal : 1 gram
Kalium jodida (KJ) : 2 gram
Aquadest : 300 ml.
 Mula-mula Jodium + KJ dalam kira-kira 10 ml aquadest. Sesudah jodium
larut, genapkan volumenya menjadi 300 ml. Larutan lugol ini disimpan
dalam botol yang sawo matang. Dapat juga kita sediakan larutan lugol
dalam 5x atau 10x kuat. Pada waktu pemakaian encerkan dengan aquadest.
Bila perlu disaring. Larutan lugol yang dibuat seperti di atas, langsung
dipakai tanpa ditipiskan lagi.

A. Cara pewarnaan Gram :

1. Buat sediaan pada objek gelas, keringkan, kemudian rekatkan (fiksasi)
3x di atas api Bunsen.
2. Tuangi dengan larutan karbol-gentian-violet (sesudah sediaan dingin),
biarkan selama 5 menit.

3. Zat warna dibuang dan bubuhi dengan larutan mordant (lugol),

diamkan selama kira-kira 1-3 menit.

4. Lugol dibuang dan preparat dicelupkan ke dalam alkohol 96%, sampai

warna gentian violet lepas (sampai gentian violet tidak ada luntur
lagi).

5. Cuci dengan air kran sampai bersih, kemudian bubuhi dengan cat-
penutup (counter stain) larutan water-fuchsin, biarkan kira-kira 1-2
menit.

6. Cuci dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar, lihat

dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak. Gram positif =
ungu. Gram negatif = merah.

B. VARIASI PEWARNAAN GRAM yang digunakan di Bagian Pathologi Klinik

Fakultas Kedokteran dan Rumah Sakit Dr. Cipto Mangunkusumo di Jakarta.
Larutan-larutan zat warna :
1. Carbol Gentian Violet.

Gentian violet 1 gram; Phenol kristal 2 gram; Alkohol 95 % 10 ml dan

aquadest ad. 100 ml. Gentian violet digerus dengan alkohol dalam mortir
tambahkan phenol dan campur. Kemudian tambah air sedikit demi sedikit
dengan mengaduk terus, biarkan 24 jam kemudian disaring.
2. Larutan Lugol (J-KJ)

Jodium 1 gram, KJ 2 gram dan aquadest 300 ml. Geruslah Jodium bersama
KJ hingga homogen, tambah air sedikit demi sedikit, biarkan 24 jam. Saring
dan disimpan dalam botol yang cokelat. Larutan ini gunanya sebagai
mordant.
3. Larutan safranin (counter stain).
 Safranin 1 gram, alkohol 95% sebanyak 4 ml dan aquadest 360 ml.
Geruslah safranin dengan alkohol, tuangkan ke dalam botol, mortir berkali-
kali dicuci dengan air, biarkan 24 jam. Saring dan siap untuk digunakan.

Cara pewarnaan :
~ Buat sediaan pada objek gelas, rekatkan di atas api Bunsen 3x, tunggu
sampai dingin.
~ Pulas dengan karbol gentian violet selama 60 detik.
~ Cuci dengan aquadest, bubuhi lugol selama 30 detik.
~ Cuci dengan aquadest, buang zat warna dengan alkohol (decolorisasi)
sampai tidak ada lagi warna yang dilepaskan dari sediaan. Boleh juga dicuci
lagi dengan aquadest.
~ Pulas dengan larutan safranin (counter stain) kira-kira 30 detik.
~ Cuci dengan aquadest, biarkan kering dalam temperatur kamar dan periksa
dengan mikroskop memakai lensa rendam minyak.
Hasil pewarnaan Gram :
Bakteri Gram positif : Biru-ungu (ungu kebiru-biruan).
Bakteri Gram negatif : Merah kekuning-kuningan.

C. Pewarnaan Gram modifikasi BURKE.

(Burke’s modifikation : J. Bact. 7: 159, 1922).
1. Sediaan sesudah difiksasi 3x di atas api, dituangi dengan larutan 1%
gentian violet (crystal violet) dalam alkohol, kemudian segera ditambah
dengan larutan Natrium-Bikarbonat 5%, biarkan selama kira-kira 1 menit.
2. Cuci degan air, bubuhi dengan larutan mordant yaitu larutan lugol ( 1 gram J
+ 2 gram KJ + 200 ml aquadest), biarkan selama 1 menit.
3. Segera dicuci dengan air. Bubuhi larutan decolorisasi tetes demi tetes
(bahan peluntur) yang terdiri dari : 1 bagian ether + 3 bagian aceton,
sampai zat warna utama terlepas atau bahan peluntur tidak berwarna lagi.
4. Bersihkan dengan air, kemudian bubuhi dengan larutan counter stain (cat
penutup) safranin 0,5 % beberapa detik lamanya.
5. Bersihkan dengan air, keringkan pada temperatur kamar, lihat dengan
mikroskop memakai lensa rendam minyak.
Gram positif : biru-ungu.
Gram negatif : merah kekuning-kuningan.

Catatan :
Sebagai counter-stain dapat juga digunakan karbol fuchsin encer, yaitu
Karbol Fuchsin Z. Neelsen 1 ml + 9 ml aquadest (pengenceran 10x). Jika
karbol fuchsin ini dipakai waktunya dipersingkat, paling lama 1 menit. Karbol
fuchsin encer ini sering digunakan untuk memulas vibrio, waktunya kira-kira
5-10 detik. Vibrio berwarna merah jambu dan bentuk koma. Susunan
pulasan karbol fuchsin lihat pada pewarnaan tahan asam.
BTA

Beberapa mikroba tertentu tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana

ataupun Gram, misalnya golongan Mycobacterium, Retinomycites, dll. Hal ini
disebabkan sel-sel mikroba diliputi oleh semacam lilin (lipid) dan asam
mycolat, sehingga tubuhnya sukar ditembus oleh zat-zat warna. Tetapi dia
dapat diwarnai dengan karbolfuchsin panas (sambil dipanasi), ternyata zat
warna ini dapat meresap dan diikat oleh tubuh bakteri tersebut.
Keistimewaan dari kuman tahan asam ini, zat warna yang telah diikat itu
sukar dilepaskan walaupun dilakukan dengan pencucian dengan alkohol-
asam, misalnya asam sulfat dan asam chlorida. Oleh karena kuman-kuman
seperti itu tahan terhadap pencucian asam-asam mineral, maka disebut
kuman tahan asam. Kuman-kuman yang tahan asam ialah:
1. Mycobacterium tuberculose ( bakteri tbc).
2. Mycrobacterium leprae (basil Hansen).

3. Golongan saprophyt (apathogen).

4. Bakteri S*#@?!. S*#@?! Walaupun tahan asam tetapi zat warna yang
diikat luntur oleh pencucian decolorisasi (alkohol-asam).

I. Cara ZIEHL NEELSEN.

Larutan-larutan yang diperlukan :
A. Carbol-fuchsin : Basic fuchsin : 1 gram.
Alkohol 95% : 10 ml.
Phenol 5% dlm air :100 ml.
Mula-mula fuchsin dilarutkan dalam alkohol (gerus dalam mortir), kemudian
tambah phenol, biarkan 24 jam, saring.
B. Alkohol-asam, yaitu 3-5 ml asam chlorida pekat dalam alkohol 95% sampai
100 ml.
C. Methylen biru biasa, sebagai counter stain.
Methylen biru : 1 gram.
Aquadest : 100 ml.
Dapat juga digunakan methylen biru menurut Loffler.
Caranya :
1. Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian disiram dengan carbol-
fuchsin.
2. Panasilah sediaan itu dengan hati-hati sampai kelihatan uap tetapi jangan
sampai mendidih, biarkan menguap kira-kira 3-5 menit.
3. Cuci dengan aquadest kemudian warna carbol-fuchsin dibuang dengan
decolorisasi HCl-alkohol.
4. Pencucian selesai bila air cucian tidak berwarna merah lagi, cuci lagi dengan
aquadest.
5. Warnai dengan counter stain methylen biru, biarkan kira-kira 2-3 menit.
(Loffler m. blue 20-30 det).
6. Cuci dengan air, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop.
Hasil pewarnaan:
Bakteri tahan asam : merah.
Tidak tahan asam : biru.

II. Cara KINYOUN. (Am. J. Pub. Health th 5: 867, 1915).

A. Larutan Carbol-fuchsin menurut Kinyoun : Basic fuchsin 4 gram, alkohol
95% 20 ml, phenol 8 gram, dan aquadest 100 ml. Fuchsin digerus dalam
mortir dengan alkohol sampai larut. Cucilah berkali-kali mortir itu dengan air
dan pindahkan ke dalam botol. Panasilah phenol di atas penangas air 56°C
sampai mencair dan tambahkanlah phenol itu ke larutan tadi. Biarkan 24
jam, kemudian disaring dan siap untuk dipakai.
B. Decolorisasi : HCl 3-5% atau Asam-sulfat 5%.
C. Counter stain : Methylen biru 1% dalam air.
Caranya :
1. Buat sediaan, keringkan di atas api, kemudian fiksasi di atas api.
2. Tuangi dengan larutan Kinyoun, biarkan 3-5 menit.
3. Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit.
4. Tetesi dengan asam-sulfat 5%, biarkan : ½ menit.
5. Bubuhi dengan alkohol 70%, biarkan : ½ menit.
6. Cuci dengan air kran mengalir pelan-pelan : ½ menit.
7. Warnai dengan methylen biru, biarkan : 1 menit.
8. Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.
Cara Kinyoun tidak perlu dipanasi.
9. Hasil pewarnaan:
Bakteri tahan asam : merah.
Tidak tahan asam : biru.

III. Cara GOBBET.

1. Buat preparat, keringkan dan fiksasi di atas api, kemudian tuangi dengan
basic-fuchsin yang terdiri dari : basic fuchsin 0,9 gram, alkohol 95% 10 ml,
phenol 5% 90ml, panasi sampai keluar uap dan biarkan selama 3-5 menit.
2. Bersihkan dengan air kran mengalir pelan-pelan ½ menit.
3. Celupkan ke dalam larutan Gobbet selama 1 menit. Larutan Gobbet terdiri
dari : Methylen biru 1 gram, asam-sulfat 96% 20 ml, alkohol absolut 30 ml
dan aquadest 50 ml.
4. Bilasi dengan air kran, keringkan di udara dan dilihat dengan mikroskop.
5. Hasil pewarnaan:
Bakteri tahan asam : merah.
Tidak tahan asam : biru.

IV. Cara TAN THIAM HOK.

 Cara ini merupakan kombinasi dari Kinyoun dan Gabbet.
1. Sediaan sesudah difiksasi di atas api, celupkan ke dalam larutan Kinyoun
selama 3 menit.
2. Cuci dengan air kran selama ½ menit.
3. Celupkan lagi dalam larutan Gabbet selama 1 menit.
4. Bilasi dengan air kran, keringkan dalam temperatur kamar dan dilihat
dengan mikroskop.
5. Hasil pewarnaan:
Basil tahan asam : merah.
Tidak tahan asam : biru muda.
Kirimkan Ini lewat Email BlogThis! Berbagi ke Twitter Berbagi ke Facebook

pewarnaan gram

1.1 Pengertian dan Tujuan Pewarnaan

Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan
untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan
untuk :
1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar.
2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa.
(Pelczar dan Chan, 1986).

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari
pewarnaan tersebut ialah untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang
ada akan dapat diketahui.
(Suriawiria, 1995)

Pewarna (stain) merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positif dan negatif,
yang salah satunya berwarna dan disebut kromosfor (chromosphore). Bila kromosfor berada
 pada ion positif disebut pewarna basa (basic dye) dan bila kromosfor berada pada ion negatif
disebut sebagai pewarna asam (acidic dye) (Pratiwi, 2008).

1.2 Macam dan Fungsi Pewarnaan

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain),
pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain). Pada
pewarnaan sedarhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh
sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terlihat (Pratiwi, 2008).

Menurut Zubaidah (2006), yaitu banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna)
digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah
dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk :
1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar
2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme
3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa.

Macam-macam pewarnaan adalah :

1. Pewarnaan sederhana : pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah
difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.
2. Pewarnaan diferensial : prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel
mikroba disebut pewarnaan diferensial.
3. Pewarnaan gram : salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas
digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini
dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram
negatif (Pelczar dan Chan, 1986).

1.3 Perbedaan Gram Positif dan Negatif, beserta contohnya

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metil ungu pada
metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Bakteri gram positif adalah bakteri
yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini
akan berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan
berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini
terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel (Annisa, 2010).
 Perbedaan warna antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif disebabkan oleh
adanya perbedaan struktur dan dinding selnya. Dinding bakteri gran positif banyak
mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram negatif banyak mengandung
lipopolisakarida (Pratiwi, 2008).

Menurut Pelczar dan Chan (1986), perbedaan bakteri gram positif dan gram nehatif
adalah :

Gram Positif Gram Negatif

Ungu kristal Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu

Kompleks UK-Y Kompleks UK-Y

Larutan Iodium terbentuk di dalam sel, terbentuk di dalam sel,
sel tetap berwarna ungu sel tetap berwarna ungu

Dinding sel mengalami

dehidrasi, pori-pori Lipid terekstrasi dari
menciut, daya rembes dinding sel, pori-pori
Alkohol dinding sel dan membran mengembang, kompleks
menurun, UK-Y tak dapat UK-Y keluar dari sel, sel
keluar dari sel, sel tetap menjadi tak berwarna
ungu

Sel menyerap zat

Sel tak terpengaruhi,
Safranin pewarna ini, menjadi
tetap ungu
merah

1.4 Mekanisme Penyerapan Zat Warna oleh Gram Positif dan Gram Negatif

Reaksi gram dapat dikonfirmasi dengan uji kelarutan kalium hidroksida (kori). Ambillah
satu OSE penuh kultur bakteri yang sedang tumbuh aktif dan campur dengan setetes larutan
KOH 3% di atas kaca objek yang bersih dan aduk hingga diperoleh suspensi yang rata. Angkat
OSE beberapa centimeter dari kaca objek. Jika benang lendir bakteri itu terangkat oleh
OSE(kira-kira 5-20 mm panjangnya), maka bakteri itu adalah gram negatif. Jika dihasilkan
suspensi berair dan tidak tampak adanya benang lendir setelah OSE digerakkan berulang-
ulang maka kultur bakteri itu adalah gram positif. Perusakan dinding sel organisme gram negatif
yang diikuti dengan pembebasan DNA, yang sangat kental di dalam air, menghasilkan benang
lendir. Dinding sel bakteri gram positif lebih tahan terhadap KOH dan tetap melekat sehingga
tidak ada DNA yang dibebaskan (Soekirno, 2008).

Pada pewarnaan gram ini, bakteri yang telah di fiksasi dengan panas sehingga
membentuk pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna
ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer (primary stain).
Selanjutnya mordant (penajam). Setelah iodin dicuci dengan baik, bakteri gram positif maupun
gram negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang
merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri twertentu
dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai
kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap
berwarna ungu digolongkan ke dalam gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah
digolongkan ke dalam gram negatif (Pratiwi, 2008).

Mikroorganisme gram positif adalah mikroorganisme yang berwarna violet dimanan

warna tersebut tidak hilang jika mikroorganisme disiram dengan aseton atau alkohol.
Sedangkan mikroorganisme gram negatif adalah mikroorganisme yang akan kehilangan warna
violetnya jika mikroorganisme tersebut disiram dengan aseton atau alkohol dan kemudian akan
berwarna merah muda dengan carbol fuchsin atau merah netral (Gibson, 1996).

Posted 4th August 2012 by Gamma Sugara

PEWARNAAN GARM

1.

Aug

4
 pewarnaan gram

1.1 Pengertian dan Tujuan Pewarnaan

Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas
digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Telah dikembangkan prosedur-prosedur
pewarnaan untuk :
1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar.
2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa.
(Pelczar dan Chan, 1986).

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara

langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan
murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia
yang ada akan dapat diketahui.
(Suriawiria, 1995)

Pewarna (stain) merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positif dan
negatif, yang salah satunya berwarna dan disebut kromosfor (chromosphore). Bila
kromosfor berada pada ion positif disebut pewarna basa (basic dye) dan bila kromosfor
berada pada ion negatif disebut sebagai pewarna asam (acidic dye) (Pratiwi, 2008).

Dengan pewarnaan biasa atau Gram spora bakteri tidak dapat dilihat. Prinsip
pewarnaan spora ialah warna sporanya harus berbeda dengan warna
bakteri.
I. Cara KLEIN.
Larutan warna yang diperlukan ialah:
· Carbolfuchsin Ziehl Neelsen.
. Methylen biru 1%.
· Asam sulfat 1%.
 1. Satu ml suspensi bakteri yang umurnya 24 jam dalam bouillon atau
suspensi kuman yang dibikin dari tanaman pada agar-miring yang telah
berumur 48 jam, dicampur dengan carbolfuchsin yang sama banyaknya di
dalam tabung reaksi.
2. Campuran ini dimasak (direndam) pada penangas air 80°C kira-kira 10
menit, gunanya untuk membunuh bakteri-bakteri yang tidak membentuk
spora.
3. Satu ose dari campuran dibuat sediaan pada satu objek gelas yang bersih
dan bebas dari lemak, keringkan dan fiksasi 3x di atas api Bunsen.
4. Celupkan dalam asam-sulfat 1% selama 1-2 detik.
5. Cuci dengan air kran dan akhirnya diwarnai dengan methylen biru, kira-
kira selama 2-3 menit.
6. Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop.
Hasil pewarnaan:
Spora : berwarna merah.
Bakteri : berwarna biru.

II. Cara MULLER

Asam chromat 5%.
· Carbol fuchsin Z. Neelsen.
· Asam asetat 5%.
· Methylen biru 1% dan
· Chloroform.
1. Buat sediaan dari biakan kuman yang umurnya 2 hari dalam bouillon
(dari agar miring), sesudah dilidah apikan (rekatkan) 3x, tetesi dengan
chloroform selama 2 detik.
2. Cuci dengan air, tetesi dengan asam chromat selama 2 detik.
3. Cuci dengan air kran, bubuhi dengan carbol-fuchsin, uapkan (jangan
mendidih) biarkan menguap selama 5 menit.
4. Cuci dengan asam asetat 5%, kemudian dengan air.
5. Bubuhi dengan methylen biru 1% kira-kira 2 detik.
6. Methylen biru dibuang dan keringkan dengan kertas saring, periksa
dengan mikroskop.
Hasil pewarnaan:
Spora : berwarna merah.
Bakteri : berwarna biru.

III. Cara FLEMING.

1. Buat sediaan keringkan, kemudian fiksasi 3x di atas api Bunsen.
2. Warnai dengan carbol-fuchsin Z. Neelsen, panaskan sampai menguap
dan biarkan menguap selama 5 menit.
3. Cuci dengan air kran sampai warna fuchsin tidak luntur lagi, bubuhi
Natrium-sulfit 5% selama 20-30 detik.
 4. Cuci dengan air, tetesi dengan larutan methylen biru 1% (dengan larutan
Nigrosin 10%), kemudian apuskan di atas objek gelas.
5. Keringkan pada temperatur kamar dan lihat dengan mikroskop.
Hasil pewarnaan:
Spora : berwarna merah.
Bakteri : berwarna biru.

IV. Cara SCHAEFFER DAN FULTON.

(Science 77, 194, 1933).
Larutan-larutan yang diperlukan:
· Larutan Malachiet hijau 5% dalam aquadest. (sesudah dibuat biarkan
dahulu ½ jam, kemudian disaring, baru dapat dipakai).
· Larutan Safranin 0,5% dalam aquadest.
Caranya :
1. Buat sediaan dari suspensi kuman yang akan diperiksa, keringkan,
kemudian fiksasi di atas api 3x.
2. Tetesi dengan larutan Malachiet hijau 5%, uapkan perlahan-lahan, biarkan
menguap 1½ menit.
3. Cuci dengan air kran, kemudian bubuhi dengan larutan Safranin 0,5%
selama 1½ menit.
4. Cuci lagi dengan air, kemudian keringkan dengan kertas saring, periksa
dengan mikroskop.
Hasil pewarnaan:
Spora : berwarna hijau.
Bakteri : merah.

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM

PEWARNAAN SEL (BAKTERI DAN JAMUR) DAN PEWARNAAN ENDOSPORA

1.1 Latar Belakang

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu bakteri yang hidup akan kontras
dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas
dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara
yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini
adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna
merah dan ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan yang positif
berwarna ungu (Levine, 2000).
Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram sangat penting
dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni mikroba dan biakan jamur dapat
dilakukan dengan mudah dan baik. Pewarnaan ini bertujuan untuk memberikan warna pada
bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospora yang bisa
diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang
nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi
baik (Pelczar dan Chan, 2007)

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil, bentuk
tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X
atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies
dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan
makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam
yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan
suatu zat pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk
seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2007).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan
sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau
jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis,
atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang
menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik
pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.
Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada
muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red,
dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO?. Zat
warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma
sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri
dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan
dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga
mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan
gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai
serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang
paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di
antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapat pada ion positif (zat
pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna - Na+).
Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh
adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai,
muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa,
Kristal violet, safranin dan metilin blue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan.
Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai
bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar
belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna (Volk &
Wheeler, 1993).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan Denmark
Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan pewarna
differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan
memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi
pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium,
setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30 detik,
kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1
menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang kompleks.
Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa
bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram
positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah
(safranin) (Umsl, 2008).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan
Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik
bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram
dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua
bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk
kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif
akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus,
Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan
bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan
warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria,
Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok
berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini
berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar,
berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan
pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci
sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan
tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna
pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Larutan yang biasa
dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol dan safranin (Tracy, 2005).
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri
Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan
membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna.
Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini
akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram
positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga
permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya
memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih
besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Aalkohol, Ammonium
oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C
(Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades). Pewarnaan ZN digunakan
untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri tahan asam, conttohnya adalah
Micobacteriom tuberculosis, Micobacterium leprae, Mycobacterium atypical seperti
Mycobacterium avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C
yang menyerang sistem imun, Mycobacterium marinum dan Mycobacterium ulcerans yang
tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit, Nocardia, Legionella mycdatci, Rhodococcus,
Tsukamurella, Gordonia / Gordona, Cryptosporidium, Isospora, Cyclospora, Sarcocytis, dll.
Contoh bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada Kinyoun
adalah Nycordia, Rhodococcus, Tsukamurella, dan Gordonia. Hasil pewarnaan ZN akan
mengidentifikasikan : 1. Bakteri tahan asam Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi
setelah pewarnaan setelah pemberian asam‐ alkohol. Hasilnya berwarna merah. 2. Bakteri tidak
tahan asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan pertama oleh
asam‐alkohol, jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa counter stain. Sifat tahan asam pada
bakteri tahan asam disebabkan karena dinding selnya terdiri atas peptidoglikan, arabinogalaktan,
dan lipid (50%‐nya tersusun atas asam mikolat). Asam mikolat merupakan asam lemak ranai
panjang yang terdiri atas 34‐90 karbon. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN‐A (merah) (Basic fusion,
Alcohol, Fenol, Aquades), ZN‐B (tidak berwarna) (HCl, Etil alcohol), dan ZN‐C (biru)
(Methylen blue, Aquades) (Madigan, 2003).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam),
pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora,
pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan
Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan negatif
(Gozali, 2009
Gambar 2.1 Pewarnaan Sederhana (Gozali, 2009)
 Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-
bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan
sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina
(Hadiotomo, 1990)
Gambar 2.2 Pewarnaan Negatif (Hadiotomo, 1990)
Gambar 2.3 Pewarnaan Gram (Jason, 2009).
Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Struktur
endospora sangat bervariasi pada setiap spesies. Endospora merupakan struktur yang tahan
terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering, pemanasan dan keadaan asam.
Karena kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka
endospra berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora
sangat sukar diwarnai dengan pewarnaan biasa, sehingga harus menggunakan pewarnaan
spesifik. Bakteri yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap pewarnaan, sedangkan
bakteri yang tidak memiliki spora dan hanya memiliki sel vegetatif tidak tahan terhadap
pewarnaan (Partic, 2008).
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali
diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode
pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam
pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses
pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam
endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan
cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda
pada sel vegetatifnya (Fardiaz, 1992).
Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari degenerasi sel
vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora yang diakibatkan komposisi lapisan
kimia spora bersifat tahan terhadap efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan,
pembekuan, radiasi, pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan
khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal, spora bebas kembali
 untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif berkurang resisten melalui germinasi.
Sporogenesis dan germinasi tidak dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang
menjamin ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005).
Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Karena
kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka
endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.
Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna
spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green.
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian
karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri
telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka
akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan
dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb)
dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).
Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu, setelah diwarnai oleh
suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat kuat senyawa pewarna. Untuk pewarnaan
selanjutnya, cat tersebut (misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah
terikat dengan cat pertama. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. Bakteri yang tidak
berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai
oleh malachite, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena
ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah
mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari
safranin (Assani, 1994).
3.2.1 Pembuatan Apusan
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%, kemudian bakteri
hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di
tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu
kali yang pengambilannya dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering.
Preparat apusan siap diwarnai dan diamati.
3.2.2 Teknik Pewarnaan Gram
Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat
dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah kering, apusan digenangi
dengan cat gram B selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan
selanjutnya dikeringkan. Setelah kering, apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik, cat
dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Setelah kering,
apusan digenangi dengan cat gram D selama 1 menit, sisa cat dibuang lalu preparat dicuci
dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Kemudian preparat siap diamati dibawah
mikroskop
3.2.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%, kemudian bakteri
yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah
terdapat larutan KOH sebanyak satu jarum ose. Kemudian campurkan dengan mengaduknya,
kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir
atau tidak.
3.2.4 Pewarnaan Endospora
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70%, kemudian B.
subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik
aseptis dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali
pengambilan dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering. Selanjutnya
gelas obyek dipanaskan di atas air mendidih dengan menutup preparat dengan kertas saring dan
ditetesi dengan malakit hijau selama 10 menit. Setelah itu dinginkan preparat sebentar,
selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian genangi
preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit, di cuci dengan air mengalir. Preparat
ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop, endospora akan tampak
berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah.

4.1 Analisa Prosedur

4.1.1 Pembuatan Apusan
Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak
terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan, kemudian bakteri hasil
isolasi diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik
aseptis, agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn apusan dan
diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan
dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering, agar bakteri yang akan
digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak (Madigan, 2003).

4.1.2 Teknik Pewarnaan Gram

Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat
dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan, agar pewarna sebelumnya tidak
bercampur dengan pewarna yang lain yang akan digunakan (Umsl, 2008). Setelah kering, apusan
digenangi dengan cat gram B selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air
mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Cat gram B akan menguatkan ikatan antara pewarna
dengan dinding sel bakteri. Setelah kering, apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik,
cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Cat gram C
akan melarutkan warna sebelumnya, apabila preparat bakteri merupakan gram negative, maka
preparat akan berwarna bening. Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram D selama 1
menit, sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan.
Kemudian preparat siap diamati dibawah mikroskop. Bakteri gram negative akan berwarna
kemerahan, sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu.

4.1.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH 3%

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak
terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan, kemudian bakteri yang akan
dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat
larutan KOH sebanyak satu jarum ose, konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri tersebut
gram negatif atau positif. Kemudian campurkan dengan mengaduknya, kemudian jarum ose
diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. Jika cairan
tersebut berlendir maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif dan jika cairan tersebut
tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif (Umsl, 2008).

4.1.4 Pewarnaan Endospora

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol 70% agar tidak
terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat perlakuan, kemudian B. subtilis diambil
menggunakan jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di teknik aseptis dan
diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan
dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering, agar bakteri yang akan
digunakan mati namun organ dan struktur tidak rusak. Selanjutnya apusan bakteri dengan
pewarna malakit hijau, masuknya pewarna dalam endospora di bantu dengan, gelas obyek
dipanaskan dengan diletakkan pada ram kawat di atas air mendidih hingga timbul uap air dengan
menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau agar endospora yang
berkembang dapat terwarna hijau dan agar endospora tidak mati (menjaga agar tetap lembab
(tidak kekeringan)) selama 10 menit, agar endospora dapat berkembang (memudahkan
pengamatan). Setelah itu dinginkan preparat sebentar, selanjutnya preparat di cuci dengan air
mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1
menit, di cuci dengan air mengalir agar endospora dapat terwarna dengan baik. Preparat
ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop, endospora akan tampak
berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak berwarna merah (Scienceprofonline, 2008).

4.3 Data Hasil Pengamatan

Tabel 1. Data hasil pewarnaan bakteri dan endospora
No Isolat kel Bentuk Gram Perbesaran Uji KOH 3% Endospora
B.subtilis
1 BP 1.3 1 Basil - 1000x Ada Ada
2 Basil - 1000x Ada Ada
2 BNP 1.1 3 Basil + 1000x Tidak ada Ada
4 Basil + 1000x Tidak ada Ada
3 BNP 3.2. 5 Basil - 1000x Ada Ada
6 Basil - 1000x Ada Ada
4 BP 8.1 7 Basil - 1000x Ada Ada
8 Basil - 1000x Ada Ada

Tabel 2. Data hasil pewarnaan kapang

No Isolat Kelompok Spora Sporangium Hifa Sporangiofor
1 KNP 6.1 1 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat, Ada
cabang, tidak
rapat
 Ujung :
Tumpul
Jenis : Satu
2 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat, Ada
cabang, tidak
rapat
Ujung :
Tumpul
Jenis : Satu
2 KP 5.3 3 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat, Tidak ada
cabang, tidak
rapat
Ujung :
Tumpul
Jenis : Satu
4 Bentuk : Bulat Tidak ada Tidak bersekat, Tidak ada
cabang, tidak
rapat
Ujung :
Tumpul
Jenis : Satu
3 KP 4.1 5 Bentuk : Tidak ada Bersekat, Tidak ada
Lonjong cabang, rapat
Ujung : Lancip
Jenis : Dua :
Besar dan
Kecil
6 Bentuk : Tidak ada Bersekat, Tidak ada
Lonjong cabang, rapat
Ujung : Lancip
Jenis : Dua :
Besar dan
Kecil
4 KP 5.1. 7 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat, Ada
cabang, tidak
rapat
 Ujung :
Tumpul
Jenis : Satu
8 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat, Ada
cabang, tidak
rapat
Ujung :
Tumpul
Jenis : Satu

4.3 Analisa Hasil

Data hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolate BP 1.3, BNP 3.2 dan BP 8.1 merupakan
bakteri gram negatif dan berbentuk basil jika diamati pada mikroskop dengan perbesaran 1000x.
Preparat BNP 1.1 merupakan bakteri gram positif, namun terdapat bentuk yang berbeda yang
dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam mengamati bentuk bakteri. Pewarnaan endospora
menggunakan bakteri Bacillus subtilis, dimana bakteri ini mempunyai endospora yang ditandai
dengan warna hijau.
Data hasil pengamatan pada pewarnaan kapang menunjukkan bahwa terdapat variasi
bentuk pada kapang tersebut antara lain bentuk spora yang bulat dan lonjong, ujung tumpul dan
lancip, terdiri atas satu macam atau dua macam spora. Ada yang memiliki sporangium dan ada
pula yang tidak mempunyai sporangium. Hifa ada yang bersekat dengan cabang yang tidak rapat,
ada pula hifa yang bersekat dengan cabang rapat. Ada yang memiliki sporangiofor dan ada pula
yang tidak memiliki sporangiofor.
Bakteri dan kapang, baik yang tercemar maupun yang tidak tercemar pestisida akan
mempunyai karakteristik yang sama berdasarkan hasil pewarnaan yang telah dilakukan. Hal ini
menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan morfologi yang berarti antara bakteri dan kapang yang
tercemar maupun yang tidak tercemar.
Pada pewarnaan Gram yang dilakukan digunakan gram A, gram B, gram C, dan gram D.
Gram A merupakan cat yang terdiri dari campuran kristal violet 2 gram, etil alkohol 95% 20 ml,
ammonium oksalat 0,8 gram, aquades 80ml. Kristal violet merupakan bahan kimia dengan rumus
kimia C18H15N3O3, bukan merupakan bahan kimia berbahaya, dan biasa digunakan dalam teknik
pewarnaan microscopy Certistain (Merck, 2007). Gram B merupakan merupakan cat yang
terdiri dari campuran yodium 1 gram, kalium yodida 2 gram, akuades 300ml. Gram B
merupakan larutan mordan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna
 oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat
warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram , penambahan larutan
mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Tanpa
penambahan larutan mordan, zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan
pemucat. Gram C merupakan cat yang terdiri dari campuran aseton 50ml dan etil alkohol
95%50ml. Gram C merupakan larutan pemucat . larutan pemucat berfungsi untuk melarutkan
lipida pada membrane bakteri gram negative yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar
sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet-yodium. Gram D merupakan cat
yang terdiri dari campuran safranin 0, 25 gram , etil alkohol 95% 10ml, dan akuades 90ml.
Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena
persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram
negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena
warna ungu yang dihasilkan oleh kristal violet-yodium telah luntur dengan lisisnya membran sel
sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai
pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994).
Tabel 3. Perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif
(Filzahazny, 2008)
No. Perbedaan Bakteri Gram Positif (+) Bakteri Gram Negarif (-)
1 Dinding sel Lapian peptidoglikan tebal Lapian peptidoglikan lebih
tipis
2 Kadar lipid 1-4% (Lebih rendah) 11-22% (Lebih tinggi)
3 Resistensi terhadap alkali (1% Lebih pekat Larut
KOH)

4 Kepekaan terhadap Yodium Lebih peka Kurang peka

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

5
6 Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka

7 Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam
 8 Kepekaan terhadap penisilin Lebih peka Kurang peka

9 Kepekaan terhadap Tidak peka Peka

streptomisin
10 Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat
11 Ketahanan terhadap fisik Lebih tahan Kurang tahan
12 Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif

Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi,
yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik.
Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang
terdiri dari cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi, lokasi,
dan ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel,
dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya. Letak endospora yang
berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara
terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel vegetatif
yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian letak sel vegetatif diantara
ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah
dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel
vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi
yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan
pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk
reproduksi. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal
(Scienceprofonline, 2008).
Komposisi dari Lactophenol Cotton Blue yaitu kristal, cotton blue 0,075 g berfungsi untuk
memberi warna pada sel kapang, asam laktat 20 ml yang berfungsi untuk menjernihkan latar
belakang dan mempertajam struktur kapang, gliserol 40 ml berfungsi menjaga fisiologi sel dan
menjaga sel terhadap kekeringan, kristal fenol + air panas 70oC untuk membunuh jamur, dan air
suling 40 ml (Waluyo, 2007).
Kelebihan dan kekurangan pengecatan gram (Nirwati, 2001):
Kelebihannya adalah: pengecatan gram penting sebagai pedoman awal untuk
memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur
dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini dikarenakan bakteri gram positif dan negatif
 mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang
morfologi bakteri yang telah dicat gram mempunyai makna dignostik. Misalnya pada
pemeriksaan gram ditemukan gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana),
uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonoro.
Kekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah
banyak yakni lebih dari 104 ml per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme
misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan
mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan
untuk diperiksa secara mikroskopis.

5.1 Kesimpulan
Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan
biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan terhadap bakteri yang paling
sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk
mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat
mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal
violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah
itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna
biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Endospora adalah
organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki
kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Letak endospora
yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi, tipe utama diantaranya
ialah terminal, subterminal dan sentral.

DAFTAR PUSTAKA

Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.

Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. Addison-Wesley Publishing
Company, New York.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta
Filzahazny., 2008, , http:/wordpress.com/Penganta-tentang-bakteri.htm. Diakses pada tanggal 26 April
2010
 Gozali. Amir. 2009. Pewarnaan gram. http://www.gozali.blogspot.com/gram/pewarnaan-gram-
prinsip.html . Diakses pada tanggal 26 April 2010
Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.
Jason. 2009. The Gram Stainning. http://astro.temple.edu/~jasoncg/ID/ microreporting.htm. Diakses
pada tanggal 26 April 2010
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Levine, M. 2000. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology. McMillan Company, New
York.
Madigan, M.T. 2003. Brock Biology of Microorganism. Pearson Education, inc. United State of America.
Merck . 2007. Cresyl Violet Acetate. http://www.merck-chemicals.co.id/cresyl-violet-
acetate/MDA_CHEM105235/p_zyOb.s1LZb0AAAEWZuEfVhTl;sid=2XfBHZapUlXHHd9B9-
vTSj5pCnREAl69HlgSHhO2CnREAkWqXGgJCVGG. diakses pada tanggal 26 April 2010
Nirwati, Hera. 2001. Pembuatan preparat dan pengecatan dalam petunjuk praktikum mikrobiologi
Fakultas kedokteran Universitas Gadjah Mada. Universitas Gadjah Mada press. Yogyakarta.
Partic, Li. 2008. Pewarnaan endospora. http://www.dunia-mikro.blogspot.com/2008/08/pewarnaan
endospora. Diakses pada tanggal 26 April 2010
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New
York.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta.
Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.
Tracy. 2005. Gram Staining. www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram%20stain.pdf. Diakses pada tanggal
26 April 2010
Umsl. 2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf. Diakses pada tanggal 26
April 2010
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga. Jakarta
Waluyo, L . 2007 . Mikrobiologi Umum . Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang.

Pewarnaan Malachite Green

Pewarnaan malachite green adalah pewarnaan yang biasanya digunakan
untuk melihat bakteri batang pembentuk spora.

Untuk membuat larutan malachite green dapat digunakan bahan kimia dari
Malachite Green Oxalate dari Sigma Aldrich atau dari Fisher
Scientific.

Untuk membuatnya , larutkan 5 gram Malachite Green Oxalate dalam 100

ml Aquadest.

Untuk konfirmasi spora, panaskan sample 80 derajat C selama 10 menit. yakinkan

bahwa media sudah mencapai suhu tersebut sebelum inokulasi. Pindahkan dan
dinginkan dalan kotak es. Kemudian inkubasi pada temperatur optimum microbe
selama 5 - 7 hari. Spora akan tumbuh sedangkan bakteria vegetative akan mati.

Selain itu, terdapat beberapa tekhnik yang dapat digunakan untuk manganalisa
bakteri batang pembentuk spora.

( masih bahasa asli, takut salah translatenya )

1. POPPING TEST.

Immerse suspect culture in an acidic oxidizer (e.g. 0.1% KMnO4 in 0.3 N HNO3).
The spore cortex ruptures and the cellular milieu spills out for staining with
basic dyes. Mount a dried film of the suspected spores on as a dried film on a
slide; expose to the reagent for 10 - 20 minutes; observe under oil immersion
without staining or with staining.

2. Negative Staining.

Use 7% (w/v) nigrosin and observe for highly refractile elliptical or

spherical bodies.

3. Dorner Spore Stain.

Heat fix the suspension on a slide and cover with thin filter paper cut to
fit; saturate with carbolfuchsin and steam for 10 min.; remove paper and
decolorize with acid-alcohol for 1 min. and rinse with tap water; blot dry;
place a drop of nigrosin on the smear and cover with another slide; slowly
draw the two apart to form a thin film; cover with a cover slip or dry;
observe. The endospore is red. (This is also called "Flemming's Stain").

4. Alternate Dorner Spore Stain.

In a test tube mix an aqueous suspension of the culture with an equal volume
of carbolfucshin; heat in a boiling water bath for 10 min.; Mix 1 loopful of
7% nigrosin with 1 loopful of the stained suspension on a glass slide; mix and
spread until a thin film forms and dries; examine

eberapa spesies bakteri tertentu dapat membentuk spora. Spora dihasilkan di

dalam tubuh vegetatif bakteri tersebut, dapat berada di bagian tengah (central),
ujung (terminal) ataupun tepian sel. Pelczar (1986), menyatakan bahwa spora
merupakan tubuh bakteri yang secara metabolik mengalami dormansi, dihasilkan
pada faselanjut dalam pertumbuhan sel bakteri yang sama seperti asalnya, yaitu
sel vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap tekanan fisik maupun kimiawi.

Santoso (2010) menyebutkan bahwa ada dua genus bakteri yang dapat
membentuk endospora, yaitu genus Bacillus dan genus
Clostridium.Strukturspora yang terbentuk di dalamtubuh vegetative bakteri
disebut sebagai ‘endospora’ (endo=dalam, spora=spora) yaitu spora yang
terbentuk di dalam tubuh. Secara sederhana, dapat dikatakan bahwa endospora
merupakan sel yang mengalami dehidrasi dengan dinding yang mengalami
penebalan serta memiliki beberapa lapisan tambahan.

Dengan adanya kemampuan untuk membentuk spora ini, bakteri tersebut dapat
bertahan pada kondisi yang ekstrim.Menurut Pelczar (1986) bakteri yang dapat
membentuk endospore ini dapat hidup dan mengalami tahapan-tahapan
pertumbuhan sampai beberapa generasi, dan spora terbentuk melalui sintesis
protoplasma baru di dalam sitoplasma sel vegetatifnya.

Menurut Volk & Wheeler (1988), dalam pengamatan spora bakteri diperlukan
pewarnaan tertentu yang dapat menembus dinding tebal spora. Contoh dari
pewarnaan yang dimaksudkan oleh Volk & Wheeler tersebut adalah dengan
penggunaan larutan hijau malakit 5%, dan untuk memperjelas pengamatan, sel
vegetative juga diwarnai dengan larutan safranin 0,5% sehingga sel vegetative
ini berwarna merah. Dengan demikian ada atau tidaknya spora dapat teramati,
bahkan posisi spora di dalam tubuh sel vegetative juga dapat
diidentifikasi.Namun ada juga zat warna khusus untuk mewarnai spora dan di
dalam proses pewarnaannya melibatkan treatment pemanasan, yaitu; spora
dipanaskan bersamaan dengan zat warna tersebu tsehingga memudahkan zat
warna tersebut untuk meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri.
Beberapa zat warna yang telah disebutkan di atas, dapat mewarnai spora
bakteri, tidak lepas dari sifat kimiawi dinding spora itu sendiri.Semua spora
bakteri mengandung asam dupikolinat.Yang mana subtansi ini tidak dapat
ditemui pada sel vegetatif bakteri, atau dapat dikatakan, senyawa ini khas
dimiliki oleh spora.Dalam proses pewarnaan, sifat senyawa inilah yang kemudian
dimanfaatkan untuk di warnai menggunakan pewarna tertentu, dalam hal ini
larutan hijau malakit. Sedangkan menurut pelczar (1986), selain subtansi di atas,
dalam spora bakteri juga terdapat kompleks Ca2+dan asam dipikolinan
peptidoglikan.

Proses pembentukan spora disebut sprorulasi, pada umumnya proses ini mudah
terjadi saat kondisi medium biakan bakteri telah memburuk, hal ini sesuai
dengan kenyataan bahwa, sampel yang diambil dalam praktikum ini berasal dari
biakan bakteri yang dibuat beberapa minggu yang lalu, sehingga di asumsikan,
nutrisi di dalam medium telah hampir habis, sehingga diharapkan bakteri
melakukan proses sporulasi ini. Haapan ini terbukti benanr dengan kenyataan
bahwa dari kedua sampel yaitu koloni 1 dan koloni 2, keduanya sama-sama
menghasilkan spora.

Namun menurut Dwijoseputro (1979) beberapa bakteri mampu membentuk spora

meskipun tidak dalam keadaan ekstrem ataupun medium yang kurang nutrisi.
Hal ini dimungkinkan karena bakteri tersebut secara genetis, dalam tahapan
pertumbuhan dan perkembangannya memang memiliki satu fase sporulasi. Masih
menurut Dwijoseputro (1979) jka medium selalu diadakan pembaruan dan kondisi
lingkungan disekitar bakteri selalu dijaga kondusif, beberapa jenis bakteri dapat
kehilangan kemampuannya dalam membentuk spora. Hal ini dimungkinkan
karena struktur bakteri yang sangat sederhana dan sifatnya yang sangat mudah
bermutasi, sehingga perlakuan pada lingkungan yang terus menerus dapat
mengakibatkan bakteri mengalami mutasi dan kehilangan kemampuannya dalam
membentuk spora.

Proses pembentukan spora di dalam sel vegetatif bakteri, terjadi dalam

beberapa tahapan, secara singkat bagan proses pembentukan spora bakteri di
atas dapat dijelaskan sebagai berikut:
1. Terjadi kondensasi DNA pada bakteri yang akan membentuk spora
2. Terjadi pembalikan membran sitoplasma, sehingga, lapisan luar membran kini
menjadi lapisan dalam membran (calon) spora.
3. Pembentukan korteks primordial (calon korteks)
4. Pembentukan korteks
5. Spora terlepas dan menjadi spora yang bebas, pada tahap 5 ini,jika spora
mendapatkan lingkungan yang kondusif, maka ia bisa tumbuh menjadi satu sel
bakteri yang baru. (sumber: FMIPA UPI)
Spora bakteri ini dapat bertahan sangat lama, ia dapat hidup bertahun-tahun
bahkan berabad-abad jika berada dalam kondisi lingkungan yang normal.
Kebanyakan sel vegetatif akan mati pada suhu 60-70oC, namun spora tetap
hidup, spora bakteri ini dapat bertahan dalam air mendidih bahkan selama 1 jam
lebih. Selama kondisi lingkungan tidak menguntungkan, spora akan tetap
menjadi spora, sampai kondisi lingkungan dianggap menguntungkan, spora akan
tumbuh menjadi satu sel bakteri yang baru dan berkembangbiak secara normal
(Volk & Wheeler, 1988).

PEWARNAAN ENDOSPORA PADA BAKTERI

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Karena
kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka
endospora berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop.
Endospora sangat sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna
spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green [1].

Dua jenis bakteri yang dapat membentuk spora misalnya Clostridium dan Bacillus. Clostridium
adalah bakteri yang bersifat anaerobic, sedangkan Bacillus pada umumnya bersifat aerobic.
Struktur endospora mungkin bervariasi untuk setiap jenis spesies, tapi umumnya hamper sama.
Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim
misalnya kering, pemanasan, dan keadaan asam [3].

Bakteri pembentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan, sinar, kekeringan, panas, dan
kedinginan. Kebanyakan bakteri pembentuk spora tinggal di tanah, namun spora bakteri dapat
tersebar di mana saja [3].

METODE PENGECATAN ENDOSPORA

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, tetapi sekali diwarnai,
zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora
secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora,
endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini
merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan
malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan
menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya [2].
Langkah-langkahnya sebagai berikut.
1.Gunakan teknik aseptis, siapkan biakan bakteri dalam kondisi udara yang kering dan dengan
pemanasan yang baik.
2.Siapkan waterbath yang dipanaskan.
3.Tutup gelas preparat dengan selembar tisu dan letakkan pada rak di atas waterbath.
4.Tetesi dengan malachite green
5.Panaskan gelas preparat selama 5 menit.
6.pindahkan gelas preparat dari waterbath dan ambil kertas tisu dari preparat.
7.Biarkan gelas preparat dingin lalu cuci dengan air deionisasi.
8.Keringkan dan tambahkan safranin, diamkan selama 2 menit.
9.Cuci sisa safranin dengan air deionisasi dan keringkan noda.
10.Lakukan pengamatan preparat dengan mikroskop dengan bantuan minyak emersi.

Diantara ciri-ciri utama sel bakteri yang dipelajari adalah ukuran, bentuk, susunan dalam
kelompok, struktur sel, dan bagian-bagian lain yang memberi ciri khas bagi pengenalan bakteri
tersebut seperti flagel, kapsul, spora dan sebagainya. Motilitas suatu bakteri juga merupakan ciri
khas bagi pengenalan bakteri. Yang dimaksud dengan gerak ini adalah sifat atau kemampuan
bakteri untuk dapat berpindah tempat dengan menggunakan salah satu bagian tubuhnya. Jadi
bukan gerak yang disebabkan oleh pengaruh luar, seperti bergetar atau gerak maju mundur yang
disebabkan oleh benda-benda halus yang berada dalam cairan suspensi, sebagai akibat
pertumbukan molekul-molekul cairan dengan bakteri tersebut (gerak semacam ini disebut gerak
Brown). Salah satu bagian tubuh atau organ yang dimaksud adalah flagel. Bakteri dapat bergerak
dengan menggunakan flagel, akan tetapi flagel tidak ditemukan pada semua jenis bakteri. Oleh
karena itu dapat atau tidaknya bakteri bergerak merupakan salah satu ciri yang dapat digunakan
dalam identifikasi bakteri.
Diantara banyak anggota Protista sekurang-kurangnya ada empat gerakan berpindah yang
dapat dibedakan, yaitu gerak amoeboid, gerak meluncur, gerak yang disebabkan oleh
berputarnya sel berbentuk sawa (Spirochaetales), dan gerak yang disebabkan adanya gerak
seperti mendayung oleh flagel atau bulu cambuk.
Flagel sebagai alat gerak bakteri adalah suatu organ berupa benang yang berpangkal dalam
sitoplasma (Indrawati, dkk., 2002) atau flagel adalah semacam untai rambut yang menembus
keluar dinding sel dan menimbulkan gerak berenang (Usman, 1987). Sedangkan menurut Pelczar
(1986) flagelum adalah embel-embel seperti rambut yang teramat tipis mencuat menembus
dinding sel dan bermula dari tubuh dasar, suatu struktur granular tepat di bawah membran sel di
dalam sitoplasma (jamak, flagela). Flagelum inilah yang menyebabkan motilitas pada sel
bakteri.
Flagel tersusun dari tiga atau lebih serat paralel atau melilit memanjang, terbuat dari protein
tipe flagelin yaitu semacam miosin, lebih halus dari flagel ialah bulu getar (silia) eukarion. Tiap
serta adalah rantai polipeptida berbentuk sawa. Flagel terdiri dari tiga bagian :
1. Tubuh dasar
 Bagian dasar flagel berhubungan dengan membran sitoplasma dan dinding sel.
2. Struktur seperti kait
Struktur ini terdiri dari dua (pada bakteri Gram positif) atai empat (pada bakteri Gram negatif)
bagian berupa cincin yang melekatkan flagel itu pada membra sitoplasma dan dinding sel.
Tersusun dari subunit protein (monomer) yang diatur dalam pola sawa. Hilangnya dinding sel
tidak mengganggu flagel, hanya bila dinding sel tidak ada, gerak bakteri itu berkurang.
3. Sehelai filamen panjang di luar dinding sel
Bahan filamen berbentuk sawa, biasanya beberapa kali lebih panjang dari selnya sendiri.
Lama benar orang tidak tahu dengan pasti, apakah flagel itu tumbuh pada dinding sel ataukah
mempunyai akar di dalam sitoplasma, atau mungkinkah flagel itu hanya merupakan kepanjangan
protoplasma melalui celah-celah di dalam dinding sel. Elektron mikroskop menunjukan bahwa
flagel itu benang-benang protoplasma yang berpangkal pada titik-titik tepat di bawah membran
sel; pangkal itu disebut rizoblast (Dwidjeseputro, 1980). Tetapi menurut Usman (1987), terdapat
flagel yang memiliki flagel ekstern. Tetapi didalam selnya terdapat strukur yang mirip flagel
tepat di bawah pembungkus luar sel, dan dinamakan flagel periplasma, pernah disebut fibril
taksis atau endoflagel. Inilah yang menyebabkan gerak spirokheta, tetapi bagaimana
terlaksananya masih belum jelas diketahui.

Flagel menurut letak dan jumlahnya merupakan salah satu ciri yang dapat digunakan dalam
identifikasi bakteri. Macam-macam letak flagel:
- monotrik; (monotrich; monos, tunggal; thrix, rambut) satu flagel pada salah satu ujung sel
bakteri. Contoh bakteri Pseudomonas aeruginosa
- amphitrik; (amphitrich; amphi, dua-dua) satu flagel pada kedua ujung sel bakteri. Contoh
bakteri
Spirillum serpens
- lofotrik; (lophotrich; lophos, tumbuh berupa segumpal rambut) lebih dari satu flagel pada
salah
satu atau kedua ujung sel bakteri. Contoh Pseudomonas flourescens
- peritrik; (peritrich; peri, sekitar) flagel keluar dari tiap bagian permukaan sel bakteri. Contoh
bakteri Salmonella typhii
- atrik; tidak ada flagel, umumnya bakteri berbentuk kokus.
 Karena ada bukti-bukti bahwa bakteri yang amfitrik itu sebenarnya bakteri yang sedang atau
akan membelah diri, maka timbullah pendapat baru untuk mengadakan dua klasifikasi saja
mengenai kedudukan flagel, yaitu flagel terminal yang terdapat pada ujung saja seperti Vibrio,
Spirillum, dan Pseudomonas, dan flagel lateral seperti halnya Escherichia coli, Proteus vulgaris
serta pada beberapa Bacillus dan Clostridium yang dapat bergerak.
Sehubungan dengan masalah gerak bakteri ini, dapat diamati suatu fenomena yang disebut
serotaksis. Pengamatan terhadap fenomena ini dapat dilakukan di atas kaca objek dan dilihat
dengan menggunakan mikroskop. Dalam hal ini yang diperhatikan ialah kemana bakteri itu
bergerak:
1. Bila terdapat gerak menuju periferi, bakteri tersebut bersifat aerob obligat
2. Bila terdapat gerak menuju sentrum, bakteri tersebut bersifat anaerob obligat
3. Bila gerak menuju daerah antara periferi dan sentrum, bakteri bersifat mikroaerofil
Panjang flagellum biasanya beberapa kali lebih panjang dari selnya, namun diameternya jauh
lebih kecil daripada diameter asalnya, misalnya 10 sampai 20 nm. Di dalam keadaan alamiahnya,
flagellum terlampau kecil untuk dapat dilihat dengan mikroskop cahaya. Namun, dengan
prosedur pewarnaan khusus yang menggunakan mordan (suatu substansi yang mengikatkan zat
warna pada suatu permukaan), diameter dapat diperbesar dengan cukup untuk membuatnya
tampak di bawah mikroskop cahaya. Bukti-bukti tak langsung mengenai adanya flagella dapat
diperoleh dengan cara memeriksa bakteri pada preparat basah untuk melihat adanya pergerakan.
Untuk memeriksa gerak bakteri dapat dilakukan secara mikroskopik dan makroskopik. Cara
mikroskopik ada dua macam, yaitu:
1. Pengecatan flagel
2. Dengan pembuatan preparat
Bagi pergerakan silia dan flagella pada mikroorganisme motil dibutuhkan energi. Menurut
perkiraan, sebanyak 10 persen dari energi yang dipakai oleh beberapa dari mikrobe ini
digunakan untuk pergerakan flagella (Pelczar, 1986). Bukti yang menunjang bahwa ATP
dibutuhkan untuk menggerakan flagella berasal dari penelitian sitokimiawi pada bakteri-bakteri
motil. Hasil penelitian ini menampakan adanya aktivitas ATPase yang bergantung pada Mg pada
situs-situs pada membran tempat munculnya flagella. Hal ini menunjukan baha ATPase
terlokalisasi pada area-area ini dan karena itu ATP merupakan sumber energi bagi pergerakan
flagella bakteri (Pelczar, 1986).
 Bacillus subtilis
Jenis Bacilllus terdiri dari 22 spesies, dimana banyak diantaranya ditemukan pada makanan.
Bakteri ini bersifat aerobik sampai anaerobik fakultatif, katalase positif, dan kebanyakan bersifat
gram positif, hanya beberapa gram variabel. Bentuk spora yang diproduksi oleh Bacillus
bermacam-macam, tergantung dari spesiesnya. B.subtilis dan B.cereus memproduksi spora
berbentuk silinder yang tidak membengkak (langsing), tidak melebihi diameter 0.9 µm.
B.subtilis bersifat mesofilik (bakteri yang hidup baik antara 5ºC dan 60ºC, sedang temperatur
optimumnya ialah di antara 25ºC sampai 40ºC). Bakteri atau kuman ini berbentuk batang lurus,
Gram positif, berukuran 1.5 x 4.5 µm, sendiri-sendiri atau tersusun dalam bentuk rantai, bergerak
dan tidak bersimpai.
B. subtilis temasuk ke dalam golongan bakteri bentuk L atau bakteri yang tidak berdinding
sel. Tetapi spesies ini dapat kembali memperoleh kembali dinding aslinya. Pengembalian
khususnya dapat dirangsang oleh konsentrasi tinggi gelatin, tetapi dapat pula oleh agar keras,
membran filter atau fragmen dinding sel.
Tumbuh pada agar darah membentuk zona haemolisis beta yang lebar. Dapat juga tumbuh
pada agar gizi dan lain-lain. Beberapa jenis membuat haemolisis yang dapat larut. Kuman ini
bersifat patogen oportunis, menyebabkan infeksi pada telur dan septikimia. Dapat mencemari
botol transfusi darah sehingga melisiskan sel darah.
B. subtilis menghasilkan antibiotik basitrasin dan subtilin. Bakteri ini juga dapat
dipergunakan untuk pengempukan daging, dan penghilang noda pakaian
III.2 Tata Kerja :
A. Tetes tegak; bersihkan sebuah kaca objek sampai bersih dan bebas lemak. Teteskan satu ose
suspensi bakteri di bagian tengah, lihat dengan mikroskop dengan kondensor yang diturunkan
dan lensa objektif pembesaran 40x (cahaya lemah).
B. Tetes tegak dengan penutup; sama dengan cara A, tetapi menggunakan penutup gelas (cover
glass) yang sekelilingnya diberi vaselin.
C. Tetes gantung; bersihkan sebuah kaca objek cekung dengan sebuah kaca penutup.
Disekeliling
kaca penutup diberi vaselin. Ditengah kaca penutup, diteteskan 1 ose suspensi bakteri, suspensi
tadi jangan dilebarkan, dibiarkan berkumpul ditengah kaca penutup. Tempelkan kaca objek
 cekung dengan kaca penutup sehingga tetesan tepat di daerah cekung. Lihat dengan mikroskop
seperti cara A di atas.
Cara makroskopik; dengan menanam bakteri dalam medium setengah padat (medium semi
solid). Medium yang digunakan adalah buylon agar dengan konsentrasi agar 0.1 – 0.2% dan
dibekukan dalam tabung reaksi secara tegak. Penanaman dilakukan dengan jarum penusuk, yang
ditusukan secara tegak ke dalam medium pembiakan tersebut. Selanjutnya diinkubasi pada suhu
yang sesuai selama 12-24 jam. Jika gerak positif, seluruh medium menjadi keruh. Jika gerak
negatif, maka bakteri yang hidup hanya pada daerah tusukan saja.
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan ini dilakukan pada hari kamis, tanggal 2 Desember 2004.
Pada percobaan mengamati motilitas bakteri, praktikan mempergunakan metode tetes
gantung. Metode tetes gantung ini dipergunakan untuk mengamati proses kehidupan tertentu,
misalnya motilitas dan reproduksi. Metode ini berguna sekali apabila morfologi mikroorganisme
yang tengah diperiksa dapat rusak karena perlakuan dengan panas atau bahan kimia ataupun bila
organisme tersebut sukar untuk diwarnai.
Hasil yang diperoleh adalah bakteri sampel bergerak naik turun (motil), dan berbentuk basil
(silinder). Praktikan tidak dapat menunjukan apakah bakteri sampel bergerak menggunakan
organ atau tidak. Karena flagellum terlampau kecil untuk dilihat melalui mikroskop cahaya.
Pewarnaan dengan menggunakan mordan juga tidak dilakukan. Tetapi menurut sumber yang
diperoleh, B. subtilis bergerak dengan menggunakan organ atau flagel. Bacillus subtilis termasuk
gram positif, oleh karena itu diperkiran bakteri tersebut memiliki dua bagian yang membentuk
cincin yang melekatkan flagel dengan membran sitoplasma atau dinding sel. Bakteri ini
berukuran 1.5 x 4.5 µm, sendiri-sendiri atau tersusun dalam bentuk rantai. Sumber juga
mengatakan bahwa Bacillus subtilis ini termasuk dalam klasifikasi flagel berkedudukan lateral.
Pada percobaan, objek glass diberikan vaselin, karena vaselin berguna agar suspensi
bakteri tidak kering. Vaselin atau jeli petroleum ini juga berfungsi untuk mengurangi laju
penguapan dan meniadakan aliran udara.

Dwidjoseputro D., Dr., Prof. 1980. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Penerbit

Djambatan
 Fardiaz, Srikandi. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor: Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan,
Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi,
Institut
Pertanian Bogor
Indarwati, Ida., Ratu Safitri, Mia Miranti. 2002. Praktikum Mikrobiologi Dasar.
Sumedang: Jurusan
Biologi FMIPA UNPAD
MD., Satish Gupte. 1982. Mikrobiologi Dasar Edisi ketiga. Terjemahan Dr. Julius E.S.
Jakarta:
Binarupa Aksara
Pelczar, M.J., dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: UI Press
Suriawiria, Unus Drs.1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Penerbit Angkasa
Usman, Razali. 1987. Mikrobiologi Dasar. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan
Alam Universitas Padjadjaran
Motalitas merupakan salah satu ciri penting pengkarakterisasian bakteri. Sifat ini diakibatkan oleh
adanya alat moler cambut yang disebut flagella sehingga sel bakteri dapat berenang didalam lingkungan
air. Motilitas sebagaian besar jenis bakteri motil pada suhu relative rendah 15-25◦c dan mungkin tidak
motil pada suhu 37◦c. Namun, suatu resiko tersendiri bagi organisme berukuran kecil untuk menerima
kenyataan bahwa dengan ukuran tersebut sel bakteri dapat dipengaruhi oleh aktifitas molekul air/
pelarut disekitarnya yang dinamakan Brownian movement. Gerakan brown adalah gerak partikel koloid
yang bergerak dengan arah tak beraturan, gerak acak molekul ini dapat membuat sel bakteri bergoyang-
goyang cepat atau lebih tepatnya bergetar tak beraturan sehingga bagi mata yang awas akan terlihat
motil. Sel yang berpengaruh gerak brown diamati pada perbesaran 1000x dengan mikroskop cahaya,
tentunya dengan preparat sederhana dan media kaldu atau koloni yang dicampur air (anonymous,2010).

Sel yang bergerak dengan dorongan flagella akan bergerak lebuh aktif. Jika suatu sel tersebut motil,
akan menciptakan jalur gerak yang tak beraturan. Namun untuk gerak brown sel tampk pasif dan seperti
bergerak sendiri, mirip pada saat menggetarkan batang pensil dengan memutarkan pergelangan tangan
(Anonymous,2010).
 Flagella merupakan struktur komplek yang tersusun atas bermacam-macam protein termasuk
flagelin yang membuat flagella berbentuk seperti tabung cambut dan protein kompleks yang memanjang
dinding sel dan membran sel untuk membentuk seperti cambuk, flagella digunakan bakteri sebagai alat
gerak.

Bentuk yang umum dijumpai meliputi:

 Monopolar monotrikha :bakteri memliki satu flagel yang berada disalah satu ujung sel.

 Monopolar lofotrikha: memiliki banyak flagel yang ditemukan pada salah satu kutub sel.

 Bipolar amfritrikha: memiliki flagel pada kedua kutubnya dengan jumlah lebih dari satu.

 Peritikha: bakteri mempunyai flagel yang tersebar pada seluruh bagian selnya (Kaiser,qary, 2004)

Tidak semua bakteri mempunyai daya motilitas, ada bakteri yang tidak mempunyai alat gerak
yaitu flagella sehingga berdasarkan letak dan jumlah flagel pada sel bakteri, jenis ini digolongkan dalam
bakteri ( Anonymous, 2010).

Menurut nastutik (2002) kebanyakan sel bakteri dapat bergerak dengan menggunakan flagel,
akan tetapi ada bakteri yang tidak dapat bergerak karena lidah memiliki flagel. Hal ini senada dengan
penyataan taringan (1988) yang menyatakan bahwa gerak bakteri terjadi pada bakteri yang mempunyai
flagel, karena flagel ini merupakan alat gerak bagi sel bakteri. Flagel merupakan bulu cambuk yang
dimiliki oleh beberapa jenis bakteri dan letaknya berbeda-beda tergantung kepada spesiesnya.

Flagel tersusun atas tiga bagian yaitu:

 Pangkal (basal) merupakan bagian yang berhubungan dengan membrane plasma.

 Kook yang panjang.

 Filamen yang bentuknya seperti benang.

Menurut gross (1995) struktur bakteri yang berflagel itu kaku dan dilengkapi dengan gelendong
yang berbentuk spiral. Gelendong spiral tersusun atas protein yang disebut dengan flagelin yang
merupakan unit dasar penyusun flagella (Anonymous, 2010).

Praktikum ini digunakan untuk mengamati gerak atau motilitas bakteri. Metode ini bertujuan
untuk mengamati gerak bakteri yang bergera. Pada alat inokulasi bakteri diambil dan ditusukan
 menggunakan jarum ose pada tabung reaksi yang sudah terisi media dan tabung reaksi dapat dilihat
mikroba yang bergerak, pengelompokan bakteri secara natural dan reaksi bakteri terhadap bahan kimia
(Anonymous, 2010).

Gerak bakteri yang bersifat motil diakibatkan oleh adanya struktur atau organ sel bakteri yang
berbentuk benang yang flagelia. Flagella panjang dan ramping. Pada umumnya memiliki panjang sekitar
12-30 mm. Untuk bisa melihat jelas pergerakan flagella bakteri digunakan zat warna tertentu
(Anonymous, 2010).

Fariaty (1995) juga mengatakan bahwa gerak brown adalah gerak partikel koloid yang bergerak
dengan zig-zag, gerakan ini disebabkan adanya tumbukan antara, molekul-molekul pelarut dengan
molekul.

Menurut volk (1988) kemampuan suatu organisme bergerak sendiri disebut motilitas (daya gerak).
Hamper semua sel bakteri spiral dan sebagian dari sel bakteri basil bersifat motil (bergerak), sedangkan
bakteri yang berbentuk kokus bersifat tidak bergerak (non motil).

a. Motilitas merupakan salah satu cirri penting pengkarakterisasi bakteri

b. Motolitas mikroba yaitu kemampuan bergerak mikroba.

c. Flagel merupakan struktur kompleks yang tersusun atas bermacam-macam protein termasuk flagelin
yang membuat flagel berbentuk seperti tabung cambuk.

d. Gerak brown adalah gerak praktikel koloid yang bergerak dengan zig-zag.

e. Kemampuan suatu organisme bergerak sendiri disebut motilitas.

f. Bakteri yang berbentuk kokus bersifat tidak bergerak (non motil).

Anonymous, 2010. Motalitas Bakteri.htp//lordbroken wordpress.com/2010/03/06 motalitas bakteri.

Gross,1995.introgductary microbiology. London:chaswaan hall university and profesional

Hastutik, Sri utami, 2002. Petunjuk praktikum mikro, Malang :UMM press

Karser, gery. 2004. Microbiology laboratory manual. Cotons ville campus of the comunity collage of balsimere
country
Volk, 1988, mikrobiologi dasar. Jakarta: Erlangga.

Motilitas bakteri adalah suatu gerakan bakteri yang disebabkan adanya gerak aktif dan
pasif
Gerak aktif adalah gerakan bakteri yang disebabkan karena bakteri memiliki flagel
Gerak pasif disebabkan karena factor dari luar (gerak brown)

Gerak brown adalah suatu gerakan yang dapat menggetarkan partikel-partikel secara
acak atau terarah karena terus-menerus terkena pukulan molekul-molekul kecil yang tak
terlihat yang terdapat dalam cairan.

Motilitas dapat diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang
sudah lama,bakteri sudah mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang motil,
selain itu produksi asam dan produk yang bersifat racun dapat menyebabkan hilangnya
motalitas sel bakteri pada biakan (Volk, 1988).
Menurut Taringan (1988) beberapa bakteri dapat melakukan gerakan meluncur yang
sangat mulus yang hanya terjadi kalau persentuhan dengan benda padat. Kebanyakan
bakteri yang motil dapat mendekati atau menjauhi berbagai senyawa kimia yang disebut
kemotaksis.
Menurut Volk (1988) kemampuan suatu organisme untuk bergerak sendiri disebut
motilitas. Hampir semua sel bakteri spiral dan sebagian dari sel bakteri basil bersifat
motil, sedangkan bakteri yang berbentuk kokus bersifat immotil

. keuntungan yang diperoleh dengan penggunaan metode preparat tetes gantung dalam
uji motilitas bakteri adalah:
a. sel bakteri akan lebih leluasa atau mudah bergerak karena fluida yang menggantung
memberikan ruangan yang lebih besar untuk bakteri bergerak, sedangkan fluida yang
menempel pada permukaan obyek glass (tidak menggantung), akan membuat bakteri
terhimpit sehingga tidak dapat bebas bergerak.
b. melalui preparat tetes gantung sel bakteri tidak akan mati terhimpit kaca penutup dan
kaca benda, karena pada metode ini kaca benda yang digunakan adalah kaca benda yang
cekung pada bagian tenganya.
c. karena posisi bakteri yang menggantung diatas cekungan, maka bakteri tidak
membahayakan praktikan seandainya saja bakteri tersebut bersifat patogen
d. lebih mudah mengamati gerak sel bakteri karena sel-sel bakteri hanya bergerak sebatas
tetesan fluida sebagai media tinggal bakteri.

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa jenis bakteri. Dua jenis bakteri
yang dapat membentuk spora misalnya Clostridium dan Bacillus. Clostridium adalah bakteri yang bersifat
anaerobic, sedangkan Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. Struktur endospora mungkin bervariasi
untuk setiap jenis spesies, tapi umumnya hamper sama. Endospora bakteri merupakan struktur yang tahan
terhadap keadaan lingkungan yang ekstrim misalnya kering, pemanasan, dan keadaan asam.

Variasi letak spora :

a. Ditengah sel (sentral). Contoh Bacillus Cereus.

b. Di ujung sel (terminal). Contohnya Clostridium thuringensis.

c. Didekat ujung (sub terminal). Contohnya Clostridium subterminale.

Bakteri pembentuk spora lebih tahan terhadap desinfektan, sinar, kekeringan, panas, dan
kedinginan. Kebanyakan bakteri pembentuk spora tinggal di tanah, namun spora bakteri dapat tersebar di
mana saja.

Metode pengecatan spora :

 Metode Scaffer fulton
 Metode Bartolomev mittwer
 Metode Klein
 MetodeWirtz

Prosedur Pengecatan
a. Metode Scaffer fulton
1. Bersihkan objek glass dengan alkohol agar bebas dari lemak
2. Buat preparat dari biakan yang ada secara aseptik
3. Kering anginkan
4. Lakukan fiksasi di atas nyala api
5. Genangi preparat dengan 2-3 tetes malachite green 5% panasi hingga keluar uap 3 kali,
diamkan selama 10 menit
6. Cuci dengan air mengalir
7. Tetesi dengan cat safranin selama 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir
9. Preparat dikering anginkan
10. Amati preparat dengan mikroskop ( memakai minyak imersi)
11. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna hijau

b.Metode Bartolomev mittwer

1. Bersihkan objek glass dengan alkohol agar bebas dari lemak

2. Buat preparat dari biakan yang ada secara aseptik
3. Kering anginkan
4. Lakukan fiksasi di atas nyala api
5. Genangi preparat dengan 2-3 tetes malachite green 5% dan biarkan selama 10
menit,
6. Cuci dengan air mengalir
7. Tetesi dengan cat safranin selama 1 menit
8. Cuci dengan air mengalir
9. Preparat dikering anginkan
10. Amati preparat dengan mikroskop ( memakai minyak imersi)
11. 11. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna hijau

c.Metode Klein I

1. Campur suspensi bakteri dengan carbol fuschin dalam tabung reaksi dengan
perbandingan 1:1.

2. Panaskan dalam penangas air selama10 menit pada temperatur 80 0 C .

3. Buat preparat dari campuran suspensi diatas.

4. Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik.

5. Cuci dengan air mengalir, lalu genangi methylene blue selama 3 menit.

6. Cuci dengan air, kering anginkan

 7. Amati dibawah mikroskop perbesaran 1000x dengan emersi oil

8. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru

d. Metode Wirtz

1. Buat preparat dari suspensi bakteri.

2. Genangi dengan malachite green, panaskan sampai menguap kurang lebih selama
2 menit.

3. cuci dengan air mengalir, tambahkan safranin selama 30 detik.

4. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.

5. Amati dengan perbesaran1000x dengan emersi oil.

LATAR BELAKANG
Bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang artinya tongkat atau benang.
Saat ini nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme yang bersel satu, tidak
berklorofil (meskipun ada kecualinya), berkembang biak dengan pembelahan diri, serta demikian
kecilnya sehingga hanya tampak dengan menggunakan mikroskop.
Apabila kita ingin mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bekteri dapat diperiksa
dalam keadaan hidup maupun dalam keadaan mati. Pemerikasaan morfologi ini perlu untuk
mengenal nama bakteri dan sifat-sifat fisiologi yang merupakan faktor penentu dalam mengenal
nama spesiesnya.
Pada rangkaian pengamatan bakteri, terdapat cara untuk mengetahui sifat-sifat morfologi
tersebut yaitu dengan pewarnaan bakteri. Larutan pewana tidak dapat langsung masuk ke dalam
sel hidup. Oleh karena itu, sel biasanya di bunuh dahulu sebelum dilakukan pewarnaan. Sel yang
mati akan menyerap dan mempertahankan pewarna. Cara umum untuk membunuh sel adalah
dengan fiksasi panas. Sel diapuskan pada gelas objek sehingga diperoleh lapisan tipis. Preparat
kemudian dipanaskan pelahan-lahan untuk membunuh sel.
Metode mewarnai atau mengecat preparat itu ada banyak sekali antara lain dengan
pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan mikroorganisme dengan
menggunakan satu jenis zat saja. Kemudian ada pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif
merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan menjadi
 lapisan tipis. Selanjutnya ada pewarnaan acid-fast. Pewarnaan acid-fast digunakan untuk
membedakan bakteri yang tahan asam dengan yang tidak tahan asam.
Kemudian pewarnaan gram. Pada tahun 1884, seorang ahli histology dan
bakteriologiawan dari Denmark, Christian Gram secara kebetulan menemukan prosedur
pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan
paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan
secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu pertama, organisme yang dapat menahan
kompleks pewarna primer ungu iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru
gelap/ungu), disebut “Gram positif”. Kedua, organisme yang kehilangan kompleks warna ungu
kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna
bandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut “Gram negatif”.
Pada perkembangan ilmu pangan, pengetahuan akan bakteri sangat dibutuhkan terutama
dalam identifikasi jenis bakteri yang berkaitan dengan pangan. Misalnya pemanfaatan bakteri
yanag menguntungkan sehingga banyak digunakan dalam industri makanan atau proses
pengubahan suatu zat dalam makanan.

B. TUJUAN
Tujuan dari praktikum acara Morfologi dan Pewarnaan Bakteri adalah untuk mempelajari
morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri dengan cara pewarnaan bakteri menggunakan
metode pewarnaan negatif, Gram, dan acid-fast.
C. TINJAUAN PUSTAKA
Ziehl-Neelsen adalah metode yang paling umum digunakan. Dinding sel organisme
mikrobakteri mengandung kompleks lipid dikenal sebagai hidroksi karboksilat asam,
phitiocerols dan polimetil asam. Kompleks lainnya lipid dan
glycolipids telah diisolasi. Karboksilat hidroksi asam yang memiliki sifat tahan luntur asam dan
lainnya menyajikan sebuah penghalang untuk pewarna masuk serta elusi. Metode Ziehl-Neelsen
ini adalah dengan menambahkan fenol, agen lipofilik untuk larutan dari fuchsin dasar oleh
pemanasan dan memperpanjang waktu pewarnaan (Raoul, 2009).
Pencarian untuk kecepatan dan keberhasilan telah menghasilkan beberapa modifikasi untuk
menyederhanakan metode pewarnaan ZN. Namun, tidak satupun yang telah memperoleh
penerimaan yang luas kecuali untuk metode pewarnaan dingin. Dalam studi
ini, pewarnaan ZN menggunakan 0,3% fuchsin dasar yang ditemukan sensitif dan
spesifik untuk yang menggunakan 1% fuchsin dasar. Menggunakan reagen ini dapat menghindari
pemborosan fuchsin dasar dan mengurangi biaya pewarnaan. Mengurangi konsentrasi dari
fuchsin dasar di bawah 0,3%, bagaimanapun, ditemukan mempengaruhi sensitivitas
ZN (Selvakumar, 2005).
 Secara garis besar berdasar pengecatan Gram, bakteri dikelompokkan menjadi 2, yaitu
Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat
warna gram A yang mengandung kistal violet, sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini
akan berwarna ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah
atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat cat Gram D sebagai
warna kontras. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri Gram positif susunan lebih sederhana terdiri
atas 2 lapis namun memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sementara pada dinding sel bakteri
lebih kompleks terdiri atas 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Juliantina, 2009).
Bakteri Lactobacillus sp. ini termasuk Gram positif, tidak berspora, tidak motil oleh
flagel peritrichous, fakultatif anaerob, kadang-kadang mikroaerofilik, sedikit tumbuh di udara
tapi bagus pada keadaan di bawah tekanan oksigen rendah, dan beberapa anaerob pada isolasi.
Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: warna koloni
putih susu atau agak krem, bentuk koloni bulat dengan tepian seperti wol. Sel berbentuk batang
dan biasanya tetap, berukuran 0,5-1,2 x 1,0-10,0 μm (Feliatra, 2004).
Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan
untuk bakteri adalah pewarnaan Gram. Dalam proses ini olesan bakteri terfiksasi dikenai larutan
sebagai berikut : ungu kristal, larutan yodium, alcohol (bahan pemucat), dan safranin atau
beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini
dibagi menjadi 2 kelompok yaitu Gram positif mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan
karenanya tampak ungu tua. Kelompok lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika
dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan merah safranin, tampak
bewarna merah (Pelczar, 1986).
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal
violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati
dengan mikroskop. Bakteri Gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di
mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai
dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran
luarnya. Banyak spesies bakteri Gram negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka
berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen
tertentu pada dinding sel Gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan
LPS atau endotoksin) (Anonima, 2011).
Gram negatif yang paling terkenal adalah Veillonella alcalescens (dahulu Micrococcus
lactilyticus) dan Megasphaera (dahulu Pepto streptococus). Kedua-duanya tidak mampu untuk
meragikan karbohidrat. V. alcalescens ditemukan dalam ludah manusia dan hewan, dan juga
perut besar hewan pemamah biak. Bakteri ini meragikan asam-asam organik menjadi propionat,
asetat, CO2, H2 (Schlegel, 1994).
E.coli adalah suatu bakteri Gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif,
dan mempunyai flagella peritrikat. E.coli dibedakan atas sifat scrologinya berdasarkan antigen O
(somatik), K (kapsul), H(flagella). Medium selektif yang dapat digunakan untuk
mengisolasi E.coli misalnya DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) Agar atau
MacConkey Agar. Koloni E.coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan
dikelilingi oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile. E.coli akan menfermentasikan
laktosa dalam medium menjadi asam, sehingga mengakibatkan terjadinya pengendapan bile dan
penyerapan indikator merah netral (Fardianz,1990).
Lactobacillus adalah suatu bakteri berbentuk batang, bervariasi dari panjang dan ramping
sampai kokobaksilus pendek. Pembentukan rantai umum dijumpai, terutama pada fase
pertumbuhan logaritma lanjut. Tidak membentuk spora. Gram positif berubah menjadi gram
negatif dengan bertambahnya umur dan derajat keasaman. Beberapa galur memperlihatkan
tubuh-tubuh bipolar, granulasi internal atau penampilan seperti batang dengan reaksi gram atau
pewarna biru metilen (Pelczar, 1988).
Pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk
membedakan spesimen kecil dengan cairan optiknya.
Untuk mikroskop medan terang, pewarnaan negatif biasanya menggunakan cairan hitam misal
nigrosin. Spesimen seperti bakteri dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur
dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika diamati dengan mikroskop, bakteri atau
kadang sporanya terlihat bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau
pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang
bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna.
Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin
(Anonimb, 2011).
Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap
mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat
warna kedua. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah
dengan warna dasar biru muda. Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium, antara lain banyak
yang merupakan saprofit (Anonimc,2011).
Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini yaitu pewarna Ziehl – Neelsen,
prosedur ini menggunakan pewarna utama dengan pemanasan, dan biru metilena loeffler sebagai
warna tandingan. Alkohol-asam merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan
dengan alkohol aseton yang banyak digunakan dalam pewarnaan gram. Pada kondisi pewarnaan
 ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Pada
bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang
mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol asam dan karenanya
dikatakan tak tahan asam (Hadioetomo, 1990)
D. METODOLOGI
1 1. Alat
a. Gelas objek
b. Gelas penutup
c. Batang gelas
d. Jarum oose
e. Pipet tetes
f. Rak tabung reaksi
g. Bunsen spirtus
h. Label dan tissue
i. Mikroskop cahaya
2. Bahan
a. Biakan murni Lactobacillus achidophilus, Escherichia coli dan Lactococcus sp.
b. Larutan cat nigrosin
c. Aquades
d. Alkohol 70%
e. Larutan cat Ziehl Neelsen carbol fuchsin
f. Larutan peluntur alkohol asam
g. Larutan penutup Loeffler methylen blue
h. Larutan cat Huker’s crystal violet
i. Larutan mordan Lugol’s iodine
j. Larutan peluntur alkohol-aseton
k. Larutan Safranin

E. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan differensial karena dapat digunakan

untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar yaitu Gram positif dan Gram negatif.
Pada praktikum ini digunakan bakteri L. Achidophilus, E. coli, Lactococcus sp.
Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu
muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah didasarkan
pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif mengandung protein dan
Gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif sedangkan pada bakteri
Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding
selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme
gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran
tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan
peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalahfase yang paling kritis
dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV (warna utama) iodine
lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan
menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun
juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan
melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi
pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam.
Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya
pada Gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian
berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa spesies yang
memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Pembahasan
Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan antara bakteri tahan asam dan
bakteri tidak tahan asam. Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna
akibat alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga
menghasilkan warna merah.
Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam
yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan mempertahankan
warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri tahan asam.
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna adalah senyawa kimia
berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif
dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-
bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah
yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.

Pembahasan
 Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat
warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Zat warna atau cat yang digunakan memiliki
pengaruh yang lemah terhadap sel mikroorganisme. Pewarnaan ini dinamakan pengecatan
negatif karena sel tidak diwarnai dan dibuat menjadi kasat mata karena latar belakang yang
gelap.
Pada praktikum ini digunakan bakteri Lactobacillus achidophilus. Pewarnaan negatif ini
bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan
atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah
satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.
Pewarnaan negatif atau peawarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan
negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif
sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu
sel menjadi tidak berwarna. Untuk pengamatan menggunakan mikroskop elektron transmisi,
kemampuan optis elektron berhubungan dengan nomor atom. Beberapa pewarna negatif seperti
ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate, phosphotungstic acid dan
auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elekron dengan baik dan menyerap zat
biologi dengan baik. Struktur yang dapat diamati dengan pewarnaan negatif lebih sedikit dari
pada dengan pewarnaan biasa. Cara ini biasa digunakan untuk melihat virus, bakteri, flagel
bakteri, struktur protein atau gabungan protein biologi membran yang memiliki pancaran
elektron dengan kekuatan rendah. Pewarnaan negatif pada mikroskop cahaya atau mikroskop
elektron tidak menimbulkan penularan mikroorganisme. Walau demikian keamanan harus tetap
diperhatikan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif memungkinkan organisme
terlihat transparan dan tampak jelas diantara medan yang gelap karena pewarna tersebut tidak
menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Metode ini juga berguna untuk bakteri-bakteri tertentu yang sukar diwarnai.

F. Kesimpulan
Kesimpulan yang didapatkan dari praktikum Morfologi dan Pewarnaan Bakteri ini antara
lain:
a. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-
50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
b. Kelompok bakteri yang merupakan Gram positif adalah L. Achidophyllus dan Lactococcus
sp. Sedangkan kelompok bakteri yang merupakan Gram negatif adalah E. coli.
 c. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada
bakteri Gram negatif karena akan kehilangan cat utama setelah tahap dekolorasi sedangkan pada
bakteri Gram positif menyebabkan sel menjadi berwarna ungu karena mengikat kuat cat utama
dan tidak dapat dilunturkan oleh bahan peluntur.
d. Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang
berwarna merah dengan latar berwarna biru karena tahan terhadap pencucian dengan asam dan
alkohol sehingga mempertahankan warna pertama yang diberikan. Sedangkan bakteri tidak tahan
asam akan tampak berwarna biru karena cat pertama dilunturkan oleh asam dan alkohol
kemudian mengikat cat kedua.
e. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
f. Pewarnaan negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif.
g. Beberapa pewarna negatif seperti ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate,
phosphotungstic acid dan auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elektron dengan
baik dan menyerap zat biologi dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Anonima. 2011. Gram Negatif. http://www.wikipedia.com. Diakses pada tanggal 2 Mei 2011 pukul
16.00 WIB.
Anonimb. 2011. Pewarnaan Negatif http://capuholic.blogspot.com/2010/02/ Diakses pada tanggal 2
Mei 2011 pukul 16.54 WIB.
Anonimc. 2011. Bakteri Tahan Asam . http://my.opera.com/chanlightz/blog. Diakses pada tanggal 2 Mei
2011 pukul 17.12 WIB.
Feliatra, dkk. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan kerapu Macan (Ephinephelus
fuscogatus) dalam upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2).
Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.
Fardianz, Srikandi. 1990. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Juliantina, Farida. 2009. Manfaat Sirih Merah sebagai Agen Anti Bakterial terhadap Bakteri Gram
Positif dan Gram Negatif. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia.
Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. UI press. Jakarta.
Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. UI press. Jakarta.
Raoul, Da’si Kemgni, dkk. 2009. A Faster and saver staining technique for acid fast bacilli in
resource-poor settting. Vol 1.(5), May.
Schlegel, Hans G.1994. Mikrobiologi Umum. UGM press. Yogyakarta.
Selvakumar, N, dkk. 2005. Comparison of variants of carbol-fuchsin solution in Ziehl-Neelsen
for detection of acid-fast bacilli. Int J Tuberc Dis 9(2). New Delhi, India.