THP-04

LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNOLOGI FERMENTASI

KARAKTERISASI BAKTERI PROTEOLITIK

AINUN KURNIA IZZATA

NIM.141811233084

TEKNOLOGI HASIL PERIKANAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN KELAUTAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2020
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Terasi merupakan suatu makanan tradisional Indonesia yang sudah tersebar dan biasanya
dijadikan sebagai bahan penyedap masakan yang sudah lama dikenal, yang proses
pengolahannya melalui fermentasi. Kandungan padatan (protein, garam, Ca, dan sebagainya)
terasi sekitar 27-30%, air 50-70% dan garam 15-20%. Selama proses fermentasi, akan terjadi
aktivitas enzim yang diproduksi oleh mikroba yang berperan dalam proses fermentasi produk.
Fermentasi merupakan proses terjadinya perubahan kimia pada suatu senyawa organik
kompleks menjadi senyawa organik yang lebih sederhana dengan bantuan enzim yang
dihasilkan oleh mikroba. Proses ini dapat berlangsung secara aerob maupun anaerob tergantung
sifat mikroba yang digunakan. Fermentasi padat dalam produksi enzim pada umumnya
memberikan hasil yang lebih baik dan enzim yag dihasilkan juga lebih beragam (Munifah,
2013).

Protease merupakan enzim yang digunakan secara luas pada industri makanan dan telah
hampir mencapai 65% dari total penjualan enzim di dunia. Salah satu fungsi protease yaitu
berperan dalam degradasi protein menjadi asam amino. Bakteri penghasil protease didapatkan
melalui isolasi bakteri proteolitik menggunakan media Skim Milk Agar (SMA). Bakteri
proteolitik biasanya banyak ditemukan pada makanan yang mengandung protein. Sampel
olahan makanan hasil fermentasi yang kaya protein adalah tempe gembus, terasi, oncom, rusip
udang dan produk fermentasi lainnya (Bardriyah dan Ardyati, 2013).

1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui daya hidrolisis dari bakteri proteolitik
pada produk olahan terasi.
 II. TINJUAN PUSTAKA

2.1 Bakteri Proteolitik

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mampu mendegradasi protein, karena memproduksi
enzim protease ekstraseluler (Susanti, 2003 dalam Puspitasari dkk, 2012). Protease merupakan
enzim proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Untuk menentukan
kemampuan mikroorganisme dalam mensekresikan protease yang dapat mendegradasikan
protein, maka pada medium disertakan susu skim yang mengandung kasien. Pada umumnya
bakteri proteolitik adalah bakteri dari genus Bacillus, Pseudomonas, Proteus (Schlegel, 1984
dalam Puspitasari dkk, 2012) Streptobacillus, Staphylococcus, Streptococcus (Madigan et al,
1997 dalam Puspitasari dkk, 2012).

2.2 Media Skim Milk Agar (SMA)

Media Skim Milk Agar (SMA) merupakan media yang mengandung kasein. Kasein
merupakan protein utama susu, suatu makromolekul yang tersusun atas sub unit asam amino
yang dihubungkan dengan ikatan peptide. Kasein tersebut berfungsi sebagai substrat bagi enzim
protease (Fatoni dkk.,2008 dalam Inayatul dkk, 2018).

2.3 Media Nutrient Agar

Nutrient Agar (NA) adalah salah satu contoh media instan yang sering digunakan untuk
menumbuhkan dan mengembangbiakkan bakteri. Harga Nutrient Agaryang cukup mahal yaitu ±
Rp. 1.500.000,00/500 grammendorong para peneliti untuk membuat media pertumbuhan bakteri
yang berasal dari alam dengan biaya yang lebih ekonomis. Selain itu, pemanfaatan
keanekaragaman sumber daya alam juga dapat dimaksimalkan dan tidak hanya dipandang
sebelah mata khususnya dalam bidang keilmuan (Wachidah, 2016).

2.4 Media Trypticase Soy Broth

Trypticase Soy Broth (TSB) adalah media broth diperkaya tujuan umumnya untuk isolasi,
dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri
dari specimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen.
Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam aminodan
substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam
 mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan
kesetimbangan osmotik (Astuti, 2018).

2.5 Metode Difusi Cakram

Metode difusi cakram merupakan cara yang paling sering digunakan untuk menentukan
kepekaan mikroorganisme. Pada cara ini digunakan suatu cakram kertas saring (paper disk)
yang berfungsi sebagai tempat menampung bakteri. Kertas saring tersebut kemudian
diletakkan pada lempeng agar yang telah diinokulasi mikroba uji, kemudian diinkubasi pada
waktu tertentu dan suhu tertentu, sesuai dengan kondisi optimum dari mikroba uji. Pada
umumnya, hasil yang di dapat bisa diamati setelah inkbuasi selama 18- 24 jam dengan suhu
37oC. Hasil pengamatan yang diperoleh berupa ada atau tidaknya daerah bening yang
terbentuk di sekeliling kertas cakram yang menunjukkan zona hidrolisis bakteri (Kumalarasi,
2014).
 III. METODE PELAKSANAAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jumat, 21 Februari 2020 pada pukul 09.00 – 10.50
WIB di Laboratorium Kimia dan Analisis Fakultas Perikanan dan Kelautan Unviersitas
Airlangga, Surabaya.

3.2 Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan pada praktikum ini adalah bunsen untuk menciptakan kondisi
steril, korek api untuk menghidupkan bunsen, jarum ose untuk mengambil koloni bakteri dan
memindahkannya ke media TSB, microtube sebagai wadah untuk media TSB, petridisk sebagai
wadah media SMA, pinset untuk mengambil dan meletakkan paper disk pada media SMA,
penggaris dan spidol untuk menggambar garis pada petridisk. Sedangkan bahan – bahan yang
digunakan anatra lain media TSB untuk isolasi bakteri proteolitik, media SMA sebagai media
pada saat menguji daya hidrolisis bakteri, dan paper disk sebagai tempat menampung bakteri
pada media SMA.

3.3 Prosedur Kerja

Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan,
kemudian melakukan pengamatan pada media NA hasil praktikum tahap pertama, selanjutnya
dilakukan preparasi media TSB dan SMA. Kemudian isolat bakteri yang akan dikarakterisasi
dikultur pada medium TSB pada suhu 30 oC selama 18 jam. Kemudian sentrifugasi dan
diencerkan hingga mencapai kekeruhan standar McFarland 1. Selanjutnya diambil 1 paper disc
kosong dan diletakkan di atas permukaan media skim milk agar. Kemudian diteteskan
inoculum yang akan diuji pada paper disc kosong dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 72
jam. Kemudian melakukan pengukuran zona hidrolisis yang dihasilkan.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Tabel 4.1.1 Hasil Pengukuran Diameter Zona Bening

Diameter
Petridis Diameter (cm)
Rata-Rata (cm)
h
Kuadran 1 Kuadran 2 Kuadran 3 Kuadran 4
1 0,23 0,16 0,13 0,13 0,16
2 0,16 0,16 0,16 0,13 0,15
3 - - - - -

4.2 Pembahasan

Adanya aktivitas protease secara kualitatif ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di
sekitar koloni. Pengukuran diameter zona bening dilakukan menggunakan penggaris. Semakin
besar zona bening yang terbentuk di sekitar koloni, maka semakin besar juga aktifitas protease
yang dihasilkan. Berdasarkan tabel 4.1.1 dapat diketahui bahwa koloni bakteri pada petridish
ke-1 dan petridish 2 memiliki rata – rata diameter sebesar 0,16 cm dan 0,15 cm. Besar aktivitas
enzim proteolitik ditunjukkan dengan semakin lebarnya zona bening, tetapi besarnya aktivitas
enzim proteolitik yang berperan merombak protein dalam medium padat tidak dapat diketahui
dan diukur secara kuantitatif. Hasil perombakan polimer protein hanya ditunjukan dengan
adanya zona bening yang menandakan protein telah dirombak menjadi senyawa peptida dan
asam amino yang sifatnya terlarut dalam medium. Aktivitas hidrolisis secara kualitatif
merupakan gambaran dari kemampuan isolat bakteri proteolitik merombak protein dengan
membandingkan besarnya zona bening di sekitar koloni dengan besarnya diameter koloni.
Besarnya aktivitas enzim protease menunjukkan bahwa bakteri dapat menghasilkan enzim
protease yang mampu mendegradasi kasein menjadi asam amino dan peptida. Adanya aktivitas
enzim yang berbeda nilainya setiap isolat kemungkinan disebabkan oleh setiap jenis
mikroorganisme menghasilkan enzim yang berbeda jumlah dan urutan asam amino pembentuk
enzim tersebut (Saidah, 2014).

Bakteri proteolitik merupakan sekelompok bakteri yang mempunyai kemampuan untuk

memecah protein dengan memutus ikatan peptida pada protein tersebut. Bakteri proteolitik
terdiri atas banyak jenis misalnya E. coli, Klebsiella dan Pseudomonas. Kelompok bakteri
tersebut mampu menghasilkan enzim protease. Secara umum enzim protease dibedakan
menjadi dua kelompok yaitu proteinase (mengkatalis hidrolisis molekul protein menjadi
peptida) dan peptidase (menghidrolisis fragmen peptida menjadi asam amino) (Noviasari,
2013).

Pada praktikum ini bakteri disuspensikan ke dalam media TSB. Tujuan dari penggunaan
media media TSB adalah agar berbagai bakteri yang terkandung dapat keluar lebih teliti. Media
Trypticase Soy Broth adalah media umum yang digunakan untuk isolasi pertumbuhan
mikroorganisme yang telah diperkaya berbagai nutrisi sehingga dapat mendorong pertumbuhan
mikroorganisme menjadi lebih teliti dan beragam. Komposisi dari media TSB adalah 20 g/L
pepton, 2,5 g/L glukosa, 5g/L NaCl dan 2,5 g/L K 2HPO4 (Tito, 2014). Untuk menguji suatu
biakan bakteri menghasilkan enzim protease ekstraseluler, maka bakteri tersebut harus
ditumbuhkan pada medium yang mengandung kasein yaitu Skim Milk Agar. Kasein merupakan
salah satu jenis potein. Hidrolisis kasein digunakan untuk memperlihatkan aktivitas hidrolitik
protease yang memutuskan ikatan peptida CO-NH, yang ditunjukkan dengan adanya zona
bening disekeliling pertumbuhan bakteri. Hasil bagi diameter tersebut dinyatakan sebagai
aktifitas protease secara relatif. Besar kecilnya diameter zona menunjukkan konsentrasi dan
aktivitas enzim yang dihasilkan (Hanafiarti, 2015).

Nilai aktivitas enzim yang berbeda dipengaruni beberapa faktor yang mempengaruhi kinerja
isolat bakteri proteolitik dalam menghasilkan protease. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH,
suhu, konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat. Pengaruh aktivator, inhibitor dan kofaktor
dalam beberapa keadaan juga merupakan faktor - faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim.
Adanya perbedaan pada diameter zona jernih yang dihasilkan setiap isolat bakteri disebabkan
karena kemampuan bakteri yang berbeda – beda dalam memproduksi enzim protease sehingga
nilai aktivitas yang dihasilkan berbeda pada tiap koloni (Karina, dkk. 2016).
 V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Untuk mengetahui daya hidrolisis dari bakteri proteolitik dilakukan dengan menanam koloni
pada media SMA dengan menggunakan paper disk, hasil pengamatan yang diperoleh berupa
ada atau tidaknya daerah bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram yang menunjukkan
zona hidrolisis bakteri. Pada praktikum ini didapatkan koloni bakteri pada petridish ke-1 dan
petridish ke-2 memiliki rata – rata diameter sebesar 0,16 cm dan 0,15 cm. Adanya perbedaan
pada diameter zona jernih yang dihasilkan setiap isolat bakteri disebabkan karena kemampuan
bakteri yang berbeda – beda dalam memproduksi enzim protease sehingga nilai aktivitas yang
dihasilkan berbeda pada tiap koloni.

5.2 Saran

Saran pada praktikum kali ini adalah sebaiknya pada saat melakukan isolasi bakteri ke
medium pertumbuhan di lakukan di laminar air flow agar kondisi menjadi lebih aseptis dan
tidak terjadi kontaminasi dari luar.
 DAFTAR PUSTAKA

Astuti, N. D. (2018). Efektivitas Obat Sirup Jahe Merah (Zingiber officinale var. rubrum) Terhadap
Potensi Pertumbuhan Bakteri Escherichia coli .Doctoral dissertation, FKIP UNPAS.

Badriyah, B. I., & Ardyati, T. (2013). Deteksi aktivitas proteolitik isolat bakteri asal ampas tahu
pada substrat bekatul. Biotropika: Journal of Tropical Biology, 1(3), 109-113.

Hanafiarti, D. 2015. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Penghasil Protease Dari Terasi Udang Rebon
(Mysis relicta). Skripsi. Fakultas Pertanian. Lampung : Universitas Negeri Lampung.

Inayatul Wa Ode , Sakti Imam Muchlissin,Ana Hidayati Mukaromah, Sri Darmawati, Stalis Norma
Ethica. 2018. Isolasi dan Identifikasi Molekuler Bakteri Penghasil Enzim Protease
Pseudomonas Stutzeri ISTD4 Dari Tempe Gembus Pasca Fermentasi 1 Hari. Seminar
Nasional
Edusainstek ISBN : 978-602-5614-35-4 FMIPA UNIMUS 2018
Karina, A. N., Hussain, D. R., Johannes, E., & Nawir, N. H. (2016). Isolasi dan Karakterisasi
Bakteri Proteolitik Dari Saluran Pembuangan Limbah Industri Tahu. Jurnal mediagro 2(3),
110-115

Kumalasari, D. (2014). Uji aktivitas antibakteri asam lemak hasil hidrolisis minyak mikroalga
Chlorella sp .Doctoral dissertation, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim.

Munifah, Ifah. 2013. Isolasi, Seleksi dan Identifikasi Bakteri Proteolitik serta Produksi Protease dari
Terasi Cirebon. Prosiding Seminar Nasional Inovasi Teknologi Pengolahan Produk dan
Bioteknologi Kelautan dan Perikanan-V. Jakarta : Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan. 87-96.

Noviasari, D. (2013). Pengaruh suhu dan pH terhadap aktivitas enzim protease dari Bacillus
mycoides yang ditumbuhkan dalam media campuran limbah cair tahu dan dedak. Doctoral
dissertation, Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim.

Puspitasari Fajar Diah, Maya Shovitri, Dannengah Dwianita Kuswytasari. 2012. Isolasi dan
karakterisasi Bakteri Aerobproteolitikdari Tangki Septik. JURNAL SAINS DAN SENI ITS
Vol. 1, No. 1, (Sept. 2012) ISSN: 2301-928
Saidah, A. N. 2014. Isolasi bakteri proteolitik termofilik dari sumber air panas pacet Mojokerto

dan penguji aktivitas enzim protease. Doctoral dissertation, Universitas Islam Negeri
 Maulana Malik Ibrahim.

Wachidah Istianah , 2016. Pemanfaatan Umbi Gadung dan umbi Uwi sebagai Media Alternatif

Substitusi Nutrient Agar (Na) untuk Pertumbuhan Bakteri. Program Studi Pendidikan
Biologi

fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta

 LAMPIRAN

Gambar 1. Mengambil koloni Gambar 2. Menumbuhkan Gambar 3. Bakteri yang

bakteri dengan menggunakan bakteri pada media TSB. ditumbuhkan pada media TSB
jarum ose. sebelum diinkubasi.

Gambar 4. Perbandingan Gambar 5. Membagi cawan Gambar 6. Mencelupkan paper

media TSB yang ditumbuhi petri menjadi empat bagian disk steril ke dalam media
koloni dan yang tidak dengan spidol. TSB.
ditumbuhi.
Gambar 7. Meletakkan paper Gambar 8. Media SSA yang Gambar 9. Zona hidrolisis
disk ke media SSA. telah diisi paper disk. yang dihasilkan isolat bakteri.