THE MESENCHYMAL STEM CELL SECRETOME: A NEW PARADIGM TOWARDS

CELL-FREE THERAPEUTIC MODE IN REGENERATIVE MEDICINE

Praveen Kumar L.a,1, Sangeetha Kandoib,1, Ranjita Misrab, Vijayalakshmi S.a, Rajagopal K.c,
Rama Shanker Vermab,

Sel Punca Mesenkimal: Paradigma baru menuju bebas sel mode terapi dalam kedokteran
regenerative

Abstrak
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) atau sel punca mesenkimal telah terbukti menjadi pilihan yang
menjanjikan untuk terapi berbasis sel. Potensi terapeutik MSC terhadap perbaikan jaringan dan
penyembuhan luka pada dasarnya didasarkan pada efek parakrin sel. Sejumlah studi pra-klinis
dan klinis MSC telah memberikan hasil yang menjanjikan. Selanjutnya, sel-sel ini telah terbukti
relatif aman untuk aplikasi klinis. MSC didapatkan dari berbagai tempat di dalam tubuh
termasuk sumsum tulang, jaringan adiposa, Wharton’s Jelly dari tali pusat dll., memperlihatkan
sel yang serupa dengan profil immunophenotypic. Namun, ada banyak bukti yang menunjukkan
bahwa MSC mengeluarkan berbagai molekul aktif secara biologis seperti faktor pertumbuhan,
kemokin, dan sitokin. Meskipun ada kesamaan di dalam immunophenotype, sekretoma dari MSC
tampaknya bervariasi tergantung pada usia host dan tempat sel berada. Jadi, profil berbasis
proteomik menunjukkan bahwa populasi MSC yang berbeda juga memiliki potensi terapi yang
berbeda. Analisis sekretoma menunjukkan pengaruhnya pada berbagai proses biologis seperti
angiogenesis, neurogenesis, perbaikan jaringan, imunomodulasi, penyembuhan luka, anti-fibrotik
dan anti-tumor untuk pemeliharaan dan regenerasi jaringan. Padahal terapi berbasis MSC sudah
telah terbukti relatif aman, dari sudut pandang klinis, penggunaan infus bebas sel dapat dihindari
untuk terapi. Memahami populasi sekretoma MSC in-vitro dengan analisis media yang sesuai
dapat memungkinkan kita untuk mengevaluasi kegunaannya sebagai pilihan terapi baru.
Literatur ini akan fokus pada akumulasi bukti yang mengarah ke terapi potensi media terkondisi,
baik dari studi pra-klinis dan klinis. Akhirnya, ulasan ini akan ditekankan pentingnya membuat
profil media yang sesuai untuk menilai potensinya terhadap terapi bebas sel.
1. Pendahuluan
Sel punca telah diposisikan di puncak hierarki perkembangan karena kemampuan
sel punca untuk memperbarui diri dan berdiferensiasi menjadi berbagai sel [1]. Sifat
tersebut membuat sel punca sebagai lini terdepan sebagai terapi baru untuk mengobati
sejumlah penyakit yang tidak dapat disembuhkan terkait gaya hidup terutama genetik.
Mereka memainkan peran penting dalam menjaga homeostasis jaringan dengan
mengganti sel sebagai respons terhadap pergantian fisiologis sel dalam suatu organisme.
Selain itu, mereka juga memfasilitasi peran dalam mengganti sel yang rusak dengan sel
yang sehat untuk meningkatkan fungsi jaringan yang rusak. Dengan demikian, sel-sel
punca meningkatkan kapasitas fungsional suatu organ yang kehilangan sel dan
mengalami kerusakan jaringan. Sel punca diklasifikasikan sebagai sel embrionik atau sel
somatik yang diperoleh dari massa sel bagian dalam blastokista. Sel punca somatik,
diperoleh dari sumber peri-natal atau pasca-kelahiran. Sel punca somatik termasuk
hematopoietic stem cells (HSC) atau sel induk hematopoietik dan sel punca mesenkimal
(MSC) [2]. Penggunaan sel somatik dalam terapi klinis juga tidak digunakan oleh
pertimbangan etis dan tidak jua oleh masalah keamanan yang berkaitan dengan
pembentukan teratoma dan kelainan kromosom [3,4]. MSC memiliki kapasitas
imunomodulator yang memungkinkan penggunaannya dalam pengaturan alogenik [5].
MSC juga menampilkan sifat reparatif jaringan selain anti-tumorigenik, anti-fibrotik,
anti-apoptosis, anti-inflamasi, pro-angiogenik, pelindung saraf, efek anti-bakteri dan efek
chemo-attractive [6,7]. Semua sifat ini yang dimiliki MSC menarik minat para klinis
ilmuwan dan penelitian klinis mulai untuk dilakukan.
Keberhasilan transplantasi MSC berhubungan dengan perluasan sel in vitro skala
besar yang memenuhi syarat terapeutik di bawah Good Manufacturing Practice (GMP),
meskipun dosis sel terapi standar MSC, rute pemberian dan jumlah dosis yang masih
dioptimalkan. Meskipun ekspansi MSC telah banyak digunakan, beberapa masalah masih
perlu diperhatikan. Jumlah populasi yang dibutuhkan untuk mendapat jumlah MSC untuk
terapi tergantung pada jumlah awal MSC yang layak digunakan. Karena itu, mencapai
jumlah yang cukup dapat dikenakan sejumlah besar populasi doublings dengan
kemungkinan stemness attenuation dan cellular senescence. Selanjutnya, untuk
menghindari risiko reaksi imunologis dan menghilangkan penularan penyakit zoonosis
 karena penggunaan fetal bovine serum (FBS), MSC sekarang diperbanyak dalam media
bebas xeno [8]. Data penelitian klinis berdasarkan kultur MSC dengan FBS dibandingkan
dengan data penelitian kultur MSC pada media bebas xeno belum dapat dijelaskan.
Terdapat juga berdepatan tentang penurunan engraftment dan homing ability, tingkat
kelangsungan hidup yang buruk dan gangguan kemampuan diferensiasi MSC yang
dicangkokkan secara in vivo yang menyebabkan terbatasnya potensi terapetik sel tersebut
[9]. Karena masalah yang disebutkan di atas yang terkait dengan Terapi berbasis MSC,
terapi bebas sel menggunakan MSC secretome bisa berfungsi sebagai pilihan futuristik
yang lebih baik di bidang kedokteran regeneratif.
Belakangan ini, sudah terdapat banyak bukti yang mendukung efektivitas MSC-
conditioned medium (CM) atau sekretom dalam studi penilaian potensi terapeutik untuk
indikasi seperti osteoartritis, cedera tulang belakang, penyakit kardiovaskular, cedera
mukosa lambung, colitis dll [10–13]. MSC-CM mengandung sejumlah besar sitokin dan
beragam faktor bioaktif yang disekresikan oleh MSC. Karakterisasi MSC-CM penting
karena potensi terapeutiknya telah dikaitkan dengan sitokin dan aktivitas parakrin yang
menyertainya [14]. Analisis molekuler pada MSC-CM dapat mengidentifikasi kunci
terapi komponen aktif yang dapat dimurnikan dan digunakan lebih lanjut. Selanjutnya,
akan ada ketertarikan untuk memahami mekanisme komponen kunci tersebut dapat
memberikan efek terapeutik. Oleh karena itu, fokus utama ulasan ini adalah untuk
merangkum beberapa eksperimental, praklinis dan studi klinis, di mana MSC sekretom
diuji sebagai opsi perawatan dengan tujuan yang lebih besar untuk mengembangkan
terapi berbasis cell-free atau bebas sel.

2. Sel Punca Mesenkimal atau Mesecnhymal Stem Cells (MSC)

MSC adalah sel induk dewasa non-hematopoietik, multipoten awalnya didapatkan
dari sumsum tulang dan diberi nama colony forming unit-fibroblast (CFU-Fs) [15].
Penelitian populasi MSC yang dilakukan selama empat dekade menghasilkan berbagai
jaringan dewasa dan peri-natal termasuk bone marrow (BM) atau sumsum tulang,
adipose tissue (AT) atau jaringan adiposa, darah tepi, darah menstruasi, pulpa dari gigi
desidua, umbilical cord tissue (UCT) atau jaringan tali pusat, wharton’s jelly (WJ), darah
tali pusat, placenta tissue (PT) atau jaringan plasenta, ASI, dll. menggunakan protokol
yang berbeda [16-18]. Berbagai peneliti telah berhasil mendapatkan derajat klinis MSC
menggunakan media bebas xeno dan dengan memanfaatkan suplemen manusia seperti
platelet lysate (PL), umbilical cord blood serum (UCBS) atau serum darah tali pusat,
serum antibodi manusia, dll. untuk mencegah penularan penyakit zoonosis dan
menghindari reaksi imunologis karena suplemen xenogenik (FBS) [19-21]. Namun,
sebagian besar pra-klinis dan studi klinis yang dilaporkan sampai sekarang didasarkan
pada penggunaan kultur MSC dengan FBS [22]. Meskipun sebagian besar dari ini
penelitian telah menunjukkan MSC aman dan efektif, setidaknya dalam satu MSC studi,
keterlambatan pertumbuhan diamati pada satu dari enam pasien dengan osteogenesis
imperfecta dan ini dikaitkan dengan serangan imunologis karena antigen asing yang
diinternalisasi dalam MSC yang ditransplantasikan [23].
Internal Society for Celullar Therapy (ISCT) pada tahun 2005 telah mentetapkan
definisi MSC dengan kriteria minimal berikut ini (a) harus plastic-adherent dan
fibroblastoid di bawah standar kondisi kultur (b) harus menunjukkan ekspresi
immunophenotypic CD73, CD90, CD105 dan kurang ekspresi pada permukaan marker
dari CD34, CD45, CD14, CD19, CD79a, CD31 dan HLA-DR (c) dan terakhir, harus
memiliki kapasitas untuk berdiferensiasi in vitro menjadi adiposit, osteosit, dan
kondroblas [24]. Studi telah menunjukkan bahwa MSC yang berasal dari jaringan
berbeda menunjukkan heterogenitas di dalam karakteristik biologis dan fitur
fungsionalnya karena perbedaan dalam kemampuan proliferatif, potensi diferensiasi garis
keturunan, kemampuan pro-angiogenik, dan kapasitas imunomodulator meskipun
terdapat kesamaan fenotipik [25]. Misalnya, MSC berasal dari jaringan janin seperti UCT
telah terbukti menunjukkan potensi proliferasi yang lebih tinggi bersama dengan
imunogenisitas yang lebih rendah dibandingkan dengan MSC dari orang dewasa jaringan
seperti BM dan AT [26]. Selain itu, MSC berasal dari villi chorionic plasenta dan BM
menunjukkan karakteristik pro-angiogenik yang unggul dibandingkan dengan MSC yang
berasal dari AT dan UCT [27]. Berdasarkan studi ini, ISCT mengajukan kriteria
tambahan untuk mendefinisikan MSC pada 2016 [28]. Juga disarankan agar dilakukan tes
tambahan untuk mengetahui fitur biologis dan fungsional MSC agar hasil yang konsisten
dapat diperoleh secara klinis. Pengujian / analisis ini dapat meliputi:
• Tes potensi untuk produk terapi seluler
 • Tes analitik untuk mengukur potensi
• Uji matriks
• Tes imunomodulasi
• Plastisitas imun
• Analisis RNA kuantitatif dari produk gen terpilih
• Analisis aliran sitometri dari markers yang relevan secara fungsional
• Analisis sekretoma

Gambar 1. Representasi
bergambar dari strategi terapi berbasis sel dan bebas sel untuk penggunaan klinis. Hasil dan ekspansi kultur in vitro
dari MSC diperoleh dari lokasi anatomi yang berbeda menghasilkan produk-produk terapi yang berpotensi seperti
MSC dan MSC-CM yang keduanya kaya akan faktor pertumbuhan, sitokin, interleukin, dll. Aplikasi terapeutik
potensial dari MSC dan MSC-CM adalah terapi berbasis sel dan bebas sel.
3. Karakteristik Terapetik Sel Punca Mesenkim
Manfaat terapeutik MSC telah dibuktikan dengan banyak penelitian
eksperimental, pra-klinis dan klinis menggunakan populasi nonklonal [29]. MSC telah
dianggap sebagai alat yang efektif untuk perbaikan jaringan karena kemampuan MSC
untuk bermigrasi ke lokasi cedera dan kapasitas mereka untuk menekan respons inflamasi
dengan demikian dapat memperbaiki dan menyembukan luka [30]. Penyembuhan luka
dan sifat untuk memperbaiki jaringan dikaitkan dengan faktor bioaktif yang disekresikan
oleh MSC yang berkontribusi pada aktivitas parakrin [31]. MSC juga mencegah kematian
sel dengan mengurangi ekspresi faktor pro-apoptosis (Bax, Caspase-3) dan meningkat
kegiatan anti-apoptosis (Bcl-2) serta memulihkan lingkungan mikro jaringan yang rusak
[32]. Dalam berbagai percobaan pra-klinis, MSC ditransplantasikan ke hewan untuk
menghasilkan jaringan mesodermal seperti tulang, otot, tulang rawan dengan diferensiasi
untuk memperbaiki jaringan yang rusak. Kemampuan pembaruan diri MSC dan potensi
diferensial berkontribusi dalam homeostasis jaringan. Beberapa karakteristik MSC yang
membuat MSC ideal untuk digunakan sebagai terapi adalah kemampuan mereka untuk
masuk kedalam tempat jaringan yang cedera, engraftment dan fungsi imunosupresif
seperti yang dihasilkan oleh imunosit. Hal-hal tersebut menjadikan MSC semakin
digunakan untuk dilakukan uji klinis. Dikarenakan ekspresi molekul MHC kelas II yang
rendah dan kurangnya ekspresi molekul co-stimulator seperti CD80 dan CD86, MSC
dapat berinteraksi dan menghambat proliferasi beberapa jenis sel imun (sel T, sel B, dan
sel pembunuh alami) sehingga hanya berefek imunogenik ringan. Imunogenisitas yang
rendah mengartikan bahwa MSC dapat digunakan dalam pengaturan alogenik. Kapasitas
imunomodulator dari MSC yang membuat mereka kebal telah dibuktikan in vitro dengan
reaksi limfosit campuran satu arah dan dua arah mixed lymphocyte reaction (MLR)
dimana MSC menghambat terstimulasinya proliferasi sel T alogenik [33]. Beberapa studi
telah menunjukkan mediasi aktivitas immumodulatori dan anti-inflamasi MSC melalui
pengeluaran beberapa sitokin seperti prostaglandin E2 (PGE2), HLAG-5, indoleamine 2,
3-dioxygenase (IDO), tumor necrosis factor β1 (TGF-β1) dan interleukin (IL) 13 [34,35].
4. Terapi Berdasarkan Sel
MSC autologous dan alogenik telah digunakan dalam berbasis sel terapi untuk
memperbaiki dan mengganti jaringan yang rusak dan meningkatkan fungsi jaringan dan
organ atau untuk melakukan imunomodulasi melalui sistemik [36]. Penggunaan MSC,
didapatkan dari berbagai sumber untuk terapi berbasis sel diuraikan pada Gambar. 1.
Keamanan penggunaan MSC dalam terapi berbasis sel sangat didukung oleh fakta bahwa
resepien yang menerima MSC tidak memiliki tumor. Hal ini meningkatkan penggunaan
aplikasi MSC sehingga menghasilkan sejumlah uji klinis untuk berbagai kondisi klinis.
Penelitian yang sedang berlangsung dan uji coba yang lengkap telah terdaftar di
www.clinicaltrials.gov, sebuah basis data dari Institut Kesehatan Nasional AS, dengan
mayoritas uji coba yang melibatkan penggunaan BM-MSC [37]. Karakteristik
multifungsi MSC dan ketersediaannya dari sejumlah sumber menyebabkan lebih dari 700
uji klinis yang terdaftar pada Januari 2019. Banyak dari penelitian ini didasarkan pada
penggunaan MSC untuk kondisi terminal atau sebagai alternatif terapi konvensional di
Indonesia untuk meningkatkan kualitas hidup dan untuk memperpanjang kelangsungan
hidup pasien. Beberapa indikasi termasuk penyakit graft versus host disease (GVHD),
sklerosis sistemik, gagal hati, diabetes, penyakit parkinson idiopatik (PD), cedera tulang
belakang, iskemia tungkai, osteoartritis sendi lutut, distrofi otot Duchenne, kelainan
jaringan tulang rawan, kardiovaskular, keganasan hematologis, penyakit autoimun, dll
[38]. Meskipun hasil yang menggembirakan dari uji coba ini, MSC masih belum
dianggap sebagai standar perawatan di RS. Terapi sel berbasis MSC masih belum dapat
diterapkan dengan tidak adanya standar protokol untuk isolasi, kurangnya kejelasan
tentang sumber yang ideal untuk indikasi yang berbeda, tidak adanya protokol standar
untuk ekspansi vivo, populasi klon, kondisi kultur, dan tidak adanya kejelasan tentang
mode infus, rute pengiriman yang efektif, dosis optimal infus, frekuensi pemberian, dll
[39,40].

5. Sekretoma sel punca mesenkimal

MSC diketahui mengeluarkan spektrum faktor bioaktif pelindung (sekretoma)
biasanya diklasifikasikan sebagai sitokin, kemokin, sel adhesi, mediator lipid, IL, faktor
pertumbuhan (GF), hormon, eksosom, mikrovesikel, dll. Faktor-faktor ini telah
dipertimbangkan sebagai protagonis untuk berpartisipasi dalam perbaikan dan regenerasi
jaringan melalui aksi parakrin yang dapat memediasi pensinyalan antar sel [41]. Molekul
yang disekresikan didefinisikan sebagai sekretoma atau CM yang berperan dalam
mempengaruhi komunikasi antara sel dan jaringan di sekitarnya untuk memediasi fungsi
biologis. Hal ini menarik minat peneliti terhadap sekretoma MSC dapat berpotensi dalam
terapi bebas sel. Hal yang penting untuk keberhasilan terapi bebas sel semacam itu adalah
identifikasi, analisis dan penjelasan mekanisme dari masing-masing komponen. Setelah
ekspansi in vitro dari MSC di laboratorium, sel cenderung melepaskan serangkaian faktor
bioaktif ke dalam media kultur yang sekarang disebut sebagai media terkondisi atau MSC
secretome. CM dengan faktor bioaktif dapat memberikan manfaat pada penerima yang
dapat dianggap sebagai pelindung jaringan (anti-apoptosis, anti-inflamasi, anti-jaringan
parut), imunomodulator, angiogenik atau anti-tumorigenik [42-44].
Menariknya, CM yang diperoleh dari Wharthon’s Jelly-Mesencimal Stem Cell
(WJ-MSC) telah terbukti cryopreservative bersama dengan DMSO dan FBS dan
meningkatkan survival CD34 + dengan melindungi integritas membran sel selama
pembekuan. Ini juga merangsang mitosis, pasca pencairan, untuk ekspansi sel CD34 +
ex-vivo [45]. Faktor-faktor dalam MSC-CM bisa disintesis dan dapat digunakan untuk
terapi bebas seluler dengan efek menguntungkan yang diperoleh melalui efek parakrin
pada sel dan jaringan dalam kedua kasus. Pemberian campuran rekombinan sitokin
intravena yang meniru komponen MSC manusia telah mengungkapkan peningkatan
proliferasi dan diferensiasi osteogenik dari BM-MSC tikus [46]. Representasi skematis
menggambarkan koleksi MSC-CM dari kultur MSC dan aplikasinya dalam terapeutik
bebas sel diuraikan pada Gambar. 1. Selanjutnya, harus ditekankan bahwa sintesis faktor
bioaktif ini bisa mahal dan mungkin tidak mencerminkan efek pleiotropik yang
mendalam seperti pada kasus MSC-CM. Jelas, mengingat komposisinya, MSC-CM harus
mengatur sinyal dengan lebih baik daripada apa yang dapat dipengaruhi oleh administrasi
sitokin tunggal [47,48].

a. Strategi Sebelum Pengondisian untuk Merangsang Sekresi MSC

Memanipulasi kultur MSC dengan pra-pengondisian fisiologis, pra-
pengondisian molekul menggunakan protein, manipulasi genetik, pra-pengkondisian
 farmakologis, perampasan serum, prakondisi fisik dapat meningkatkan sekresi faktor
terapeutik ke dalam media kultur [49,50]. Juga, kekurangan serum dalam kultur MSC
meningkatkan sekresi prosurvival dan faktor angiogenik termasuk faktor
pertumbuhan endotel vaskular A (VEGF-A), angiopoietin (ANGPTs), insulin-like
growth factor-1 (IGF-1) dan faktor pertumbuhan hepatosit (HGF), sehingga
mendukung angiogenesis [51]. Media terkondisi tikus BM-MSC ditransduksi dengan
gen GATA-4 yang dinyatakan secara kondisional (G-CM) disukai angiogenesis dan
migrasi di sel endotel vena umbilikal manusia (HUVEC) seperti yang ditunjukkan
oleh peningkatan kapiler pembentukan tabung dan jumlah struktur spheroid tumbuh
bila dibandingkan dengan tikus yang ditransduksi vektor bukan-transduksi atau nol
MSCs-CM [52]. Analisis kuantitatif G-CM oleh ELISA terungkap secara signifikan
level IGF-1 dan VEGF-A yang lebih tinggi. Pra-pengkondisian fisiologis strategi
menundukkan tikus AT-MSC ke hipoksia (HPO) kondisi selama 48 jam
menghasilkan peningkatan sekresi beberapa sitokin seperti VEGF, penghambat
jaringan metalloproteinases-1 (TIMP-1), CINC-1, LIX dan Chemokine (motif C-C)
ligand 20 (CCL-20) dibandingkan untuk kondisi normoxic (Nor). Peningkatan level
CCL-20 dalam HPO-CM menyumbang peningkatan regulasi sumbu COX2-PGE2
yang dimediasi oleh fosforilasi dalam jalur ErK1 / 1-MAPK, dengan demikian
mempromosikan peningkatan angiogenesis dan epitelisasi ulang in vitro dan in model
vivo dari cedera mukosa lambung [10]. MSC berbudaya in vitro prima dengan TNF-α
dan IFN-γ (masing-masing 50 ng / ml) selama 24 jam menunjukkan 15- dan 60-lipat
peningkatan sekresi protein imunomodulator IL-6 dan IDO masing-masing,
dibandingkan dengan kondisi non-stimulasi [11].

b. Analisis protein
Meskipun menampilkan karakteristik fenotip yang serupa, telah dilaporkan
bahwa MSC berbeda secara signifikan dalam pola ekspresi gen dan menunjukkan
heterogenitas dalam profil sekretoma juga disebabkan karena perbedaan oleh sumber
MSC, usia host, dan media kultur[53,54]. Perbedaan seperti dalam fenotipis MSC
dalam populasi telah menjadi pertimbangan ulang pada kriteria dasar yang
mendefinisikan MSC. Jelas, profil proteomik dari MSC harus ditambahkan ke kriteria
yang awalnya digariskan oleh ISCT sebagai cara mengidentifikasi sel MSC.
Meskipun banyak pertanyaan mengenai komponen kompleks MSC-CM tetap tidak
terselesaikan, upaya sedang dilakukan untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi
sekretoma dari berbagai sumber MSC. Karakterisasi sekresi sekretoma MSC yang
berbeda harus membantu mengidentifikasi utilitas masing-masing vis-à-vis kondisi
klinis yang berbeda. Proses dari menentukan utilitas terapi dari faktor-faktor dalam
MSC sekretoma berdasarkan identifikasi komponen protein oleh proteomic diikuti
oleh analisis data secara skematis diuraikan pada Gambar. 2. Serum atau suplemen
pertumbuhan dalam media kultur dapat tumpang tindih dengan dan mengganggu
deteksi dan analisis protein yang dikeluarkan oleh Gambar. 2. Diagram skematik
yang menggambarkan persiapan MSC-CM dan metode identifikasi protein untuk
menilai kegunaan terapeutik. Beragam langkah-langkahnya meliputi (a) budaya MSC
sampai 70-80% pencapaian dicapai (b) dilakukan MSC berbudaya untuk berbagai
strategi pra-kondisi seperti hipoksia, manipulasi genetik, paparan senyawa
farmakologis, serum kekurangan selama 24-48 jam menyebabkan pelepasan faktor
pertumbuhan, sitokin, interleukin, dll ke dalam medium. Seperti media yang
terkondisi faktor terlarut pada konsentrasi rendah dikumpulkan dan selanjutnya
dipekatkan untuk identifikasi protein (c) Analisis protein yang melibatkan identifikasi
faktor yang disekresikan melalui pendekatan yang berbeda seperti shot-gun metode
dan uji imunologis (d) menentukan utilitas fungsional dari molekul disekresikan
dengan mengevaluasi data menggunakan alat bioinformatika dan oleh analisis jalur
untuk menetapkan penggunaan terapi terbaik. MSC berbudaya. Karenanya, beberapa
komponen yang dikeluarkan di bagian bawah konsentrasi nanogram untuk pikogram
dapat ditutup selama proteomic profil karena adanya suplemen pertumbuhan dalam
serum. Untuk menghindari masalah ini, disarankan untuk membiakkan sel dalam
serum bebas media selama 24-48 jam untuk mencapai pertemuan. Sejumlah metode
adalah tersedia untuk mengidentifikasi komponen protein dalam MSC-CM atau
dihabiskan media. Namun, mengidentifikasi semua protein yang dikeluarkan adalah
sebuah tantangan mengingat bahwa mereka hadir dalam konsentrasi yang sangat
rendah mulai dari pikogram atau kurang hingga beberapa nanogram per mL. Karena
itu sangat penting untuk mengkonsentrasikan sampel baik dengan liofilisasi atau
 dengan ultrafiltrasi sebelum proses identifikasi [55]. Dua pendekatan proteomik
kontemporer yang tersedia saat ini untuk mengkarakterisasi MSC-CM didasarkan
pada shot-gun dan imunologi tes [56]. Tes imunologis menawarkan spesifisitas tinggi,
sensitivitas, dan reproduksibilitas terhadap berbagai protein yang dikenal. Protein ini
dapat dideteksi dan diukur melalui antibody teknik seperti enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA), Luminex array berbasis manik antibodi, microarray,
western blotting, dan susunan antibodi sitokin. Pendekatan proteomik berbasis
senapan adalah lebih bersifat eksplorasi tetapi memfasilitasi dalam mengidentifikasi
apa pun protein rahasia yang tidak diketahui dan unik. Peran protein unik tersebut
dapat ditentukan dengan mengakses basis data yang tersedia untuk umum dan
menggunakan alat bioinformatika dan melakukan analisis jalur. Berbeda teknik yang
digunakan dengan pendekatan shotgun adalah metode berbasis gel seperti 2-D
elektroforesis gel (2-DE), kromatografi cair dengan tandem spektrometri massa (LC-
MS / MS), pelabelan isotop stabil oleh asam amino dalam kultur sel (SILAC),
desorpsi / ionisasi laser berbantuan matriks-waktu penerbangan (MALDI-TOF), MS /
MS, massa waktu penerbangan quadrupole spektrometri (QTOF-MS) dll [57-59].
Beberapa protein terkenal dengan utilitas terapeutik, yang diperoleh dari sumber
MSC yang berbeda dan diidentifikasi menggunakan pendekatan yang berbeda
tercantum dalam Tabel 1.

6. Terapi Tanpa Sel

Sejumlah besar protein dengan potensi terapeutik di MSC-CM telah memperluas
penggunaan MSC untuk terapi bebas sel [60]. Penelitian baru ini memberikan beberapa
keunggulan utama dibandingkan teeapi berbasis sel: (a) menggunakan protein sebagai
pengganti sel sebagai pilihan terapi baru dalam kedokteran regeneratif (b) CM dapat
disimpan tanpa cryopreservatif seperti DMSO dalam periode yang relatif lama (c)
persiapan CM lebih ekonomis karena dapat diproduksi secara massal dari populasi MSC
yang tersedia di bawah cGMP (d) evaluasi CM untuk keamanan dan kemanjuran akan
lebih banyak sederhana dan analog dengan agen farmasi konvensional [61]. Percobaan
klinis dengan pemberian sitokin tunggal telah dilakukan untuk pengobatan penyakit
kardiovaskular, penyakit degeneratif, dll., tetapi hasilnya belum menggembirakan [48].
Hal ini mengarah pada saran bahwa untuk hasil klinis yang optimal akan lebih tepat jika
menggunakan beberapa sitokin / faktor pertumbuhan yang kemudian bertindak secara
sinergis. Saran di atas sangat sejalan dengan pendapat kami bahwa sekretoma MSC,
dengan terapi yang efektif komponen, bisa menjadi kandidat yang cocok untuk terapi
bebas sel. Dalam beberapa hal, terapi berbasis MSC masih mengalami masalah seperti
kelangsungan hidup sel yang buruk dalam host pasca transplantasi, diferensiasi yang
buruk dalam host, penyerapan di situs non-target dan engraftment yang buruk dalam
jangka panjang. Singkatnya, ada justifikasi yang signifikan untuk mencari alternatif terapi
berbasis sekretoma MSC.
Baik transkriptom dan proteom berbeda secara signifikan dalam populasi MSC
yang berasal dari lokasi anatomi yang berbeda dan profil-profil ini juga dipengaruhi oleh
usia individu. Profil secretome adalah heterogen [54]. Peningkatan sekresi IL6 oleh MSC
yang diperoleh dari donor dewasa menyebabkan penurunan kapasitas untuk mendukung
sel induk dan progenitor hematopoietik (HSPC) dan gangguan homeostasis HSPC [62].
Dalam skenario seperti itu, dapat dikatakan bahwa MSC dengan sekretoma yang sesuai
tanda tangan dapat dipilih, dengan mengingat titik akhir terapi. Studi berbasis ELISA dari
human fetal secretome (HFS) dan human adult secretome (HAS), berasal dari jaringan
janin manusia yang dikultur dan kultur BM-MSC dari individu dewasa masing-masing,
menunjukkan secara signifikan tingkat Leukemia inhibitorory factor (LIF) yang lebih
tinggi, biomarker batang dan Faktor pertumbuhan turunan trombosit (PDGFA), suatu
proliferatif dan penanda induksi osteogenik pada HFS dibandingkan dengan HAS.
Selanjutnya, peningkatan kadar laminB1 (LMNB1) terlihat pada HFS dibandingkan
dengan HAS menunjukkan bahwa yang terakhir diperoleh dari populasi MSC yang lebih
tua [63]. Sebuah studi yang membandingkan CM sumsum tulang, jaringan adiposa dan
MSC perivaskular tali pusat manusia (HUCPVC) oleh LC – MS / MS mengindikasikan
adanya agen anti-apoptosis dalam CM berasal dari BM dan HUCPVC MSC sedangkan
CM diperoleh dari HUCPV dan AT MSC memberikan perlindungan terhadap
eksitotoksisitas [53].
Eksploitasi sekretoma MSC untuk tujuan terapeutik akan didasarkan pada (a)
pemahaman farmakokinetik faktor secretome untuk menilai retensi pasca transplantasi,
(b) produksi MSC-CM dalam cGMP, (c) penentuan rute administrasi yang optimal, (d)
penetapan volume dan durasi dosis dan (e) data positif dari uji klinis manusia. Data dari
studi pra-klinis dan uji klinis menunjukkan potensi kegunaan MSC-CM yang diperoleh
dari sumber MSC berbeda menunjukan hasil terapetik yang berbeda. Suntikan HFS
subkutan yang ditunda dalam matrigel (50 ug / mL) tidak memperoleh pembentukan
tumor selama periode observasi 1 bulan pada tikus [63]. Data ini mendukung pandangan
bahwa tidak ada masalah keamanan yang akan ditemui selama menggunakan MSC-CM.
Bagaimanapun, mengingat bahwa penggunaan MSC dalam uji klinis telah berulang kali
terbukti aman, hal tersebut mengharapkan sekretoma MSC menjadi tumorigenik. Induksi
maksimal osteogenesis diamati pada kasus BM-MSC tikus yang dirawat dengan MSC-
CM janin manusia (hFMSC-CM) yang mengandung protein pada konsentrasi 100 μg / μl.
Induksi osteogenik jelas ditunjukkan oleh deteksi simpanan kalsium melalui pewarnaan
alizarin red S.
Sejumlah penelitian in vitro telah berupaya mengidentifikasi potensi efek
terapeutik MSC-CM dengan memperlakukan garis sel dengan yang sama. CM dari sel
induk mesenchymal gingiva manusia (hGMSCs) memberikan perlindungan yang
signifikan terhadap cedera awal yang disebabkan kematian sel di pada jalur sel NSC-34
(sel mirip motorik neuron). Perlindungan saraf itu dikaitkan dengan adanya faktor
pertumbuhan saraf faktor neurotropic (NGF), NT3 dan sitokin anti-inflamasi IL-10 dan
adanya faktor pertumbuhan (TGF-β) [65]. Pengobatan adenokarsinoma payudara (MDA-
MB-231), karsinoma ovarium (TOV-112D), dan osteosarcoma (MG-63) dengan 50%
media terkondisi dari sel induk WJ selama 48-72 jam memiliki efek penghambatan pada
pertumbuhan sel kanker ini yang kemudian menunjukkan penyusutan sel, blebbing dan
vakuola [66]. Menariknya, MSC dewasa tampaknya lebih imunogenik dari MSC janin.
Dengan menggunakan cara konvensional campuran reaksi limfosit diamati bahwa
proliferasi limfosit distimulasi oleh secretom hAMSC sedangkan hFMSC secretome tidak
mendapatkan respons yang sama [64].
7. Studi pra-klinis berdasarkan sekretoma MSC
Sejumlah studi pra-klinis telah menunjukkan potensi terapi MSC-CM untuk berbagai
penyakit seperti peradangan penyakit usus (IBD), model arthritis yang diinduksi antigen
(AIA), Penyakit Parkinson (PD) dll. Namun demikian, uji klinis untuk indikasi tersebut
perlu dilakukan untuk membangun kemanjuran terapi MSC-CM.
a. Aktivitas anti-inflamasi
Banyak penelitian telah melaporkan adanya faktor anti-inflamasi dalam
sekretome MSC yang dapat bermanfaat dan memberikan efek yang terlihat pada
hewan diabetes, radang usus akut, radang sendi, dll [12,67,68]. Sekali suntikan
intravena hAT-CM ke dalam streptozotocin (STZ) untuk mengobati tikus diabetes
meringankan rasa sakit neuropati diabetes dengan membangun keseimbangan Th1 /
Th2 dengan mempertahankan hipersensitifitas sensorik. Pengukuran sitokin dari
ganglia dorsal, saraf siatik dan sumsum tulang belakang tikus yang dirawat
membuktikan untuk pemulihan anti-inflamasi dan sitokin imunomodulator IL-1β, IL-
6 dan TNF-α ke tingkat basal setelah 1 minggu perawatan dengan hAT-CM.
 Peningkatan level IL-10 juga mengindikasikan adanya anti-inflamasi [67]. Injeksi
intraperitoneal MSC-CM ke dalam tikus C57BL / 6 setelah induksi kolitis
menyebabkan penurunan yang signifikan dalam peradangan usus besar dan
peningkatan berat dan panjang usus besar sehingga mengurangi indeks aktivitas
penyakit (DAI) dan tingkat kematian. Selanjutnya, kelenjar getah bening mesenterika
dan limpa tikus yang diinfuskan dengan MSC-CM membuktikan peningkatan kadar
sitokin anti-inflamasi IL-10 dan TGF-β dan mengurangi kadar sitokin pro-inflamasi
IL-17 yang mengkonfirmasi peran anti-inflamasi CM [12]. Begitu pula dengan injeksi
MSC-CM intraartikular terbukti efektif dalam mengurangi penyakit keparahan dan
kerusakan tulang rawan dalam model inflamasi yang diinduksi antigen radang sendi.
Tingginya tingkat IL10 dalam CM berkorelasi baik dengan respons anti-inflamasi

b. Aktivitas Anti-Fibrotik
Sekretoma MSC menunjukkan efek anti-fibrotik yang menyebabkan penurunan
akumulasi protein matriks ekstraseluler sehingga mengurangi pembentukan bekas luka.
Setelah induksi fibrosis hati pada tikus baik dengan thioacetamide atau dengan CCI4,
injeksi dari secretome UCMSC menghasilkan pengurangan area fibrotik dalam waktu 3
hari dan penurunan jumlah sel stellate hati yang mengekspresikan α- otot polos actin (α-
SMA). Analisis sekretome UCMSC menggunakan nano-chip-LC / QTOF-MS
mengungkapkan keberadaan susu fat globule EGF factor 8 (MFGE8), protein anti-
fibrotik yang diketahui mengatur ekspresi TGF-βR1 (mengubah faktor pertumbuhan β
type 1 receptor) pada tingkat mRNA dan protein, sehingga menurun aktivasi sel stellate
hati manusia [69].

c. Potensi diferensiasi untuk pemulihan fungsional

Kemungkinan faktor yang ada dalam MSC-CM dapat mendukung diferensiasi sel
dan dengan demikian memperbaiki jaringan yang rusak sebagai awal dari pemulihan
fungsional. Cangkok sel-sel induk saraf (NSC) dengan MSC-CM pada model tikus 6-
hydroxydopamine (6-OHDA) dari PD meningkatkan karakteristik survival dari NSC,
dihasilkan neuron dopaminergik, memediasi perbaikan kerusakan saraf dan
menghasilkan peningkatan kemampuan belajar dan memori [70]. Peningkatan
 diferensiasi osteogenik yang menandakan regenerasi tulang seiring dengan perbaikan
konsolidasi tulang diamati pada model tikus dengan gangguan osteogenesis setelah
penerapan sekretome hFMSC [64]. Infus sistematik 0,4 ml hATMSC-CM selama 30
hari dalam radiasi intra-villi pada tikus menghasilkan angiogenesis intra-vili oleh
perekrutan sel-sel progenitor endotel yang bersirkulasi dari sumsum tulang yang
mengarah ke pemulihan struktur mikrovaskular intravili yang cepat [71]. Aplikasi in
vivo MSC-CM yang mengandung IGF-1, VEGF dan TGF-β1 pada model tikus
dengan cacat tulang calvarial Wistar menghasilkan peningkatan regenerasi tulang
bersama dengan angiogenesis ketika dievaluasi oleh mikro-computed tomography
[72].

8. Studi Klinis Berdasarkan MSC Secretome

Kami melakukan pencarian menyeluruh untuk mengidentifikasi studi klinis
tentang penggunaan MSC-CM di www.pubmed.com. Sepengetahuan kami, disana hanya
dua tetapi lebih banyak studi seperti itu harus dimulai segera untuk memanfaatkan
manfaat terapeutik MSC-CM. Kedua studi klinis ini adalah dilakukan oleh kelompok
yang sama untuk menilai regenerasi tulang alveolar dan angiogenesis pada tulang yang
baru diregenerasi pada pemberian sekretome dari hMSC. Dalam laporan pertama beta-
trikalsium fosfat (β-TCP) atau atelocollagen sponge (ACS) yang bertindak sebagai
perancah direndam pada BM-MSC-CM selama 5 menit. Zat tersebut dicangkokkan ke
dalam delapan pasien (inklusif) (tiga pria dan lima wanita) yang membutuhkan
pembesaran tulang setelah peningkatan lantai sinus maksilaris (SFE) dan regenerasi
tulang terpandu (GBR). BM-MSC-CM yang memiliki IGF-1, VEGF, TNF-β1, dan HGF
di kisaran konsentrasi ratusan hingga ribuan pikogram permililiter menunjukkan potensi
osteogenik yang lebih besar dan menghasilkan regenerasi tulang alveolar yang sukses.
Tidak ada masalah keamanan yang ditemukan dan tidak ada komplikasi lokal dan
sistemik pasca engraftment. Selain itu, ACS-MSC-CM diserap lebih mudah dan
menghasilkan pembentukan tulang yang lebih padat dibandingkan dengan β-TCP-MSC-
CM seperti yang ditunjukkan oleh karakteristik mekaniknya yang lebih keras [73].
 Studi klinis kedua mirip dengan yang pertama dan difokuskan pada penilaian
regenerasi tulang dan angiogenesis karena MSC-CM. Kelompok eksperimen terdiri dari
empat pasien di mana β-TCP dicampur dengan BM-MSC-CM dicangkokkan setelah
elevasi lantai sinus maksilaris (SFE). Kelompok kontrol terdiri dari dua pasien di mana β-
TCP dicampur dengan saline. Evaluasi histologis setelah 6 bulan menghasilkan
regenerasi tulang dan angiogenesis secara signifikan lebih tinggi level pada kelompok
eksperimen dibandingkan dengan kelompok kontrol. Lebih lanjut, tidak ada efek
samping. Karena itu, MSC-CM bisa menjadi hal yang menjanjikan alternatif untuk infus
morfogenetik tulang manusia rekombinan protein-2 (BMP-2), yang saat ini merupakan
pilihan yang banyak digunakan untuk pengobatan SFE maksila. Sementara BMP-2 dibuat
dengan konsentrasi tinggi (1,5 mg / ml), konsentrasi rendah faktor pertumbuhan
tambahan cukup untuk bersinergi dengan komponen dalam MSCCM dan lebih lanjut
mempromosikan regenerasi tulang [74].

9. Ringkasan dan prospek masa depan

Dengan hasil dari studi pra-klinis menggunakan model hewan mendukung utilitas
MSC-CM, banyak yang perlu dilakukan untuk diterapkan ke klinik. Kegunaan terapeutik
MSC-CM akan menjadi pengaturan uji klinis untuk berbagai penyakit untuk dievaluasi
baik keamanan dan kemanjuran MSC-CM. Dengan sejumlah besar uji klinis MSC yang
disetujui oleh lembaga nasional, memperoleh persetujuan pengaturan untuk terapi bebas
sel dengan MSC-CM relative mudah. Namun, pada saat ini ada beberapa masalah
sehubungan dengan MSC-CM yang perlu disortir. Ini termasuk kurangnya protokol
keluhan cGMP untuk persiapan sekretoma MSC, penyimpanan, umur simpan produk,
stabilitas produk, dan parameter kontrol kualitas yang penting untuk membangun
keamanan dan kemanjuran MSC-CM. Studi tambahan berfokus pada konsentrasi dosis
protein optimal, frekuensi pemberian dan volume injeksi optimal dapat berkontribusi
pada keberhasilan terapeutik MSC-CM. Kesimpulannya, terapi bebas sel menggunakan
penggunaan MSC-CM memperluas cakrawala terapi MSC, membuka jalan bagi
pendekatan alternative dalam pengobatan regeneratif.