TESIS Master UKM - Andri PDF

PEMENCILAN Lactobacillus spp.
DAN PENINGKATAN PENGHASILAN

BIOJISIM SECARA KULTUR SELANJAR
ANDRI HUTARI
TESIS YANG DIKEMUKAKAN UNTUK MEMPEROLEH IJAZAH

SARJANA SAINS
FAKULTI SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA
BANGI
2011
ii
PENGAKUAN
Saya akui karya ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali nukilan dan ringkasan yang
tiap-tiap satunya telah saya jelaskan sumbernya
24 Januari 2011 ANDRI HUTARI

P37931
iii
PENGHARGAAN
Segala puji dan syukur Alhamdulillah ke hadrat Allah SWT, kerana dengan limpah
kunia-Nya semua kerja penyelidikan dan penulisan tesis ini dapat disiapkan. Selawat
serta salam ke atas junjungan Nabi Muhammad s.a.w. dan ahli keluarganya, para
sahabat dan kepada kaum Muslimin yang sedang berjuang di atas jalanNya.
Setinggi-tinggi penghargaan dirakamkan kepada Prof. Dr. Wan Mohtar Wan

Yusoff, selaku penyelia yang telah berusaha dengan bersungguh-sungguh dalam kerja-
kerja penyeliaan dan atas nasihat, bimbingan dan dorongan serta tunjuk ajar yang
tidak ternilai kepada saya. Penghargaan juga kepada Prof. Madya Dr. Aidil Bin Abdul
Hamid, atas bantuan dan tunjuk ajar yang juga tidak ternilai kepada saya.
Terima kasih saya ucapkan kepada semua pensyarah dan kaki tangan Pusat
Pengajian Biosains dan Bioteknologi, Fakulti Sains dan Teknologi. Kepada Encik
Ratuah, Encik Zahar, Encik Saiful, Encik Alias, Encik Fendi, dan Puan Rozilah saya
ucapkan terima kasih atas kebaikan hati kalian dalam membantu kerja makmal saya.
Penghargaan juga saya rakamkan kepada kawan-kawan seperjuangan: Waleed Shaker
Jaseem, Ekhlas, Fazlina, Farhila, Normah, Irfan, Adel dan ramai lagi yang namanya
tidak dapat saya nyatakan satu-persatu, dan juga kepada rakan-rakan tanah air semua
yang banyak memberi semangat, kerjasama dan bantuan yang telah dihulurkan tidak
akan saya lupakan.
Penghargaan teristimewa saya tujukan kepada Zahraini Yumna, istri tercinta,

dan Faris Fatihin, anakku tersayang, yang telah mendampingi dan menanti penulis
dengan sabar dan setia hingga selesainya tesis Master ini. Salam hormat dan terima
kasih saya ucapkan kepada Ibunda Sulihat & Ayahanda Suherman di Cengkareng
Jakarta, Ibu Iriannis & Prof. Dr. M. Yunan Yusuf di Ciputat, Dr. Ing. Suhendra di
Jerman, Bang Waldi, Bang Iran, Didik, Yayan, Fahmi, Iin dan semua pihak yang telah
menasihati, menyokong dan mendoakan perjuangan saya ini. Pengorbanan dan
bantuan kalian yang begitu besar, yang tak jarang disertai peluh dan penat dalam
mendorong saya menyiapkan tesis ini semoga dibalas oleh Allah S.W.T. dengan
ganjaran yang besar. Semoga Allah S.W.T sentiasa membimbing dan merahmati
langkah kita semua. Amin.
iv
ABSTRAK
Sebanyak lapan strain bakteria Lactobacillus berjaya dipencilkan daripada usus ayam
kampung tempatan. Strain tersebut ialah L. fermentum IA, L. fermentum IB,
L. fermentum IC, L. fermentum ID, L. salivarius subsp. salicinus IE, L. salivarius
subsp. salicinus IF, L. salivarius subsp. salivarius IG, dan Lactobacillus spp. IH. Dua
strain Salmonella juga berjaya dipencilkan daripada sumber yang sama, iaitu
Salmonella spp. 3B21 dan Salmonella spp. 1A12. Kajian in vitro terhadap
Lactobacillus seperti ujian agregasi, koagregasi, kerintangan terhadap garam hempedu
dan pH asid, serta ujian aktiviti perencatan ke atas Salmonella telah dilakukan. Ujian
aktiviti perencatan dilakukan dengan menggunakan ujian agar titik, asai telaga
sebaran, dan kaedah cakera kosong. Hasil menunjukkan L. salivarius subsp.
salivarius IG memiliki sifat probiotik yang terbaik iaitu agregasi positif, peratus
koagregasi daripada 12.4% ke 13.8% terhadap strain Salmonella spp. 3B21 dan
Salmonella spp. 1A12, memiliki masa lag yang singkat dalam medium De Man-
Rogosa-Sharpe (MRS) yang mengandungi garam hempedu 0.3% (w/v), mampu
mandiri pada pH 2.5 setelah pendedahan selama 3 jam dan berkesan dalam merencat
kedua-dua strain Salmonella melalui ujian aktiviti perencatan. Kesan goncangan dan
pH awal ke atas pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kelalang
goncangan menunjukkan pertumbuhan optimum pada goncangan 150 rpm dan pH 6.
Pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam fermentor dilakukan secara
kelompok dan selanjar dengan isipadu akhir 2 L medium MRS. Setiap eksperimen
diselenggarakan pada parameter suhu 37oC, pengudaraan gas nitrogen 0.5 v/v/m, pH
6.0 dan kadar goncangan 150 rpm. Kepekatan biojisim maksimum dalam kultur
kelompok adalah 4.16 g/L dengan masa gandaan (td) selama 1.22 jam. Hasil
pertumbuhan (Yx/s) adalah 0.202 g/g (biojisim/substrat terguna) dengan darjah
penggandaan 4.91 dan produktiviti biojisim sebanyak 0.470 g/L/j. Kajian dalam
kultur selanjar difokuskan kepada kesan kadar pencairan (0.05, 0.1, 0.2, 0,3, 0.35 dan
0.45/jam) dan kepekatan glukosa (20, 30, dan 40 g/L) dalam medium MRS. Hasil
menunjukkan bahawa pada kadar pencairan 0.2/jam, kepekatan biojisim paling tinggi
(4.55 g/L) pada keadaan mantap diperoleh. Nilai produktiviti biojisim maksimum
(Rmaks) sebanyak 1.19 g/L/j dicapai pada kadar pencairan 0.3/jam. Kadar pencairan
kritikal (Dkritikal) didapati pada kadar pencairan melebihi 0.3/jam. Kepekatan glukosa
sehingga 30 g/L pada kadar pencairan 0.3/jam didapati berjaya meningkatkan
produktiviti biojisim daripada 1.19 g/L/j (apabila kepekatan glukosa 20 g/L) kepada
1.28 g/L/j secara signifikan (p<0.05).
v
ISOLATION OF Lactobacillus spp. AND ENHANCE BIOMASS

PRODUCTION VIA CONTINUOUS CULTURE
ABSTRACT
A total of eight Lactobacillus strains were isolated and identified from the intestine of
Malaysian free-range chicken. The strains were Lactobacillus fermentum IA, L.
fermentum IB, L. fermentum IC, L. fermentum ID, L. salivarius subsp. salicinus IE, L.
salivarius subsp. salicinus IF, L. salivarius subsp. salivarius IG, and Lactobacillus
spp. IH. Two strains of Salmonella, Salmonella spp. 3B21 and Salmonella spp. 1A12
were also isolated from the same source. In vitro studies of Lactobacillus such as
aggregation, co-aggregation, resistance to bile salts and low pH, and inhibitory
activity tests on Salmonella were carried out. Inhibitory activity tests were carried out
using an agar spot test, well diffusion assay, and blank disc method. The results
showed L. salivarius subsp. salivarius IG exhibited the best probiotic properties, i.e.
positive aggregation, percentage of co-aggregation percentage with the two strains of
Salmonella was between 12.4% and 13.8%, short lag time in De Man-Rogosa-Sharpe
(MRS) medium containing 0.3% (w/v) bile salts, tolerance to pH 2.5 after 3 h
exposure and most effective in inhibiting the growth of the two Salmonella spp. in
inhibitory activity test. Effect of agitation and initial pH on growth of L. salivarius
subsp. salivarius IG in shake flasks showed the optimum growth was achieved with
agitation of 150 rpm and pH 6. Fermentation of L. salivarius subsp. salivarius IG in
fermentor was carried out using batch culture and continuous culture with a 2 L
working volume of MRS medium. Each experiment was performed at 37oC with
nitrogen gas aeration of 0.5 v/v/m, at pH 6.0, and with agitation at 150 rpm. The
maximum biomass produced in batch culture was 4.16 g/L with a doubling time (td) of
1.22 h. Growth yield coefficient (Yx/s) recorded was 0.202 g/g (biomass/substrate
utilized) with degree of multiplication of 4.91 and biomass productivity of 0.470
g/L/h. Continuous culture studies were investigated based on the effect of dilution
rate (0.05, 0.1, 0.2, 0,3, 0.35 and 0.45/h) and initial glucose concentration (20, 30, and
40 g/L) in MRS medium. The results showed that the dilution rate of 0.2/h resulted
the highest biomass concentration (4.55 g/L) at steady state. The maximum
productivity of biomass (Rmax) was 1.19 g/L/h obtained at dilution rate of 0.3/h.
Critical dilution rate (Dcritical) was obtained at dilution rate above 0.3/h. Use of initial
glucose concentration of 30 g/L with dilution rate of 0.3/h resulted in significant
increase of biomass productivity from 1.19 g/L/h (at initial glucose concentration of
20 g/L) to 1.28 g/L/h (p<0.05).
vi
KANDUNGAN
Halaman
PENGAKUAN ii
PENGHARGAAN iii
ABSTRAK iv
ABSTRACT v
KANDUNGAN vi
SENARAI JADUAL x
SENARAI ILUSTRASI xi
SENARAI SIMBOL xiv
SENARAI SINGKATAN xvi
SENARAI TATANAMA xvii
BAB I PENDAHULUAN 1
1.1 Latar Belakang 1
1.2 Objektif Kajian 4
5
BAB II ULASAN KEPUSTAKAAN
2.1 Probiotik dan Bakteria Asid Laktik 5
2.1.1 Kepentingan bakteria asid laktik 8

2.1.2 Sumber karbon dan nitrogen untuk pertumbuhan 10
Lactobacillus spp.
2.1.3 Pemilihan mikrob probiotik 12
2.1.4 Permasalahan penggunaan antibiotik dalam
penternakan ayam 15
2.1.5 Probiotik Lactobacillus spp. sebagai alternatif
pengganti antibiotik pada ayam 16
2.1.6 Interaksi Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. 17
2.2 Populasi Bakteria Asid Laktik (LAB) dalam Saluran

Pencernaan Ayam 18
2.3 Teknik Pengkulturan untuk Peningkatan Penghasilan

Lactobacillus 20
vii
2.4 Pencapaian dan Kelebihan Sistem Kultur Selanjar Berbanding 21

Kultur Kelompok
2.5 Faktor-faktor Penting dalam Peningkatan Penghasilan dan

Produktiviti Lactobacillus dalam Kultur Selanjar 25
2.5.1 Kesan kadar pencairan 25

2.5.2 Kesan kepekatan substrat 28
BAB III BAHAN DAN KAEDAH 31
3.1 Ayam Kampung 31
3.2 Bahan Kimia untuk Penyediaan dan Pengasaian 31
3.3 Strain Bakteria 32
3.3.1 Pemencilan dan pengenalpastian Lactobacillus spp. 32

3.3.2 Pemencilan dan pengenalpastian Salmonella spp. 32
3.4 Penyediaan Kultur Stok 33
3.5 Penyediaan Sampel Mikroskop Elektron Imbasan (SEM) 33
3.6 Ujian Pencirian In vitro Lactobacillus spp. 34
3.6.1 Ujian agregasi 34

3.6.2 Ujian koagregasi 34
3.6.3 Ujian ketahanan terhadap pH rendah 35
3.6.4 Ujian ketahanan terhadap garam hempedu 35
3.7 Penentuan Hubungkait diantara Lactobacillus spp. dan

Salmonella spp. 36
3.7.1 Ujian agar titik 36

3.7.2 Asai telaga sebaran 36
3.7.3 Kaedah cakera kosong 37
3.7.4 Penyediaan inokulum Salmonella spp. 37
3.7.5 Penyediaan supernatan bebas sel (CFCS) 37
Lactobacillus spp.
3.8 Penyediaan Medium Fermentasi 38

3.8.1 Medium inokulum 38
3.8.2 Medium pengkulturan 38
3.9 Pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam Kultur

Kelompok 39
viii
3.9.1 Penyediaan inokulum 39

3.9.2 Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam
kelalang goncangan 40
3.9.3 Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam
fermentor 40
3.10 Pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam Kultur

Selanjar 41
3.10.1 Kesan kadar pencairan ke atas pertumbuhan L.

salivarius subsp. salivarius IG 41
3.10.2 Kesan kepekatan glukosa ke atas pertumbuhan L.
salivarius subsp. salivarius IG 41
3.11 Pengasaian 42
3.11.1 Penentuan berat kering biojisim 42

3.11.2 Penentuan unit pembentukan koloni 42
3.11.3 Penentuan kepekatan glukosa 42
3.11.4 Penentuan kepekatan ammonium 42
3.12 Ujian Statistik 43
3.13 Carta Alir Penyelidikan 43
BAB IV HASIL DAN PERBINCANGAN 45
4.1 Pemencilan Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. 45
4.2 Ujian Pencirian In vitro Lactobacillus spp. 49
4.2.1 Ujian agregasi 49

4.2.2 Ujian koagregasi 50
4.2.3 Kerintangan terhadap pH rendah 51
4.2.4 Kerintangan terhadap garam hempedu 51
4.3 Hubungkait diantara Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. 53
4.4 Profil Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam

Kelalang Goncangan 56
4.4.1 Kesan kadar goncangan, pH awal dan kepekatan

glukosa awal terhadap pertumbuhan L. .salivarius 56
subsp. salivarius IG
4.5 Profil Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam

Fermentor 61
ix
4.5.1 .Profil Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG

secara Kultur Kelompok 61
4.5.2 Kesan Kadar Pencairan dalam Kultur Selanjar terhadap
Pertumbuhan dan Produktiviti L. salivarius subsp.
salivarius IG 62
4.5.3 Kesan Kepekatan Glukosa Awal dalam Kultur Selanjar
terhadap Pertumbuhan dan Produktiviti L. salivarius
subsp. salivarius IG 72
4.6 Prosedur Operasi Piawai (SOP) Pengkulturan L. salivarius

subsp. salivarius IG dalam Fermentor 5 L yang Mengandungi
2 L Medium Pengkulturan dalam Kultur Selanjar 77
4.6.1 Penyediaan inokulum

4.6.2 Penyediaan medium pengkulturan 77
4.6.3 Penyediaan fermentor 78
4.6.4 Pengkulturan secara selanjar 79
4.6.5 Pengasaian sampel 80
81
BAB V KESIMPULAN 84
5.1 Kesimpulan 84
5.2 Cadangan Kajian Lanjutan 84
RUJUKAN 85
LAMPIRAN 97
A Lengkuk Piawai 97
B Penyediaan Reagen dan Penimbal 99
C Formula Pengiraan dan Kalibrasi 100
D Analisis Data Kinetik 101
E Ujian Statistik 104
F Senarai Penerbitan 107

x
SENARAI JADUAL
No. Jadual Halaman
3.1 Komponen medium kaldu De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) 39
4.1.1 Pengenalpastian strain Lactobacillus spp. dan Salmonella 45

spp.
4.1.2 Profil biokimia strain Lactobacillus spp. pada kit API 50 46

CHL
4.1.3 Profil biokimia strain Salmonella spp. pada kit API 20 E 46
4.2 Agregasi, koagregasi dan kerintangan terhadap pH rendah

pada Lactobacillus spp. yang dipencilkan daripada ayam 50
kampung Malaysia
4.3 Ujian aktiviti perencatan Lactobacillus spp. terhadap 54

Salmonella spp.
4.4 Kesan kadar pencairan ke atas purata kepekatan biojisim,

kepekatan sel hidup, kepekatan glukosa sisa, dan kepekatan 63
ammonium sisa pada keadaan mantap
4.5 Kesan kadar pencairan ke atas produktiviti biojisim dan

produktiviti kepekatan sel hidup L. salivarius subsp. 72
salivarius IG pada keadaan mantap
4.6 Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam

ke atas purata kepekatan biojisim, kepekatan sel hidup, 74
kepekatan glukosa sisa, dan kepekatan ammonium sisa pada
keadaan mantap

ke atas produktiviti biojisim dan kepekatan sel hidup 77
L. salivarius subsp. salivarius IG pada keadaan mantap
xi
SENARAI ILUSTRASI
No. Rajah Halaman
2.1 Populasi bakteria dalam saluran pencernaan ayam dewasa 19
2.2 Tiga kemungkinan yang akan berlaku dalam pengkulturan 24

kultur selanjar
2.3 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan biojisim pada 27

keadaan mantap
2.4 Kesan kadar pencairan ke atas produktiviti biojisim 28

pada keadaan mantap
3.1 Carta alir penyelidikan 44
4.1 Profil pertumbuhan strain Lactobacillus (a-h) dalam kaldu

MRS dengan pemberian 0.1-1.0% (w/v) garam hempedu
(bile salts). 52
4.2 Kesan kadar goncangan terhadap profil pertumbuhan

L. salivarius subsp. salivarius IG 56
4.3 Kesan pH awal terhadap profil pertumbuhan L. salivarius

4.4 Kesan kepekatan glukosa awal terhadap profil pertumbuhan

4.5 Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam

kultur kelompok 61

kultur selanjar, apabila kadar pencairan ditetapkan pada
0.05/jam 64

0.1/jam 65
xii

0.2/jam 65

0.3/jam 66

0.35/jam 66

0.45/jam 67
4.12 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan sel hidup

[log (cfu/ml)] L. salivarius subsp. salivarius IG 68
4.13 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan biojisim (g/L)

4.14 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan glukosa sisa (g/L) 69
4.15 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan ammonium sisa

(g/L) 70
4.16 Kesan kadar pencairan ke atas purata produktiviti biojisim

dan produktiviti kepekatan sel hidup L. salivarius subsp.
salivarius IG pada keadaan mantap 71

0.3/jam dengan kepekatan glukosa awal 30 g/L 73

0.3/jam dengan kepekatan glukosa awal 40 g/L 73

ke atas kepekatan sel hidup [log (cfu/ml)] L. salivarius

ke atas kepekatan biojisim (g/L) L. salivarius subsp.
salivarius IG 75
xiii

ke atas kepekatan glukosa sisa (g/L) 76

ke atas kepekatan ammonium sisa (g/L) 76
No. Gambar
4.1 Pencerapan Lactobacillus spp. dan Salmonella spp.

menggunakan mikroskop cahaya 47
4.2 Fotomikrograf Mikroskop Elektron Imbasan sel

Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. 48
4.3 Agregasi positif Lactobacillus salivarius subsp. salivarius IG

dan agregasi negatif Lactobacillus fermentum IB 49
4.4 Zon perencatan Salmonella spp. 3B21 terhadap strain

Lactobacillus melalui ujian agar titik, asai telaga sebaran dan
kaedah cakera kosong 55
4.5 Lakaran skematik operasi sistem kultur selanjar satu tahap 79
4.6 Koloni L. salivarius subsp. salivarius IG yang ditumbuhkan

di atas agar MRS selama 24 jam 81
4.7 Inokulum berumur 18 jam yang dikulturkan dalam kaldu

MRS 81
4.8 Koloni Salmonella 3B21 yang ditumbuhkan di atas agar

Brain Heart Infusion (BHI) selama 24 jam 82
4.9 Koloni Salmonella 3B21 yang ditumbuhkan di atas agar

Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) selama 24 jam 82
4.10 Operasi kultur selanjar dalam fermentor 5 L (Infors HT

Minifors, UK) 83
xiv
SENARAI SIMBOL
% peratus
o
C darjah selsius
µ kadar pertumbuhan spesifik
µmaks kadar pertumbuhan spesifik maksimum
µl mikroliter
µm mikrometer
/jam per jam
cm sentimeter
D kadar pencairan
Dkritikal kadar pencairan kritikal
F kadar alir medium
g gram
j jam
KLa koefisien pertukaran gas
kDa kiloDalton
Ks keafinan substrat terhadap sel mikrob
min minit
mg miligram
ml mililiter
n darjah penggandaan
nm nanometer
OD ketumpatan optik
R produktiviti
xv
Rmaks produktiviti maksimum
rpm pusingan per minit
S kepekatan substrat pada masa t
Sr kepekatan substrat dalam medium segar
S kepekatan substrat akhir dalam medium pengkulturan pada

keadaan mantap
T masa operasi pada keadaan mantap
tiii masa sebelum mencapai tahap mantap termasuk masa penyediaan

fermentor, medium dan inokulum
td masa gandaan
V isipadu
X kepekatan biojisim
Xo kepekatan awal biojisim
X purata kepekatan biojisim pada keadaan mantap
Xmaks kepekatan biojisim maksimum pada masa pegun
Yx/s Hasil pertumbuhan (biojisim/substrat terguna)

xvi
SENARAI SINGKATAN
APF aggregation-promoting factor
API Analytical Profile Index
BG Brilliant Green
BHI Brain Heart Infusion
BSH Bile Salt Hydrolase
EMP Embden-Meyerhof-Parnas
LAB bakteria asid laktik
GRAS secara umum dianggap selamat
CFCS kultur supernatan bebas sel
cfu unit pembentukan koloni
MRS De Man-Rogosa-Sharpe
NA agar nutrien
v/v isipadu per isipadu
v/v/m isipadu udara per isipadu medium per minit
w/v berat per isipadu
XLD Xylose Lysine Desoxycholate

xvii
SENARAI TATANAMA
H2O2 Hidrogen peroksida
CO2 Karbon dioksida
C6H17N3O7 Triammonium sitrat
CH3COONa. 3H2O Sodium asetat
KHPO4 Kalium hidrogen monofosfat
K2HPO4 di-kalium hidrogen fosfat
HCl Hidrogen klorida
NaCl Natrium klorida
NaOH Natrium hidroksida
C6H12O6 Glukosa
MgSO4. 7H2O Magnesium sulfat hepta hidrat
MnSO4.H2O Manganum sulfat

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Jangkitan Salmonella spp. sebahagian besarnya terdapat pada ayam, malahan haiwan
ini berhubungkait dengan penyebaran penyakit pada manusia (Revolledo et al. 2003).
Salmonella spp. adalah penyebab utama dari berjuta kes jangkitan penyakit yang
tersebar melalui makanan (foodborne illness) setiap tahun yang menyebabkan
penyakit Salmonellosis. Salmonellosis telah menjadi masalah kesihatan awam di
hampir semua negara industri. Hasil-hasil penternakan ayam merupakan pembawa
utama dalam penyebaran Salmonella spp., dibandingkan dengan makanan yang
berasal dari haiwan lain (D’Aoust 1997).
Berdasarkan huraian di atas, maka usaha perlu dipertingkatkan untuk

menghindari penyebaran penyakit berasas Salmonella spp. daripada ayam. Terutama
kerana Malaysia merupakan salah satu negara yang paling tinggi penggunaan ayam
per kapita di dunia (Anon. 2006a; Anon. 2006b). Pada tahun 2000, penggunaan
daging ayam penduduk Malaysia sebesar 36.7 kg/kapita/tahun, lebih tinggi
dibandingkan penggunaan penduduk Indonesia (3.5 kg), Thailand (13.5 kg), Filipina
(7.6 kg), Vietnam (4.6 kg) dan Myammar (4.2 kg) (Rusfidra 2007). Kedai makan
makanan segera diduga memainkan peranan penting dalam mendorong pertumbuhan
penggunaan ayam di Malaysia (Anon. 2006a; Anon. 2006b).
Penggunaan daging ayam yang tinggi sebagai sumber protein yang paling
popular dan paling murah di kalangan penduduk Malaysia, adalah sebahagian
.
2
besarnya kerana tiada larangan diet ataupun sekatan daripada agama apapun di
Malaysia. Terdapatnya daging ayam itu sendiri terhadap permintaan masyarakat di
Malaysia sudah cukup. Ada sekitar 2500 penternakan ayam daging di Malaysia yang
menghasilkan lebih kurang 480 juta ekor ayam di tahun 2005. Lebih kurang 70%
ayam dijual di pasar tradisional, kerana pengguna lebih memilih daging ayam yang
masih segar (Anon. 2006a; Anon. 2006b).
Meningkatnya keperluan masyarakat akan produk penternakan menyebabkan

penggunaan ubat-ubatan terutama antibiotik untuk pencegahan dan perawatan
terhadap penyakit haiwan ternak menjadi semakin meningkat supaya daging dan telur
dapat dihasilkan lebih banyak. Hal ini menyebabkan sebahagian masyarakat menolak
membeli hasil penternakan yang diketahuinya menggunakan antibiotik atau bahan
kimia dalam proses penghasilannya. Pemanfaatan antibiotik pada paras sub-terapi
atau kerana kurang memperhatikan aturan penggunaannya telah terbukti
mengakibatkan adanya sisa antibiotik dalam hasil penternakan dan berkembangnya
mikrob yang rintang dalam tubuh haiwan ternak mahupun tubuh manusia yang
memakannya (Jin et al. 1997).
Penyalahgunaan terhadap antibiotik telah menyebabkan kerintangan bakteria

terhadap antibiotik. Sebagai contoh adalah antibiotik penisilin dan vankomisin yang
telah menyebabkan kerintangan pada bakteria Streptococcus pneumonia dan
enterococci di Britain pada tahun 1990an (Livermore 2004). Kes kerintangan
antibiotik juga pernah terjadi di Amerika Syarikat dimana bakteria Campylobater
yang berasal daripada ayam pedaging yang menjadi penyebab keracunan makanan
pada manusia, telah menjadi rintang terhadap antibiotik enrofloxacin dan Cipro
(Gorman et al. 2002). Menurut Livermore (2004), semakin kerap dan terlebih dos
antibiotik digunakan, kadar kerintangan akan semakin meningkat.
Sehingga kini kerintangan bakteria terhadap antibiotik telah menjadi masalah

utama di seluruh dunia (Palumbi 2001). Akibat daripada beberapa fenomena
kerintangan bakteria terhadap antibiotik, sebahagian besar negara-negara Eropah telah
melarang penggunaan antibiotik. Negara-negara Asia juga sedang dalam proses
pelarangan penggunaan antibiotik dalam penternakan. Untuk menggantikan antibiotik
3
tersebut, probiotik merupakan alternatif terbaik yang sudah terbukti kemujarabannya

(Pascual et al. 1999; Kalavathy et al. 2003; Sun 2004).
Species Bacillus, Enterococcus dan yis Saccharomyces telah lama digunakan

untuk probiotik ternakan. Namun demikian, disebabkan ciri-ciri unggul yang
dimilikinya, probiotik Lactobacillus spp. telah banyak digunakan untuk penternakan
pada masa kebelakangan ini (Patterson & Burkholder 2003). Usaha untuk mencari
spesies probiotik Lactobacillus spp. yang berpotensi menggantikan antibiotik terus
dilakukan (Guerra et al. 2007). Kriteria pemilihan Lactobacillus spp. yang akan
digunakan sebagai probiotik antara lain memiliki sifat tahan dalam keadaan sekitaran
saluran pencernaan (pH rendah dan bergaram hempedu), mampu melekat pada
intestinal perumah, menunjukkan aktiviti perencatan terhadap bakteria patogen,
mampu bersaing untuk mendapatkan nutrien dan tempat pelekatan, serta mampu
mempertahankan kebolehhidupan sel selama pemprosesan dan penyimpanan (Servin
2004; Lin et al. 2007). Lan et al. (2003) menunjukkan bahawa ada perbezaan di
dalam ciri probiotik Lactobacillus spp. dalam spesies yang sama namun berasal dari
sumber yang berbeza. Oleh itu, strain probiotik untuk penternakan ayam harus berasal
daripada ayam dalam iklim yang sama yang mengandungi ciri-ciri probiotik unggul.
Ayam kampung (Gallus domesticus) digunakan dalam kajian ini, kerana ayam
kampung terbiasa hidup mandiri pada persekitaran yang lebih tercemar dan tahan
lasak. Oleh itu, bakteria Lactobacillus spp. yang terdapat pada usus ayam kampung
tersebut, diyakini memiliki sifat yang lebih unggul daripada yang terdapat pada ayam
pedaging.
Proses-proses industri untuk penghasilan kultur probiotik Lactobacillus spp.,

hampir secara eksklusif menggunakan kultur kelompok dengan sel-sel terampai
(Lacroix & Yildirim 2007). Pengkulturan secara kelompok ini sering dilakukan
kerana kultur kelompok lebih mudah diselenggarakan dan mudah dikawal daripada
terjadinya kontaminasi, serta risiko kerugian finansial yang lebih rendah. Namun
demikian, untuk meningkatkan produktiviti dari segi penghasilan biojisim, asid laktik
dan bakteriosin, penggunaan sistem kultur selanjar merupakan alternatif yang terbaik
(Hofvendahl & Hagerdal 2000; Avonts et al. 2004). Pada kultur selanjar, bahan
4
masuk sentiasa disuapkan dan hasil sentiasa dikeluarkan pada kadar yang malar
sepanjang masa proses. Kelebihan kultur selanjar adalah menghasilkan populasi
bakteria yang dinamik dan cergas, penghasilan sel bakteria dapat dikekalkan pada fasa
pertumbuhan eksponen dan kos pengeluaran lebih efektif (Hewitson 2010).
1.2 OBJEKTIF KAJIAN
Penyelidikan ini mempunyai tiga objektif, iaitu sebagai berikut:
1. Memencil dan mengenalpasti Lactobacillus spp. dan Salmonella spp.

daripada usus ayam kampung tempatan dan memilih strain Lactobacillus
spp. yang mempunyai ciri-ciri unggul dan paling berkesan merencat
Salmonella spp.
2. Mengkaji kesan kadar goncangan, pH awal, dan kepekatan glukosa awal
serta menganalisis kinetik pertumbuhan Lactobacillus spp. unggul ke atas
medium De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) dalam kultur kelompok bagi
pembangunan kultur selanjar.
3. Mengkaji kesan kadar pencairan pada pengkulturan Lactobacillus spp.
unggul secara selanjar ke atas produktiviti biojisim dan kebolehhidupan
sel, serta mengkaji kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan
yang terbaik ke atas produktiviti biojisim dan kebolehhidupan sel pada
keadaan mantap.
BAB II
ULASAN KEPUSTAKAAN
2.1 PROBIOTIK DAN BAKTERIA ASID LAKTIK
Sejarah probiotik dimulakan dengan sejarah tentang kehidupan manusia pada suatu
masa, dimana keju dan susu fermentasi diketahui umum oleh orang Yunani dan Rom
yang mencadangkan penggunaannya terutamanya untuk kanak-kanak dan orang sakit
yang dalam masa pemulihan (Gismondo et al. 1999). Pada awal abad ke-20, Elie
Metchnikoff, seorang ahli zoologi berbangsa Rusia, ahli bakteriologi dan pemenang
Hadiah Nobel, mempostulatkan bahawa bakteria usus yang ‘baik’ menyumbang kepada
usia yang panjang kepada para petani Bulgaria. Dia percaya bahawa meminum susu
fermentasi yang kaya dengan bakteria asid laktik (LAB) adalah bermanfaat untuk
manusia sebab boleh mengurangkan sejumlah bakteria berbahaya ‘penghasil toksin’ di
dalam usus (Metchnikoff 1907).
Istilah probiotik berasal daripada bahasa Greek yang bermakna ‘untuk hidup’
(Gibson & Fuller 2000). Lilly & Stillwell (1965) memperkenalkan istilah ‘probiotik’
sebagai faktor-faktor pengembang pertumbuhan yang dihasilkan oleh
mikroorganisma. Parker (1974) kemudian menggunakan istilah tersebut sebagai
‘organisma dan sebatian’ yang membawa kesan bermanfaat untuk haiwan dengan
melalui peningkatan keseimbangan mikroflora usus. Pada masa itu, probiotik
digunakan sebagai pembekal makanan untuk meningkatkan pertumbuhan haiwan.
Istilah probiotik kemudian disemak oleh Fuller (1989) yang mendefinisikan probiotik
sebagai ‘mikroorganisma hidup’ yang secara aktif mampu meningkatkan kesihatan
hos haiwan melalui peningkatan keseimbangan mikroflora dalam saluran pencernaan.
Kemudian definisi tersebut diperluas lagi sehingga merangkumi hos manusia dengan
6
pemberian kultur hidup mikrob tunggal atau campuran (Havenaar & Huis in’t Veld
1992) dan secara spesifik probiotik makanan fungsian (Salminen et al. 1998).
FAO/WHO (2001) kemudian mendefinisikan probiotik sebagai mikroorganisma
hidup yang ketika diberikan dalam jumlah yang memadai, akan memberikan faedah
kesihatan ke atas hos.
Tannock (2004) kemudian membuat sempadan mengenai mikrob probiotik

sebagai mikroorganisma hidup tak patogen yang terdiri dari kumpulan bakteria asid
laktik seperti Lactobacillus spp. dan Bifidobacterium spp. dan spesies yis terpilih.
Bakteria asid laktik itu sendiri merupakan kumpulan bakteria heterogen, yang
merangkumi genus Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Pediococcus, Streptococcus dan Weissella, yang kewujudannya telah dikenal luas
(Axelsson 2004). Fuller (1992) sebelumnya mengatakan, bahawa yis seperti
Saccharomyces cerevisiae dan Candida pintolopesii, kulat mould seperti Aspergillus
niger dan Aspergillus oryzae, serta bakteria dari genus Leuconostoc, Pediococcus dan
Bacillus dapat digunakan sebagai probiotik. Sedangkan bakteria asid laktik tertentu,
seperti Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., dan Streptococcus thermophilus
telah dinyatakan sebagai mikroorganisma yang pada umumnya dianggap selamat/
Generally Regarded As Safe (GRAS) (Havenaar et al. 1992). Bakteria tersebut
memberikan faedah ke atas perumah melalui peningkatan keseimbangan mikroflora
usus dan penting untuk kematangan sistem imun, perkembangan morfologi usus
normal dan mempertahankan suatu tindak balas ke atas penyakit kronik dan
keseimbangan sistem imun ke atas peradangan (Tannock 2004).
Ciri-ciri bakteria asid laktik ini boleh dikenalpasti melalui beberapa ujian.
Antaranya adalah seperti ujian katalase, ujian motiliti, pewarnaan Gram, serta melihat
morfologi melalui mikroskop. Berdasarkan ujian-ujian tersebut didapati bahawa
bakteria asid laktik (LAB) bersifat katalase negatif, tidak motil, Gram positif dan
morfologinya adalah berbentuk rod bacilli atau kokus. Bakteria asid laktik ini juga
bersifat fakultatif anaerobik dan tidak menghasilkan spora. Selain itu, bakteria asid
laktik berupaya hidup pada suhu antara 20oC hingga 45oC serta dalam keadaan
aerobik dan anaerobik (Lin et al. 2006).
7
Syarat suatu mikroorganisma untuk menjadi probiotik antara lain: (i) mampu
hidup ketika digunakan dan ketika berada di dalam saluran pencernaan hos, (ii) tidak
bersifat toksik bagi manusia mahupun haiwan, (iii) mampu bertahan pada pH asid,
(iv) mampu bertahan hidup dalam keadaan mikroaerofilik dan (v) mampu merencat
bakteria patogen dalam saluran pencernaan (Fuller 1992; Gusils et al. 2002b;
Havenaar et al. 1992; Maus & Ingham 2003). Roselli (2005) menambahkan, ciri
penting probiotik antara lain: kemampuan untuk melekat pada mukosa usus, mampu
untuk membentuk koloni dan meningkatkan populasinya di dalam usus, mampu
mencegah beberapa penyakit usus seperti cirit birit, memodulet sistem imun perumah,
menunjukkan aktiviti anti kanser dan kemampuan untuk merendahkan paras
kolesterol serta mengurangkan ketidaktoleranan terhadap laktosa (lactose
intolerance).
Populasi-populasi bakteria probiotik boleh menyingkirkan patogen-patogen

seperti Salmonella daripada pengkolonian di usus melalui persaingan fizikal dan
kimia. Tetapi mekanisma dimana bakteria probiotik mempengaruhi mikroekologi
daripada saluran gastrointestinal masih belum difahami dengan baik. Terdapat lebih
kurang tiga mekanisma probiotik yang telah dicadangkan, iaitu: penghasilan bahan-
bahan antimikrob (bakteriosin, kolisin), pemodulatan respon imun dan persaingan
spesifik untuk reseptor pelekatan pada sel epitelial usus (Nava et al. 2005).
Voravuthikunchai et al. (2006) menambahkan, bahawa terdapat bukti probiotik
Lactobacillus dan Bifidobacteria boleh menghalang pembiakan bakteria patogen di
dalam gastrousus dan mempunyai aktiviti antimikrob terhadap bakteria patogen. Ini
kerana penghasilan asid laktik dapat merendahkan paras pH di dalam usus. Sebagai
tambahan, ia juga boleh menghasilkan bahan-bahan penghalang seperti hidrogen
peroksida (H2O2), bakteriosin atau laktosin dan asid organik lain.
Penyelidikan mengenai bakteria probiotik banyak mengalami perkembangan

selama 20 tahun terakhir ini (Saarela et al. 2004). Penyelidikan mengenai pemencilan
dan pengenalpastian bakteria probiotik daripada usus ayam serta kajian pencirian
bakteria probiotik secara in vitro telah banyak dilaporkan (Reque et al. 2000;
Ehrmann et al. 2002; Musikasang et al. 2009). Hasil penyelidikan tersebut biasanya
8
menghasilkan strain probiotik berpotensi untuk dijadikan sebagai probiotik pada

ternakan ayam.
Kajian penyingkiran persaingan (competition exclusion) antara bakteria

probiotik dan bakteria patogen juga telah banyak dilaporkan. Kajian penyingkiran
persaingan pertama kali digambarkan oleh Nurmi & Rantala (1973) dan telah
menunjukkan sebagai kaedah yang efektif untuk mengawal Salmonellosis di dalam
kumpulan ayam komersial. Kemampuan merencat pelekatan patogen tampaknya
bergantung pada lactobacilli dan patogen yang dikaji serta, yang menunjukkan
spesifisiti yang sangat tinggi. Pemilihan probiotik yang merencat atau menyingkirkan
patogen tertentu akan menjadi pendekatan yang sangat logik untuk mencegah atau
mengubati jangkitan yang disebabkan oleh patogen seperti Salmonella (Gueimonde
et al. 2006).
2.1.1 Kepentingan Bakteria Asid Laktik
Kegunaan bakteria asid laktik dikategorikan sebagai probiotik untuk manusia dan juga
haiwan. Kebanyakan produk komersial yang mengandungi bakteria asid laktik ini
mempunyai fungsi-fungsi yang baik serta mendatangkan faedah. Penghasilan
bakteria asid laktik sebagai probiotik telah terbukti bahawa ia sangat bermanfaat
kepada manusia kerana dapat menghalang daripada penyakit gastrousus dan enteritis
akut (Lin et al. 2006).
Bakteria asid laktik adalah juga penting secara komersial, dimana produk yang
dihasilkannya digunakan secara luas dalam industri makanan, perkilangan, tekstil dan
farmaseutikal (Berry et al. 1999). Salah satu produk pentingnya yang telah digunakan
secara luas dalam industri adalah asid laktik. Asid laktik digunakan telah digunakan
secara luas sebagai agen asidulan dan pengawetan makanan, dan juga sebagai pelopor
untuk penghasilan pengemulsi untuk industri pembuatan roti (Schepers et al. 2002).
Selain itu, produk penting lain daripada beberapa strain bakteria asid laktik adalah
bakteriosin. Bakteriosin merupakan peptida anti mikrob atau protein kompleks yang
berfungsi menghalang terjadinya kebusukan oleh mikroorganisma patogen, yang
sangat berguna sebagai bahan awet makanan semula jadi (Nettles & Barefoot 1993).
9
Bakteria asid laktik memfermentasikan gula melalui tapak jalan yang berbeza
yang dibahagikan menjadi homofermentatif, heterofermentatif, atau gabungan kedua-
duanya. Bakteria asid laktik homofermentatif hanya menghasilkan asid laktik sebagai
hasil akhir metabolisma (umumnya 85% atau lebih), dan melalui laluan Embden-
Meyerhof-Parnas (EMP) (Hofvendahl & Hagerdal 2000; Buchanan & Gibson 1974).
Bakteria asid laktik homofermentatif termasuklah Lactococcus, Enterococcus,
Streptococcus, Pediococcus, dan kumpulan lactobacilli, seperti Lactobacillus
delbrueckii, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus bulgaricus,
Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
salivarius, Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus coryniformis (Buchanan &
Gibson 1974).
Bakteria asid laktik heterofermentatif menghasilkan 50% asid laktik sebagai

hasil akhir metabolisma glukosa dengan sejumlah besar CO2, asid asetik, etanol, dan
mannitol dari metabolisma fruktosa (Buchanan & Gibson 1974). Bakteria asid laktik
heterofermentatif termasuklah Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, dan
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus,
Lactobacillus buchneri, Lactobacillus hilgardii dan Lactobacillus trichodes
(Buchanan & Gibson 1974).
Di dalam penternakan ayam, penggunaan bakteria asid laktik sebagai probiotik

pengganti antibiotik sangat digalakkan (Kabir 2009). Pemberian probiotik untuk
ternakan ayam dapat dilakukan dalam beberapa cara, antara lain dapat diberikan
dalam bentuk pelet, kapsul, pes, serbuk, atau butir yang diberikan secara langsung
ataupun melalui makanan ternakan (Jin et al. 1997). Pemberian bakteria asid laktik
tersebut dalam pemakanan ternakan telah menunjukkan kesan bermanfaat dalam
pencapaian hasil ternakan. Pertumbuhan bakteria asid laktik dalam usus ayam telah
terbukti mampu mengawal pertumbuhan bakteria patogen, seperti Salmonella spp.,
Clostridium perfringens dan Campylobacter spp. (Kabir 2009). Tambahan pula,
pemberian Lactobacillus spp. kepada ternakan ayam terbukti mampu memberikan
ketahanan kepada ayam terhadap jangkitan agen penyakit seperti Escherichia coli
(Jin et al. 1996), dan Eimeria acervulina (Dalloul et al. 2005).
10
2.1.2 Sumber Karbon dan Nitrogen untuk Pertumbuhan Lactobacillus spp.
Kadar pertumbuhan bakteria adalah bergantung kepada kepekatan sumber karbon.

Semakin tinggi kepekatan sumber karbon yang digunakan maka semakin cepat kadar
pertumbuhan bakteria, walaubagaimanapun kadar kematian bakteria tersebut juga
berlaku dengan cepat (Rao et al. 2000). Ratledge (2001) melaporkan bahawa
penguraian substrat seperti karbon dalam medium adalah bertujuan untuk
menghasilkan sel-sel baru organisma, pembentukan ATP serta mengurangkan tenaga,
seperti pengurangan tenaga NADH dan NADPH menjadi NAD dan NADP.
Tambahan pula, bakteria asid laktik memperoleh energi sebahagian besarnya melalui
proses glikolisis (laluan Embden-Meyerhof-Parnas) dengan asid laktik sebagai produk
akhir utama (Axelsson 2004). Pada laluan tersebut, terdapat sembilan pelopor penting
yang perlu disintesis dalam sel untuk membina molekul-molekul serta untuk replikasi
sel iaitu glukosa-6-fosfat, triosa fosfat, fosfogliserat, fosfoenolpiruvat, piruvat, asetil
KoA, oksaloasetat, suksinat dan α-ketoglutarat. Kesemua pelopor ini dapat disintesis
melalui tapak jalan glikolisis dengan menggunakan glukosa sebagai substrat
(Ratledge 2001).
Fermentasi oleh bakteria asid laktik biasanya disertai oleh peningkatan

kepekatan biojisim sel yang membentuk suatu produk yang tidak dikehendaki, jika
tujuan daripada proses fermentasi tersebut adalah asid laktik. Di sisi lain, kepekatan
sel hidup bakteria adalah produk utama dalam penghasilan probiotik (Hofvendahl &
Hagerdäl 2000). Pada fermentasi untuk penghasilan asid laktik, sumber karbon yang
digunakan antara lain adalah gula tulen seperti glukosa, sukrosa dan laktosa, atau
daripada bahan-bahan yang mengandungi gula seperti molases, dadih, hampas tebu,
hampas ubi kayu, dan bahan-bahan berkanji seperti ubi kentang, tepung ubi, tepung
gandum, barli dan lobak merah (Pandey et al. 2001; Anuradha et al. 1999)
Glukosa adalah salah satu sumber karbon yang banyak digunakan pada
fermentasi oleh bakteria asid laktik untuk penghasilan asid laktik (Hofvendahl &
Hagerdäl 2000; Charalampopoulos et al. 2003). Hasil kajian Hofvendahl & Hagerdäl
(2000) melaporkan bahawa glukosa menghasilkan kepekatan asid laktik dan hasil
pertumbuhan yang lebih tinggi dibandingkan dengan sumber karbon yang lain, seperti
11
xilosa, galaktosa, arabinosa, laktosa, fruktosa dan selulosa terhidrolisis. Hofvendahl

& Hagerdäl (2000) mencontohkan fermentasi glukosa oleh Lactococcus lactis
menghasilkan asid laktik yang lebih tinggi dibandingkan jika menggunakan maltosa,
laktosa, dan galaktosa. Namun demikian, perbezaan sumber karbon yang digunakan
akan memberikan jumlah keluaran yang berbeza-beza, bergantung kepada strain
bakteria asid laktik yang digunakan (Hofvendahl & Hagerdäl 2000). Sebagai contoh,
fermentasi glukosa atau maltosa oleh Lc. lactis menghasilkan kepekatan sel dan hasil
pertumbuhan yang lebih rendah. Hasil yang sama diperolehi oleh Lb. delbrueckii
dimana sumber karbon laktosa dan mannosa menghasilkan kepekatan sel yang lebih
tinggi dibandingkan dengan glukosa, manakala fruktosa, selulosa dan xilosa
menghasilkan kepekatan sel yang lebih rendah dibandingkan dengan glukosa
(Hofvendahl & Hagerdäl 2000).
Komponen nutrien utama seperti karbon, hidrogen, nitrogen, oksigen fosforus

dan sulfur diperlukan dalam proses fermentasi bagi sintesis biojisim dan hasil yang
dikehendaki (Lee 2003). Antara unsur-unsur tersebut, sumber nitrogen diperlukan
Lactobacillus bagi sintesis asid nukleik, protein dan molekul-molekul lainnya yang
mengandungi nitrogen di dalam sitoplasma (Doroshchuk et al. 2006; Pirt 1975).
Menurut Pirt (1975) metabolisma nitrogen dapat membekalkan sumber protein, asid
nukleik dan polimer dinding kepada bakteria. Nitrogen didapati membentuk
sebanyak 12% daripada jumlah berat kering bakteria (Pirt 1975).
Sumber nitrogen yang telah dikaji adalah dalam bentuk organik atau tak
organik. Kebanyakan industri mikrob menggunakan kedua-dua sumber nitrogen
tersebut, sama ada organik ataupun tak organik. Nitrogen tak organik mungkin
dibekalkan sebagai garam ammonium, ammonium sulfat dan ammonium hidrogen
fosfat atau ammonia. Manakala sumber nitrogen organik adalah ekstrak yis, pepton
dan lain-lain. Penambahan ekstrak yis yang tinggi ke dalam medium tanpa sumber
nitrogen yang lain memberikan penghasilan asid laktik yang tinggi berbanding
penambahan ekstrak yis dan pepton dalam kepekatan yang rendah (Hofvendahl &
Hagerdäl 2000). Hal ini dapat disebabkan oleh kandungan vitamin B kompleks yang
terdapat pada ekstrak yis yang berperan sebagai perangsang pertumbuhan sel bakteria
asid laktik (Hofvendahl & Hagerdäl 2000). Kadam et al. (2005) melaporkan, tidak
12
ada satupun sumber nitrogen yang dapat menghasilkan kepekatan asid laktik setara
dengan yang ekstrak yis hasilkan.
Dalam pengurangan kos hasil untuk tujuan perindustrian, beberapa sumber

nitrogen tak organik digunakan. Di antara sumber nitrogen organik dan tak organik,
urea mengandungi kandungan nitrogen yang tinggi (46.7%), di ikuti oleh NH4NO3
(35%), (NH4)2SO4 (21%), KNO3 (13.9%), ekstrak yis (9.8%) dan NSP (8.7%)
(Wang et al. 2008). Sumber nitrogen yang biasanya dibekalkan dalam pengkulturan
Lactobacillus spp. antara lain ialah pepton, ektrak yis, ekstrak daripada daging lembu,
triammonium sitrat, (NH4)2SO4, jus jagung dan urea (Nancib et al. 2001; De Man
et al. 1960). Kajian mengenai pembekalan sumber nitrogen yang ekonomi bagi
peningkatan produktiviti dan metabolit Lactobacillus perlu dilakukan untuk
menjimatkan kos penghasilan (Altaf et al. 2005).
2.1.3 Pemilihan Mikrob Probiotik
Usaha untuk mendapatkan spesies mikroorganisma probiotik baru terus dicari,

dikenalpasti dan dilakukan pencirian agar dapat memenuhi syarat sebagai probiotik
(Gotcheva et al. 2002). Beberapa kriteria dipertimbangkan untuk strain bakteria asid
laktik yang akan dijadikan sebagai probiotik. Kriteria tersebut antara lain termasuklah
toleran terhadap pH berasid dan garam hempedu, mampu melekat dalam sel epitelial
usus, menunjukkan aktiviti perencatan terhadap bakteria patogen, dan dapat
mempertahankan kebolehhidupannya selama pemprosesan dan penyimpanan
(Lin et al. 2007).
Probiotik yang dimakan umumnya akan masuk ke dalam saluran pencernaan,

dimulai dari mulut hingga rektum. Hal tersebut menyebabkan mikroorganisma
probiotik harus bertahan terhadap enzim-enzim yang terdapat dalam saluran
pencernaan dan selama proses pencernaan. Menurut Chou & Weimer (1999),
kebolehhidupan mikroorganisma yang masuk dalam proses pencernaan di dalam
gastrik dan usus akan berkurang, akibat rendahnya pH asid gastrik dan adanya cecair
hempedu pada usus.
13
Nilai pH yang rendah dari asid gastrik merupakan rintangan utama

mikroorganisma yang masuk ke dalam saluran pencernaan (Guslis et al. 2002a). pH
normal asid gastrik ayam yang berada di bawah tiga akan menyebabkan jumlah
mikroorganisma yang masuk akan berkurang sehingga tersisa 103 unit pembentukan
koloni (cfu)/ml, sehingga yang dapat melaluinya adalah mikroorganisma yang tahan
sekitaran asid (Barrow 1992).
Kerintangan terhadap sekitaran asid merupakan salah satu syarat atau ciri
daripada pemilihan mikroorganisma probiotik untuk dapat memberikan kesan bagi
saluran pencernaan perumah (Gotcheva et al. 2002). Kemampuan tersebut merupakan
ciri daripada bakteria asid laktik, namun mekanisma ketahanan daripada bakteria asid
laktik terhadap keadaan tersebut belum difahami (Gotcheva et al. 2002).
Kerintangan terhadap garam hempedu, merupakan salah satu ciri lain dalam
pencirian mikroorganisma probiotik (Gusils et al. 2002b). Asid hempedu disintesis
daripada kolesterol dan dapat berkonjugasi dengan asid amino taurin dan glisin
menjadi asid taurokolat dan asid glikoat. Konjugasi asid hempedu dengan asid amino
tersebut dinamakan sebagai garam hempedu yang berkonjugat (conjugated bile salt)
(Moser & Savage 2001).
Garam hempedu yang berkonjugat (conjugated bile salt) diketahui boleh

bersifat toksik bagi bakteria, kerana dapat merosakkan struktur dan fungsi membran
sel (Chiang 1998). Bakteria asid laktik merupakan bakteria yang dapat bertahan
terhadap pengaruh garam hempedu yang berkonjugat (conjugated bile salt) pada
cecair hempedu. Hal tersebut diduga kerana enzim Bile Salt Hydrolase (BSH) yang
dimilikinya, namun mekanisma kerja BSH dalam menghilangkan kesan ketoksikan
dari garam hempedu yang berkonjugat (conjugated bile salt) tersebut belum diketahui
dengan pasti (Moser & Savage 2001).
Kemampuan untuk mengkoloni pada saluran pencernaan merupakan salah satu

kriteria dalam pemilihan mikroorganisma probiotik, kerana pelekatan dianggap
merupakan persyaratan daripada pengkolonian bakteria (Tuomola et al. 2001).
Probiotik yang digunakan diharapkan dapat melekat, berkoloni dan tumbuh dalam
14
saluran pencernaan. Kemampuan mikroorganisma probiotik untuk melekat pada sel

epitelial saluran pencernaan akan memudahkan pengkolonian bakteria probiotik
dalam saluran pencernaan dan merencat pertumbuhan dan pengkolonian
mikroorganisma patogen (Shah 2001). Kemampuan melekat pada saluran
pencernaan, diikuti dengan pengkolonian, merupakan syarat bakteria asid laktik
supaya memberikan kesan dalam jangka masa yang lama (Rinkinen 2004).
Menurut Kmet & Lucchini (1997), penyingkiran persaingan (competitive

exclusion) dapat merangkumi agregasi dan koagregasi. Pelekatan yang terjadi antara
bakteria asid laktik dengan sel epitelial saluran pencernaan, mungkin dapat membantu
mekanisma penyingkiran persaingan (competitive exclusion) dengan cara: (i) bakteria
asid laktik yang tumbuh lambat namun mampu melekat pada saluran pencernaan akan
berkoloni dan menginokulasi substrat yang ada di dalam saluran pencernaan, (ii) jika
bakteria asid laktik menempati tempat pelekatan pada permukaan saluran pencernaan,
bakteria patogen yang menempati tempat tersebut akan tersingkirkan daripada saluran
pencernaan (Gusils et al. 2002a).
Berdasarkan huraian di atas, ciri-ciri penting probiotik yang perlu diambil

perhatian termasuklah mampu mandiri pada sekitaran dimana ianya mesti aktif,
berbiak dan berkoloni. Selain itu, di dalam tubuh perumah tidak terjadi tindak balas
imun terhadap strain probiotik. Bakteria probiotik itu sendiri mahupun hasil
fermentasinya juga tidak boleh bersifat toksik, patogen, alergik, mutagenik dan
karsinogenik. Di sisi lain, bakteria probiotik harus stabil secara genetik, mudah
dibiakkan dan berdaya hidup selama pemprosesan dan penyimpanan (Havenaar &
Huis in’t Veld 1992).
Sebahagian besar penyelidikan memilih bakteria Lactobacillus spp. sebagai

probiotik potensial untuk ternakan ayam. Penyelidikan yang dilakukan oleh
Ehrmann et al. (2002), memperlihatkan beberapa strain Lactobacillus spp. dapat
dijadikan probiotik potensial untuk diaplikasikan kepada ayam. Lactobacillus spp.
ditetapkan sebagai probiotik potensial pada ayam kerana Lactobacillus spp.
merupakan bakteria normal saluran pencernaan ayam dan juga mudah diberikan
langsung pada makanan ataupun minuman ternak (Pilcher 2004).
15
2.1.4 Permasalahan Penggunaan Antibiotik dalam Penternakan Ayam
Antibiotik telah digunakan secara luas dalam penternakan di berbagai negara, selama
lebih dari 40 tahun, sebagai pencegahan dan pengubatan penyakit yang disebabkan
oleh bakteria. Antibiotik seperti bacitracin, chlortetracycline, tylosin, avoparcin,
neomycin, oxytetracycline dan virginiamycin telah banyak digunakan sebagai
promoter pertumbuhan pada ternakan ayam (Apata 2009). Paras antibiotik dalam
makanan ternakan yang disyorkan adalah 5-10 g/kg pada tahun 1950an dan kemudian
telah meningkat 10 hingga 20 kali ganda sejak tahun tersebut (Apata 2009).
Antibiotik tersebut bekerja dengan cara membunuh sebahagian besar bakteria patogen
ataupun tak patogen, yang ada dalam tubuh haiwan ternakan. Hal tersebut
menyebabkan keseimbangan mikroorganisma dalam tubuh ternakan terganggu
(Lopez 2000; Fooks & Gibson 2002).
Antibiotik yang dipakai secara berterusan dapat menyebabkan kerintangan

bakteria terhadap jenis antibiotik tersebut, disebabkan sifat bakteria yang cepat
berkembang biak dan dapat bertukar informasi genetik. Bakteria yang dapat bertahan
terhadap suatu antibiotik, akan berkembang biak dan menghasilkan keturunan yang
tahan terhadap antibiotik, mengakibatkan penyakit akan sukar disembuhkan jika
masih menggunakan antibiotik tersebut (Doyle 2001). Sebagai contoh adalah
penggunaan antibiotik fluoroquinolone dalam makanan ayam pedaging telah
menyebabkan kemunculan bakteria Campylobacter yang rintang yang kemudian
menjangkiti sebanyak 10 peratus penduduk yang terdapat pada suatu kawasan di
Britain (Apata 2009).
Antibiotik dapat mempengaruhi keseimbangan mikroorganisma dalam saluran

pencernaan termasuk bakteria asid laktik. Antibiotik merupakan sebatian yang
dihasilkan oleh mikroorganisma tertentu yang dapat merencat ataupun membunuh
mikroorganisma lain. Berdasarkan aktiviti kerja antibiotik terhadap mikroorganisma,
antibiotik dibahagikan menjadi 2, iaitu: (i) antibiotik berspektrum luas (broad-
spectrum antibiotics), yang menyerang bakteria Gram positif ataupun Gram negatif,
contohnya adalah kumpulan antibiotik β-laktam. (ii) antibiotik berspektrum sempit
16
(narrow-spectrum antibiotics), yang bekerja pada jenis mikroorganisma tertentu

(Madigan et al. 2000).
Penggunaan antibiotik terhadap ayam akhirnya dapat menyebabkan

kerintangan bakteria terhadap antibiotik tersebut. Oleh itu, ada keperluan penting
untuk menemukan alternatif untuk menggantikan pemberian antibiotik. Hingga
sekarang, sebatian yang bervariasi telah digunakan sebagai alternatif penggunaan
antibiotik, seperti asid organik, prebiotik, ekstrak tumbuhan, probiotik dan garam zink
(Huyghebaert 2003; Sun 2004; Roselli et al. 2005).
2.1.5 Probiotik Lactobacillus spp. sebagai Alternatif Pengganti Antibiotik pada

Ayam
Pada tahun 1994, World Health Organization (WHO) menganggap probiotik sebagai
sistem pertahanan imun yang sangat penting pada masa yang akan datang ketika
pemberian preskripsi antibiotik menjadi tidak berguna kerana adanya kerintangan
antibiotik. Penggunaan probiotik di dalam kerintangan antibiotik diistilahkan sebagai
‘terapi melibatkan mikrob’ (microbial interference therapy) (Parvez et al. 2006).
Ada bukti yang tidak dapat dipertikaikan lagi bahawa mikroflora usus adalah
terlibat di dalam ketahanan ayam terhadap jangkitan penyakit dan hal ini membentuk
asas untuk pendekatan probiotik (Fuller 1992). Mikroflora probiotik menunjukkan
banyak sekali manfaat kesihatan disebalik tersedianya nilai pemakanan asas (Drisko
et al. 2003). Salah satu strategi dalam mengawal patogen dalam tubuh ayam selepas
era penggunaan antibiotik adalah dengan pemberian probiotik (Dahiya et al. 2006).
Sejumlah besar kajian telah mendedahkan potensi probiotik Lactobacillus

sebagai promoter kesihatan dan pencapaian yang baik dalam tubuh haiwan (Oyetayo
& Osho 2004). Penyelidikan mengenai kesan probiotik terhadap pertumbuhan ayam
pernah dilakukan oleh Jin et al. (1998), yang mengkaji kesan pelekatan Lactobacillus
spp. terhadap pertumbuhan, berat organ dan mikroflora usus ayam pedaging
Malaysia. Hasil penyelidikan tersebut menunjukkan terdapat peningkatan yang
signifikan terhadap berat badan ayam dan penurunan yang signifikan terhadap jumlah
koliform yang terdapat pada usus ayam tersebut.
17
2.1.6 Interaksi Lactobacillus spp. dan Salmonella spp.
Keseimbangan bakteria saluran pencernaan, mempunyai peranan penting pada

kesihatan dan pertumbuhan ayam. Beberapa mikrob patogen seperti Escherichia coli
dan Salmonella spp., dapat menjangkiti usus ayam sehingga menjejaskan kesihatan
dan pertumbuhan ayam (Sun 2004). Gangguan terhadap mikroflora usus dapat
mengakibatkan diarhea, gangguan penyerapan dan keradangan usus kronik
(Johnston 1999).
Saluran pencernaan ayam merupakan habitat bagi bakteria probiotik seperti

Lactobacillus spp. dan bakteria patogen seperti Salmonella spp. yang kedua-duanya
boleh jadi telah hidup berdampingan dalam usus ayam semenjak ayam tersebut
berusia beberapa hari setelah menetas. Hipotesis yang dibuat adalah wujudnya satu
keseimbangan interaksi yang dinamik antara flora asli dalam saluran pencernaan
ayam, yakni Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. Kewujudan interkasi dinamik
ini merupakan suatu hal yang tidak dapat dipisahkan dengan kesihatan umum pada
ayam (Hutari et al. 2008). Asas utama adalah bagi memahami keadaan yang
meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus spp. semasa menghalang pertumbuhan
Salmonella spp. Oleh itu, satu pemahaman bagi interaksi antara Lactobacillus spp.
dan Salmonella spp. akan menyumbang untuk pembangunan probiotik.
Pemahaman bagi interaksi antara Lactobacillus spp. dan Salmonella spp.

juga akan menyumbang untuk menghindari penyakit berasas Salmonella daripada
ayam. Salah satu penyakit yang menjadi masalah dalam industri ternakan yang
menyebabkan kadar kematian ternakan meningkat serta pencemaran terhadap produk
ternakan untuk kegunaan manusia ialah penyakit enterik (Patterson & Burkholder
2003). Ayam-ayam yang dijangkiti Salmonella spp. boleh menyebabkan demam
teruk dan kematian teratur (Tauxe 1991). Pendekatan inovatif telah digunakan
sebagai alternatif dalam merawat penyakit usus dan ini termasuklah menggunakan
agen-agen biotherapeutik hidup seperti yis (Saccharomyces spp.) dan bakteria
terasing (Lactobacillus spp.) (Fuller 1992).
18
Lactobacilli adalah penting bagi ekosistem mikrob usus (Sandine 1979).

Kesan perencatan lactobacilli terhadap pertumbuhan pelbagai enterobakteria
patogenik didemonstrasikan dengan baik. Beberapa hipotesis dapat menjelaskan
interaksi dinamik ini, dimana lactobacilli menentang mikrob patogen dengan
merembeskan bahan-bahan rencatan seperti asid laktik dan bakteriosin (Vandenbergh
1993), wujudnya persaingan antara lactobacilli dengan mikrob patogen untuk
mendapatkan nutrien yang mencukupi.
2.2 POPULASI BAKTERIA ASID LAKTIK (LAB) DALAM SALURAN

PENCERNAAN AYAM
Ayam (Gallus spp.) merupakan jenis avian yang digemari untuk sajian makanan
manusia (Praseno & Yuniwarti 2000). Makanan yang masuk ke dalam tubuh ayam
akan masuk ke dalam saluran pencernaan yang meliputi tembolok, proventrikulus,
ventrikulus, sekum, dan kloaka (Sun 2004). Ayam akan langsung menelan seluruh
makanannya tanpa dikunyah terlebih dahulu, masuk ke esofagus, dan disimpan di
dalam tembolok. Tembolok (ingluvies) merupakan pelebaran esofagus yang
berfungsi menampung sementara biji-bijian yang dimakan. Makanan akan
mengalami pencernaan sehingga memudahkan proses penghadaman selanjutnya
(Praseno & Yuniwati 2000).
Bakteria yang dapat hidup di dalam tembolok merupakan bakteria aerob dan
anaerob fakultatif. Bakteria yang paling banyak ditemui di dalam tembolok adalah
dari genus Lactobacillus. Bakteria tersebut akan menghasilkan asid laktik dan asid
asetik yang membuat pH tembolok menjadi asid iaitu sekitar 4-5 (Barrow 1992). Hal
ini bersesuian dengan laporan Huyghebaert (2003) yang menyatakan bahawa pH
tembolok ayam berada pada kisaran 4.5 hingga 5.3. Jenis bakteria yang berada pada
bahagian tembolok hingga kolon ayam dapat dilihat pada Rajah 2.1.
Zacconi et al. (1999) menyatakan Lactobacillus spp. dapat berkoloni pada

tembolok dan sekum ayam sejak hari pertama menetas. Lactobacillus spp.
mendominasi bakteria yang ada di tembolok, sehingga dapat mempengaruhi pelekatan
bakteria patogen pada sel epitelial tembolok (Scolari et al. 1999).
19
Saluran pencernaan ayam pH Jenis bakteria
Streptococcus
4.5-5.3 Coliform
Tembolok
Lactobacillus
Streptococcus
Proventrikulus Coliform
2.0-4.5
Lactobacillus
Ventrikulus
Streptococcus
Coliform
Lactobacillus
Usus kecil 5.6-7.9
Bifidobacterium
Peptostreptococcus
Sekum Clostridium
5.8-6.8 Bakteria propionik
Eubacteria
Bacteroides
Kolon &
Gabungan bakteria
Kloaka 6.3-7.7 usus kecil dan
sekum
Rajah 2.1 Populasi bakteria dalam saluran pencernaan ayam dewasa
Sumber: Huyghebaert 2003
Proventrikulus dan ventrikulus (hempedal) memiliki jumlah bakteria yang

sedikit kerana pH pada tempat tersebut rendah, iaitu 2-4. pH tersebut dapat
mengurangi sebahagian besar jumlah bakteria yang masuk melalui makanan, sehingga
hanya sebahagian kecil bakteria yang dapat melewati proventrikulus dan ventrikulus
(Bourlioux 2003; Sun 2004). Sedangkan sekum memiliki mikroorganisma yang
terdiri dari Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., E. coli, Salmonella spp. dan
bakteria anaerob (Zacconi et al. 1999).
Mikroorganisma yang keluar dari hempedal akan masuk ke dalam usus kecil.
Pertumbuhan mikroorganisma akan terencat dalam usus kecil kerana adanya cecair
hempedu yang terdapat di dalam usus tersebut (Gilliand & Walker 1990). Cecair
hempedu merupakan hasil perembesan hati yang berasal dari sintesis kolesterol dan
disimpan dalam kantung hempedu. Cecair tersebut akan dikeluarkan dari hati dan
20
disimpan dalam kantung hempedu melalui duktus hepatikus, jika tubuh memerlukan
maka cecair hempedu akan dikeluarkan melalui duktus sistikus, kemudian menuju
usus kecil melalui duktus kholedokus (Moser & Savage 2001).
Cecair hempedu dapat merupakan bahan berbahaya bagi sebahagian

mikroorganisma, namun beberapa mikroorganisma dalam saluran pencernaan
manusia atau haiwan dapat mengubahnya menjadi beberapa hasil metabolisma
(Grill et al. 1995). Menurut Anderson (2002) konjugasi garam hempedu dapat
menyebabkan terganggunya mikroorganisma dalam saluran pencernaan ayam,
sehingga pertumbuhan ayam terencat.
2.3 TEKNIK PENGKULTURAN UNTUK PENINGKATAN PENGHASILAN

BIOJISIM Lactobacillus spp.
Pengkulturan Lactobacillus spp. biasanya dilakukan untuk mendapatkan biojisim atau

sel hidup bagi penghasilan probiotik mahupun hasil metabolit seperti asid laktik dan
bakteriosin yang bermanfaat di dalam industri (Hofvendahl & Hagerdäl 2000).
Pengkulturan Lactobacillus spp. tersebut, ada yang dilakukan menggunakan sel bebas
(Major & Bull 1985), ada juga yang menggunakan sel terimobil (Senthuran et al
1999). Sel terimobil digunakan untuk menyelenggarakan fermentasi dengan
kepekatan sel yang tinggi bagi penghasilan biojisim mahupun hasil metabolit (Lacroix
& Yildirim 2007), walaupun ada suatu laporan yang menyebutkan bahawa sel
terimobil tidak begitu berjaya dalam peningkatan hasil asid laktik dan produktiviti.
Sesetengah kajian melaporkan bahawa hasil yang lebih baik diperolehi ketika
menggunakan sel bebas (Hofvendahl & Hagerdäl 2000).
Pemilihan sistem pengkulturan, sumber karbon, sumber nitrogen dan

penggunaan jenis bioreaktor tertentu adalah berbeza bergantung kepada matlamat atau
objektif kajian. Berdasarkan cara operasinya, pengkulturan Lactobacillus spp. dapat
dilakukan melalui tiga cara, antara lain kultur kelompok (batch culture), kultur suap
kelompok (fed-batch culture) dan kultur selanjar (continuous culture). Pada kultur
kelompok (batch culture), substrat dimasukkan bersamaan dengan inokulum pada
awal fermentasi dan tidak dilakukan penambahan selama fermentasi berlangsung.
Pada kultur suap kelompok (fed-batch culture), sebahagian substrat dimasukkan
21
bersamaan dengan inokulum pada awal fermentasi dan dilakukan penambahan

substrat sedikit-demi sedikit selama proses fermentasi. Sedangkan pada kultur
selanjar (continuous culture), substrat sentiasa ditambahkan secara sekata selama
proses fermentasi berlangsung dan pada saat yang sama hasil fermentasi diambil
secara sekata (Lacroix & Yildirim 2007; Stanbury et al. 1995).
Pengkulturan Lactobacillus spp. untuk pelbagai tujuan melalui ketiga-tiga

ragam operasi di atas, telah banyak dilaporkan, antaranya ialah sistem kultur
kelompok (O-Dichara et al. 1997; Schepers et al. 2002), kultur suap kelompok
(Ding & Tan 2006), dan kultur selanjar (Major & Bull 1985; B-Bárcena et al. 1999;
Schepers et al. 2006). Di antara ketiga-tiga sistem pengkulturan tersebut, kultur
kelompok dilaporkan menghasilkan produktiviti yang paling rendah (Hujanen et al.
2001), manakala kultur suap kelompok, kultur selanjar dan kultur kelompok ulangan,
dilaporkan telah menghasilkan biojisim dan hasil pertumbuhan Lactobacillus spp.
yang lebih tinggi dibandingkan dengan kultur kelompok (Hofvendahl & Hagerdäl
2000).
Di antara sistem pengkulturan yang telah digunakan, sistem kultur selanjar

merupakan sistem yang menjanjikan untuk peningkatan penghasilan biojisim, asid
laktik dan bakteriosin oleh Lactobacillus spp. Penggunaan sistem kultur selanjar
untuk menghasilan asid laktik dan bakteriosin didapati meningkatkan produktiviti dari
segi penghasilan biojisim, asid laktik dan bakteriosin (Avonts et al. 2004).
2.4 PENCAPAIAN DAN KELEBIHAN SISTEM KULTUR SELANJAR

BERBANDING KUTUR KELOMPOK
Proses fermentasi secara selanjar sudah digunakan sejak tahun 1970an dalam
penghasilan makanan haiwan dan pada 1980an kultur selanjar merupakan proses
fermentasi yang paling ideal dalam penghasilan biojisim dan juga digunakan dalam
proses penghasilan etanol (Stanbury et al. 1995). Ketika membandingkan kultur
kelompok dengan kultur selanjar pada pengkulturan Lactobacillus spp., kultur
kelompok dilaporkan mampu menghasilkan kepekatan asid laktik dan hasil
pertumbuhan yang lebih tinggi daripada kultur selanjar pada sesetengah kajian kajian.
Hal ini mungkin disebabkan seluruh substrat habis digunakan dalam kultur kelompok,
22
manakala kepekatan substrat sisa banyak tinggal di dalam kultur selanjar (Hofvendahl
& Hagerdal 2000). Namun Hujanen et al. (2001) melaporkan, kultur kelompok
menghasilkan produktiviti yang lebih rendah disebabkan adanya end-product
inhibition (kesekatlakuan oleh hasil akhir). Disisi lain, kultur selanjar umumnya
menghasilkan produktiviti yang lebih tinggi, hal ini terutamanya kerana kultur
selanjar mampu berlangsung pada kadar pencairan yang tinggi (Hofvendahl &
Hagerdäl 2000).
Kultur selanjar atau kultur kemostat tersebut merupakan sistem yang

mengandungi ampaian biojisim yang dicampur sempurna dengan medium yang
dibekalkan secara berterusan pada kadar alir (F) tertentu dan kultur dituai pada kadar
alir yang sama supaya isipadu kultur (V) sentiasa tetap. Pada kadar alir yang sesuai,
keadaan mantap akhirnya diperolehi, iaitu pembentukan biojisim baru dalam kultur
diseimbangkan dengan pengeluaran biojisim daripada kultur. Kadar alir medium ke
dalam kultur dapat menentukan nilai kadar pencairan (D) semasa pengkulturan.
Kadar pencairan (D) didapati berkaitan dengan dengan kadar alir medium (F) dan
isipadu (V) kultur, yang dirumuskan dengan D = F/V. Pada keadaan mantap, kadar
pertumbuhan spesifik (µ) setara dengan nilai kadar pencairan (D) (Stanbury et al.
1995; Pirt 1975 ).
Secara teori, kultur kemostat atau kultur selanjar lebih baik untuk kajian
kinetik daripada kultur kelompok, kerana kadar pertumbuhan dan penghasilan lebih
mudah dan lebih akurat ditentukan pada keadaan mantap. Walaubagaimanapun,
kultur kemostat tidak stabil pada kadar pencairan mendekati kadar pertumbuhan
spesifik maksimum dan kemudian hanya dalam keadaan suboptimum kultur kemostat
dapat diselenggarakan (Schepers et al. 2002).
Pertumbuhan sel dalam kultur selanjar dikawal oleh kehadiran komponen

kimia dalam medium yang bertindak sebagai faktor penghad pertumbuhan.
Berdasarkan persamaan X = Y(Sr- S ) iaitu apabila S rendah atau S = 0 maka X
pun akan meningkat, dimana Y = faktor pertumbuhan, Sr = kepekatan substrat awal,
S = kepekatan substrat akhir. Oleh itu, penambahan dan pengeluaran medium yang
23
berterusan boleh mengelakkan daripada pengumpulan toksin dalam medium

pengkulturan (Pirt 1975; Stanbury et al. 1995).
Kultur selanjar dipandang lebih unggul daripada kultur kelompok dalam hal
produktiviti, kesamaan operasi dan senang dalam hal automasi namun lebih mudah
terkena kontaminasi (Stanbury & Whitaker 1984). Terdapat banyak kelebihan dalam
kultur selanjar berbanding kultur kelompok: Pertama, kadar pembiakan spesifik kultur
selanjar dapat dikawal dengan mengawal kadar alir medium (F) semasa keadaan
mantap. Kedua, keadaan mantap dapat dicapai untuk suatu jangka masa yang lama.
Hasil yang diperoleh pada keadaan mantap akan mempunyai ciri-ciri yang sama dari
segi komposisi dan kepekatan (Maxon 1954). Ketiga, daya penghasilan dalam kultur
selanjar adalah lebih tinggi berbanding kultur kelompok, kerana teknik pengkulturan
ini dapat meminimumkan pengumpulan toksin dalam kultur (Stanbury et al. 1995).
Keempat, sistem kultur selanjar boleh meningkatkan produktiviti hasil yang
dikehendaki (Stanbury et al. 1995). Berdasarkan rumus produktiviti kultur selanjar,
iaitu R = D X (1-tiii/T) (Lampiran D.5), maka peningkatan nilai D, X dan
pengurangan masa tiii dalam sistem, akan meningkatkan produktiviti.
Berdasarkan rumus produktiviti di atas, produktiviti kultur selanjar lebih

produktif berbanding kultur kelompok kerana kultur selanjar boleh mengawal
keadaan pengeluaran pada keadaan mantap sentiasa pada tahap maksimum sepanjang
tempoh fermentasi. Oleh itu, penuaian produk dapat dilakukan dengan berterusan
selama mana sistem dapat operasi. Manakala produk yang didapati melalui kultur
kelompok, hanya didapati pada satu masa sahaja (Stanbury et al. 1995). Namun
demikian, hasil yang ditunjukkan dalam kultur selanjar mungkin berbeza daripada
yang sudah diramalkan dalam teori-teori sebelumnya. Alasan terjadinya
penyimpangan tersebut mungkin disebabkan adanya anomali yang berkaitan dengan
pelengkapan atau mungkin teori tersebut tidak meramalkan kelakuan mikroorganisma
dibawah keadaan tertentu (Stanbury et al. 1995). Oleh itu, supaya tidak terjadi
anomali pada hasil yang diharapkan, berbagai eksperimen sebaiknya dilakukan untuk
memahami fisiologi mikrob pada sebarang titik µ dalam kultur kemostat.
24
Kepekatan
biojisim, (X)
X
o
(Kepekatan
biojisim awal)
t1 Masa (t)
Sr
(Kepekatan
substrat awal)
Kepekatan
substrat (S)
t1 Masa (t)
Rajah 2.2 Tiga kemungkinan yang akan berlaku dalam penghasilan kultur selanjar
dimana kadar pertumbuhan biojisim (X) dihadkan oleh kepekatan substrat
penghad pertumbuhan (S). Sr ialah kepekatan awal substrat penghad
pertumbuhan dan t1 ialah masa untuk mula pam medium kultur selanjar.
Sumber: Pirt 1975
Rajah 2.2 menunjukkan tiga kemungkinan profil pertumbuhan yang boleh

berlaku dalam kultur selanjar, dimana kepekatan biojisim (X) dihadkan oleh
kepekatan substrat penghad pertumbuhan (S) iaitu: Pertama, apabila kadar
pengeluaran biojisim melebihi kadar pertumbuhan maksimum (1). Kedua, apabila
kadar pengeluaran biojisim adalah sama dengan kadar pertumbuhan maksimum (2).
25
Ketiga, apabila kadar pengeluaran biojisim adalah kurang dari kadar pertumbuhan
maksimum (3) (Pirt 1975). Kemungkinan yang ketiga inilah yang menjadi matlamat
penghasilan biojisim Lactobacilus spp. dalam operasi kultur selanjar.
Penggunaan kultur kemostat pada pengkulturan Lactobacillus spp. dapat

dilakukan untuk beberapa tujuan berikut. Pertama, untuk mengubah-ubah kadar
pertumbuhan spesifik kultur (kadar metabolik) tanpa mengubah keadaan sekitaran,
kecuali perubahan kepekatan substrat penghad pertumbuhan. Hal ini bertujuan untuk
memahami kaitan antara kadar pertumbuhan dengan pembentukan produk daripada
fungsi fisiologis suatu kultur. Kedua, untuk memastikan kadar pertumbuhan spesifik
pada saat keadaan kultur yang bervariasi. Hal ini berguna untuk mempelajari kesan
sekitaran kultur tanpa mengganggu lingkungan pertumbuhan. Ketiga, untuk menjaga
pertumbuhan yang terhad oleh substrat dengan suatu kadar pertumbuhan spesifik yang
tetap, dimana hal tersebut tidak dapat dilakukan pada kultur kelompok. Keempat,
untuk memperoleh pertumbuhan seimbang yang tidak terikat oleh masa (pada
keadaan mantap). Kelima, untuk mempertahankan kadar pengeluaran yang optimum
daripada suatu produk (Lee 2003)
2.5 FAKTOR-FAKTOR PENTING DALAM PENINGKATAN

PENGHASILAN DAN PRODUKTIVITI Lactobacillus spp. DALAM
KULTUR SELANJAR
2.5.1 Kesan Kadar Pencairan
Salah satu faktor penting dalam penyelenggaraan kultur selanjar Lactobacillus spp.
adalah kadar pencairan (D). Seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya, kadar
pencairan (D) digambarkan sebagai hubungan antara aliran medium masuk kedalam
bioreaktor (F) dan isipadu kultur dalam bioreaktor (V), iaitu D = F/V. Kadar
pencairan (D) didapati berkadar secara langsung dengan kadar alir medium (F)
(M-Patrick & Finn 2008; Stanbury et al. 1995). Kadar alir medium (F) dinyatakan
dalam L/jam, isipadu (V) dinyatakan dalam L, sehingga kadar pencairan (D)
dinyatakan dalam unit per jam (/jam). Sedangkan masa mastautin (tr) merupakan
kebalikan daripada kadar pencairan (1/D) dan juga berkaitan dengan isipadu
bioreaktor dan kadar alir medium, iaitu tr = V/F (M-Patrick & Finn 2008).
26
Penghasilan biojisim dalam proses fermentasi akan memperoleh hasil

optimum jika seluruh substrat di transformasikan menjadi biojisim (Szewezyk &
Warsaw 1991). Oleh itu, masa yang diperlukan untuk mencampurkan sejumlah kecil
medium dengan kultur seharusnya jauh lebih kecil dibandingkan dengan masa
mastautin (tr). Hal ini untuk mendapatkan percampuran medium dengan sempurna.
Dengan demikian, nilai tr adalah penting dalam memastikan penggunaan medium
dengan kultur untuk pertumbuhan yang paling sesuai berlaku (Pirt 1975).
Berdasarkan rumus dx/dt = µx – Dx, dimana pada keadaan mantap dx/dt = 0,

sehingga µx = Dx, atau µ = D. Dengan demikian, pada keadaan mantap, kadar
pertumbuhan spesifik dikawal oleh kadar pencairan, dimana ianya merupakan
pemboleh ubah dalam eksperimen. Tambahan pula, kultur selanjar hanya dapat
dioperasikan pada kadar pencairan dibawah kadar pertumbuhan maksimum. Oleh itu
pada paras tertentu, kadar pencairan dapat digunakan untuk mengawal kadar
pertumbuhan kultur (Stanbury et al. 1995).
Kesan utama yang diakibatkan oleh kadar pencairan (D) yang berbeza adalah
mengubah kepekatan sisa daripada substrat penghad pertumbuhan, sehingga akan
mempengaruhi perubahan µ, iaitu µ daripada kultur selanjar pada keadaan mantap di
tentukan oleh Sr (kepekatan substrat awal dalam medium segar) sahaja (Lee 2003).
Daripada persamaan Monod: µ = µ maks S / (Ks + S ), dimana pada keadaan mantap
nilai µ = D, sehingga D = µ maks S / (Ks + S ), dimana Ks adalah keafinan substrat
terhadap sel mikrob dan S adalah kepekatan substrat pada keadaan mantap.
Persamaan tersebut dapat diubah menjadi S = KsD / (µ maks - D), dimana ianya
menjelaskan bahawa kepekatan substrat pada keadaan mantap ( S ) ditentukan oleh D,
Ks dan µ maks (Stanbury et al. 1995). Oleh kerana Ks dan µ maks adalah unsur tetap
dalam sesuatu pengkulturan, maka S dikawal terutamanya oleh D. Oleh itu, nilai D
yang sesuai perlu dikaji untuk membolehkan keadaan mantap yang optimum dicapai.
Keadaan mantap adalah suatu keadaan di mana penghasilan biojisim baru dalam
kultur adalah seimbang dengan kehilangan sel-sel daripada bioreaktor (Pirt 1975).
27
Nilai D optimum dapat dipengaruhi oleh jenis bioreaktor yang digunakan

mahupun keadaan proses lainnya seperti isipadu biorektor dan komposisi medium
yang digunakan dalam pengkulturan. Major & Bull (1985) memperoleh kadar
pencairan 0.35 dan 0.40/jam sebagai kadar pencairan optimum untuk penghasilan
biojisim Lactobacillus delbrueckii dalam medium yang mengandungi glukosa 50 g/L.
Sedangkan B-Barcena et al. (1999) mendapatkan kadar pencairan 0.17/jam pada
bioreaktor pertama sebagai kadar pencairan yang memberikan kepekatan biojisim
tertinggi pada pengkulturan Lactobacillus casei dalam kultur kemostat 2 tahap dimana
pada bioreaktor pertama tersebut mengandungi glukosa 35 g/L.
Rajah 2.3 menunjukkan perubahan nilai D semasa pengkulturan tidak

memberi kesan terhadap kepekatan biojisim (X) pada keadaan mantap kecuali nilai D
ditingkatkan sehingga nilai S =Sr dan kepekatan biojisim pada keadaan mantap ialah
mulai menurun sehingga kosong. Keadaan inilah merupakan nilai kadar pencairan
kritikal (Dkritikal) yang nilainya dapat setara dengan kadar pertumbuhan spesifik
maksimum, yang merupakan kemungkinan kadar pencairan tertinggi dimana keadaan
mantap dapat diperolehi. Jika kadar pencairan ditingkatkan lagi daripada kadar
pencairan kritikal (Dkritikal), maka berlakulah ‘wash out’, yakni semua biojisim
terkeluar dalam aras F yang laju (Lee 2003; Pirt 1975).
.6
.5
.4
.3
X
.2
Dkritikal
.1
0.0
0.0 .2 .4 .6 .8 1.0 1.2
D (j -1 )
D (/jam)
Rajah 2.3 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan biojisim pada keadaan mantap
Sumber: Pirt 1975

28
Rajah 2.4 menunjukkan kesan kadar pencairan (D) keatas produktiviti

biojisim. Mengikut rumus produktiviti kultur selanjar iaitu R = D X (1-tiii/T)
(Lampiran D.5), maka didapati bahawa peningkatan nilai D sehingga Dkritikal dapat
meningkatkan produktiviti biojisim. Ini adalah kerana apabila nilai D tinggi, kadar
alir keluar kultur dalam bioreaktor juga akan meningkat walaupun kepekatan biojisim
menurun.
.5
.4
produktiviti biojisism (DX)
.3
.2
.1 Dkritikal
0 .0
0 .0 .2 .4 .6 .8 1 .0 1 .2
DD(/jam)
(j -1 )
Rajah 2.4 Kesan kadar pencairan ke atas produktiviti biojisim pada keadaan mantap
Sumber: Pirt 1975; Stanbury et al. 1995
2.5.2 Kesan Kepekatan Substrat
Komposisi medium pengkulturan yang sesuai untuk Lactobacillus spp. akan

menyokong penambahan biojisim dan produk metabolitnya. Selain itu, bekalan
tenaga yang secukupnya termasuk karbon dan nitrogen membolehkan biosintesis dan
reproduksi sel lebih cepat berlaku (De Man et al. 1960; Stanbury & Whitaker 1984).
Medium MRS (De Man-Rogosa-Sharpe) merupakan medium ideal bagi pertumbuhan
Lactobacillus spp. secara umum dan terutama sekali untuk bakteria ‘fastidious’ yang
tidak tumbuh dengan baik pada medium umum (De Man et al. 1960). Pada medium
tersebut terdapat glukosa sebagai sumber karbon dan ekstrak yis sebagai sumber
29
nitrogen organik. Sumber karbon merupakan komponen yang amat perlu dalam
biosintesis sel seperti karbohidrat, lipid, protein dan asid nukleik. Kesemuanya akan
dioksida bagi memberi tenaga kepada sel (Ratledge 2001). Kehadiran sumber karbon
yang sesuai dalam kuantiti yang mencukupi dalam formulasi medium pengkulturan
menjamin pertumbuhan yang baik bagi penghasilan metabolit primer dan sekunder
(Kubitschek 1970).
Seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya, sumber karbon yang paling baik
untuk pertumbuhan Lactobacillus adalah glukosa, manakala sumber nitrogen yang
terbaik ialah ekstrak yis (Hofvendahl & Hagerdäl 2000; Kadam et al. 2005), dimana
kedua-dua sumber tersebut terdapat di dalam komposisi medium MRS. Menurut
Rao et al. (2000), kadar pertumbuhan bakteria adalah bergantung kepada kepekatan
sumber karbon tersebut, semakin tinggi kepekatan sumber karbon yang digunakan
maka semakin cepat kadar pertumbuhan bakteria, walaubagaimanapun kadar
kematian bakteria tersebut juga berlaku dengan cepat.
Mengikut rumus X = Y(Sr- S ), maka kepekatan biojisim ( X ) yang dihasilkan

dalam kultur selanjar, boleh dipertingkatkan lagi dengan cara mempertingkatkan
kepekatan substrat awal (Sr). Kepekatan substrat awal yang dimaksud disini
terutamanya ialah sumber karbon (glukosa). Menurut hasil kajian Amrane & Prigent
(1997), ketiadaan pembatasan sumber karbon walaupun dalam keadaan kurang
nitrogen dapat menghasilkan peningkatan seluruh produk dan hasil pertumbuhan
biojisim Lactobacillus spp. selama separuh masa kedua pengkulturan. Sebaliknya,
jika terdapat pembatasan sumber karbon walaupun dalam keadaan tidak kekurangan
nitrogen akan membuat berhentinya pertumbuhan kultur yang tiba-tiba.
Beberapa penyelidikan mengenai pengkulturan Lactobacillus spp. secara

selanjar menunjukkan bahawa setiap spesies Lactobacillus spp. memiliki keperluan
sumber karbon dan kepekatan sumber karbon yang spesifik bagi pertumbuhan
optimumnya. Kespesifikan tersebut mengisyaratkan pentingnya mengkaji ciri-ciri
fisiologi mikrob sebelum melakukan pengkulturan. Major & Bull (1985)
menggunakan medium pengkulturan yang mengandungi glukosa (sumber karbon
utama) sebanyak 50 g/L dan ekstrak yis (sumber nitrogen organik) sebanyak 30 g/L
30
untuk mengkaji profil penggunaan substrat oleh Lactobacillus delbrueckii dalam

kultur selanjar. Hasilnya adalah glukosa dan komponen utama lainnya telah
seluruhnya habis pada kadar pencairan di bawah 0.1/jam. Arasaratnam et al. (1996)
mengkaji kesan penambahan glukosa sebesar 20 g/L dan ekstrak yis sebesar 20 g/L ke
dalam dadih (mengandungi gula 30 g/L) sebagai medium pengkulturan Lactobacillus
delbrueckii. Hasilnya adalah, dengan penambahan tersebut, penghasilan asid laktik
menjadi lebih tinggi, dan komposisi tersebut merupakan komposisi yang paling sesuai
dalam penghasilan asid laktik yang optimum oleh Lactobacillus delbrueckii.
Namun demikian, gula tulen dan ekstrak yis merupakan sumber karbon dan
nitrogen yang tidak ekonomi. Oleh itu, beberapa penyelidikan dilakukan untuk
mencari sumber karbon dan nitrogen yang lebih murah dan cekap bagi penghasilan
biojisim mahupun asid laktik oleh Lactobacillus spp. Sebagai contoh, Altaf et al.
(2005) mencadangkan penggunaan kanji secara langsung dalam pengkulturan yang
menggunakan bakteria yang menunjukkan aktiviti amylolytic, seperti Lactobacillus
amylophilus, sebagai sumber karbon. Selain itu, penggunaan sumber nitrogen organik
alternatif yang lebih murah dalam pengkulturan Lactobacillus spp. perlu juga
dilakukan guna menjimatkan kos pengeluaran (Altaf et al. 2005)
BAB III
BAHAN DAN KAEDAH
3.1 AYAM KAMPUNG
Ayam kampung (Gallus domesticus) diperolehi daripada pasar tradisional Kajang,

Selangor Darul Ehsan pada bulan Januari tahun 2007. Usia ayam kampung tersebut
adalah 5 bulan dengan berat 1.2 Kg.
3.2 BAHAN KIMIA UNTUK PENYEDIAAN DAN PENGASAIAN
Bahan kimia yang digunakan dalam kajian ini adalah seperti berikut: air suling,
alkohol 70%, medium De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) agar dan cecair [Merck], Kit
API (Analytical Profile Index) 50 CHL [BioMerieux, France], Kit API 20 E
[BioMerieux, France], medium Brain Heart Infusion (BHI) agar dan cecair [Oxoid],
medium Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) agar [Himedia], medium Brilliant
Green (BG) agar [Scharlau], medium Tetrathionate Broth Base [Himedia], medium
Rappaport-Vassiliadis cecair [Himedia], agar nutrien (NA) [Oxoid], Garam hempedu
(bile salts) [Oxoid], Natrium klorida (NaCl) [Merck], pepton [Difco], Ekstrak lembu
[Difco], Ekstrak yis [Difco], Tween 80 [Sigma], Ammonium sitrat [Labolatory
chemical M&B], Sodium asetat [Labolatory chemical M&B], Magnesium sulfat
[HmbG Chemicals], Manganese sulfat [[HmbG Chemicals], di-potassium fosfat
[Labolatory chemical M&B], Glukosa [Systerm], Gliserol [R&M Chemical], Kalium
hidrogen monofosfat (KHPO4) [Merck], di-kalium hidrogen fosfat (K2HPO4) [Merck],
asid hidroklorida (HCl) [Systerm], natrium hidroksida (NaOH) [Scharlau], anti busa
[Sigma-Aldrich, Germany], Sodium nitroprusside [PC Labaratory Reagent], sodium
32
hipoklorida [PC Labaratory Reagent], Fenol [R&M Chemical], Kit GOD-glucose

oxidase [Manheim Boehringer].
3.3 STRAIN BAKTERIA
3.3.1 Pemencilan dan Pengenalpastian Lactobacillus spp.
Usus ayam kampung tempatan diambil daripada tubuh ayam, dipotong menjadi
bahagian kecil, dan direndam ke dalam air pepton 0.1% (w/v) dan air garam 0.85%
(w/v) dan dihomogenkan menggunakan pengisar selama 2 min. Pencairan bersiri
daripada homogenat dilakukan pada agar MRS (Merck) dalam piring petri.
Pengeraman dilakukan secara anaerob dalam bekas GasPak system (Oxoid) selama 2
hari pada suhu 37oC. Setelah dieram, pencilan bakteria dipilih secara rawak dan
disubkultur pada kaldu MRS dan setelah itu disubkultur lagi pada agar MRS pada
suhu 37oC dalam keadaan anaerob. Pencilan bakteria yang gram-positif, morfologi
rod dan katalase negatif dipilih untuk pengenalpastian menggunakan kit API 50 CHL
(BioMerieux, France). Profil fermentasi gula dari seluruh pencilan dikenalpasti
menggunakan perisian API WEB versi 5.0 BioMerieux dan dipadankan dengan buku
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Buchanan & Gibson 1974) untuk
perbandingan profil fermentasi.
3.3.1 Pemencilan dan Pengenalpastian Salmonella spp.
Homogenat pada kaedah 3.3.1 di atas dieram selama 24 jam pada suhu 37oC. Satu
bahagian daripada homogenat tersebut dicairkan dengan nisbah 1/10 ke dalam 10 ml
kaldu tetrathionate dan dieram pada suhu 37oC selama 24 jam, dan selanjutnya
dicairkan lagi dengan nisbah 1/10 ke dalam 10 ml kaldu Rappaport-Vassiliadis dan
dieram pada suhu 37oC. Setelah 24 jam, 10 µl daripada setiap kultur dibuat coretan
pada agar Brillian Green (BG) (Oxoid) dan agar Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)
(Oxoid) (Gambar 4.9). Coretan dalam piring petri tersebut kemudian dieram selama
18 hingga 24 jam pada suhu 37oC sebelum dilakukan jangkaan terhadap kehadiran ciri
koloni Salmonella spp. Lebih kurang satu koloni dipilih daripada setiap piring petri
yang dijangka mengandungi Salmonella spp. dan kemudian dilakukan ujian urease
33
dan oxidase. Koloni-koloni tersebut ditumbuhkan pada agar Brain Heart Infusion
(BHI) (Oxoid) pada suhu 37oC (Gambar 4.8). Pencilan-pencilan yang dipilih tersebut
kemudian dilanjutkan dengan pengenalpastian menggunakan kit API 20 E
(BioMerieux, France) untuk semua pencilan yang memiliki ciri urease- dan oxidase-
negatif (Plummer et al. 1995).
3.4 PENYEDIAAN KULTUR STOK
Pencilan bakteria ditumbuhkan di atas agar MRS (untuk Lactobacillus spp.) dan agar
BHI (untuk Salmonella spp.). Kultur dieram pada suhu 37oC selama 48 jam. Koloni
tunggal yang diperoleh selepas pengeraman disahkan ketulenannya melalui kaedah
pewarnaan Gram dan dilihat di bawah mikroskop cahaya untuk memastikan tiada
kontaminasi. Kultur tersebut selanjutnya ditumbuhkan dalam agar condong dan
setelah 24 jam dimasukkan gliserol steril, kemudian disimpan pada suhu -20oC dan
disubkultur setiap empat minggu untuk memastikan tiada kontaminasi pada stok.
3.5 PENYEDIAAN SAMPEL MIKROSKOP ELEKTRON IMBASAN (SEM)
Agar MRS yang mengandungi sel-sel bakteria yang telah ditumbuhkan selama 24 jam,
dipotong dalam saiz 1 cm x 1 cm, ditetapkan dalam 4% (v/v) glutaraldehida selama 18
jam pada suhu 4oC, dibasuh tiga kali menggunakan PBS selang 10 min dan dilakukan
pengawetan akhir menggunakan 1% (v/v) osmium tetroxide selama 2 jam pada suhu
4oC. Sel-sel kemudian dibasuh tiga kali selang 10 min menggunakan PBS.
Penyahhidratan dilakukan dengan kepekatan alkohol menaik: 30%, 50%, 70%, 90%
dan 100% (v/v). Penyahhidratan pada setiap kepekatan alkohol tersebut dilakukan
sebanyak tiga kali ulangan, masing-masing selama 15 min. Sampel kemudian
dikeringkan dalam Critical Point Drier (Thermo VG Scientific) selama 30 min,
dilekapkan pada keratan menggunakan pita pelekat dua sisi dan disalut dengan emas
menggunakan sputter coater (BIO-RAD SC500). Kesemua sampel kemudian
diperhatikan dengan mikroskop elektron imbasan (Zeiss Supra 55 VP).
34
3.6 UJIAN PENCIRIAN IN VITRO Lactobacillus spp.
3.6.1 Ujian Agregasi
Ujian agregasi dilakukan menurut Jankovic et al. (2003). Pada ujian ini, Lactobacillus
spp. ditumbuhkan pada kaldu MRS (Merck) pada suhu 37°C selama 24 jam. Agregasi
dinilai positif jika pada medium diperolehi agregat yang jelas (partikel seperti pasir)
membentuk mendakan didasar tiub, dan supernatan akan kelihatan jernih.
3.6.2 Ujian Koagregasi
Sebanyak 10 ml kultur Lactobacillus spp. dan 10 ml Salmonella spp. yang berusia 24

jam diempar secara berasingan pada kelajuan 4000 rpm selama 15 min pada suhu 4oC.
Supernatan di buang dan pelet dibasuh dengan menggunakan penimbal fosfat pada pH
7.2. Pelet kemudian diampaikan balik dalam penimbal garam fosfat (PBS). Ampaian
Lactobacillus spp. and Salmonella spp. disesuaikan pada ketumpatan optik (OD) 0.5 ±
0.02 yang diukur pada jarak gelombang 600 nm. Ampaian Salmonella spp. 0.5 ml dan
juga Lactobacillus spp. 0.5 ml dicampur dalam tiub gelas, dan dikacau sempurna
menggunakan vortex. Tiub kawalan mengandungi 1.0 ml ampaian dari masing-
masing spesies. Ketumpatan optik bakteria campuran, dan ampaian setiap masing-
masing strain bakteria diukur pada jarak gelombang 600 nm setelah pengeraman pada
suhu 37oC selama 4 jam. Peratusan koagregasi dihitung menggunakan persamaan
(Handley et al. 1987):
(A+B)/2 - C x 100
(A+B)/2
Dimana A dan B merupakan ketumpatan optik (OD 600 nm) dalam tiub kawalan
yang mengandungi hanya spesies Lactobacillus spp. atau Salmonella spp masing-
masing setelah pengeraman 4 jam; C merupakan ketumpatan optik (OD 600 nm)
kultur campuran setelah tempoh pengeraman yang sama. Setiap eksperimen dibuat
dua kali ulangan dan setiap pembacaan merupakan purata daripada tiga pencerapan.
35
3.6.3 Ujian Ketahanan terhadap pH Rendah
Ketahanan terhadap pH rendah dilakukan dengan mengubahsuai kaedah yang

dilakukan oleh Gusils et al. (2002b) dan Ehrmann et al. (2002). Kultur Lactobacillus
spp. semalaman diempar pada kelajuan 4000 rpm selama 15 min pada suhu 4oC.
Supernatan dibuang dan pelet dibasuh dengan menggunakan penimbal fosfat pada pH
7.2. Setelah pelet diampaikan balik dalam penimbal yang sama, ampaian tersebut
dicairkan dengan nisbah 1/10 dalam penimbal garam fosfat (PBS) steril pada pH 2.0,
2.5, 3.0, dan 3.5. Pencairan yang bersesuaian dilakukan setelah pendedahan selama 3
jam pada suhu 37oC. Sebanyak 0.1 ml cecair kultur diambil daripada pencairan
tersebut dan disebarkan di atas agar MRS dengan menggunakan kayu hoki dan
kemudian agar dieram pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni bakteria yang tumbuh
setelah pendedahan pada pH tertentu menunjukkan bakteria tersebut memiliki
kerintangan pada pH tersebut setelah pendedahan selama 3 jam. Setiap eksperimen
dibuat dua kali ulangan dan setiap pembacaan merupakan purata daripada tiga
pencerapan.
3.6.4 Ujian Ketahanan terhadap Garam Hempedu
Strain Lactobacillus spp. ditumbuhkan semalaman dalam kaldu MRS dan 10 ml dari
ampaian kultur yang ketumpatan optiknya (OD 600 nm) telah disesuaikan pada
bacaan 0.5 ± 0.02, diinokulasi ke dalam kelalang goncangan 250 ml yang
mengandungi 100 ml kaldu MRS dengan garam hempedu (Oxoid) 0.1, 0.3, 0.5 dan
1% (w/v) atau tanpa garam hempedu (yang berfungsi sebagai kawalan). Ketumpatan
optik pada jarak gelombang 600 nm disesuaikan pada bacaan 0.5 ± 0.02 berfungsi
untuk mempiawaikan jumlah bakteria 107-108 cfu/ml. Kultur kemudian dieram dalam
inkubator penggoncang (Infors HT Multitron, German) dengan goncangan 150 rpm
pada suhu 37oC. Ketumpatan optik yang dipadankan dengan kawalan pada jarak
gelombang 600 nm, diukur setelah pengeraman pada suhu 37oC pada jam ke- 2, 4, 6,
8, 10, 12, 18 dan 24. Setiap eksperimen dibuat dua kali ulangan dan setiap pembacaan
merupakan purata daripada tiga pencerapan.
36
3.7 PENENTUAN HUBUNGKAIT DIANTARA Lactobacillus spp. DAN

Salmonella spp.
Untuk penentuan hubungkait antara Lactobacillus spp. dan Salmonella spp., sebanyak
tiga kaedah dilakukan iaitu ujian agar titik, asai telaga serapan, dan kaedah cakera
kosong. Kaedah-kaedah ini diubah suai berdasarkan kaedah yang digambarkan oleh
Schillinger & Lucke (1989), Jin et al. (1996), dan Nowroozi et al. (2004).
3.7.1 Ujian Agar Titik
Kultur Lactobacillus spp. semalaman dititikkan (± 3 mm) di atas agar MRS (Merck)
dan dieram secara anaerobik selama 24 jam pada suhu 37oC untuk pembentukan
koloni bakteria. Kemudian sebanyak 1 ml inokulum Salmonella spp. (± 5 x 109
cfu/ml) dimasukkan ke dalam 14 ml agar Brain Heart Infusion (BHI) di mana agar
BHI mestilah masih dalam keadaan cair dengan suhu lebih kurang 40oC, seterusnya
dituangkan di atas agar MRS yang telah ditumbuhi koloni strain Lactobacillus spp.
Agar dibiarkan beku dan dieram dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam.
Diameter zon perencatan yang berlaku disekeliling koloni strain Lactobacillus spp.
diukur dan dicatat untuk menentukan hubungkait antara Lactobacillus spp. dan
Salmonella spp. Ujian untuk setiap strain Lactobacillus spp. terhadap Salmonella spp.
dilakukan tiga kali ulangan dengan duplikat setiap masing-masingnya.
3.7.2 Asai Telaga Sebaran
Sebanyak 20 ml agar nutrient dituang ke dalam piring petri. Setelah beku, agar
tersebut dilapisi dengan 12 ml agar nutrien separa pepejal yang sudah diinokulatkan
75 µl inokulum Salmonella spp. Untuk menghasilkan agar nutrien separa pepejal ini
sebanyak 0.88 g kaldu nutrien dicampurkan bersama 1.0 g agar bacto dalam 100 ml
air suling. Setelah membentuk dua lapisan agar, telaga berdiameter 5 mm dibuat pada
agar nutrien tersebut menggunakan pengorek sumbat (cork borer) dan sebanyak
100 µl supernatan bebas sel (CFCS) Lactobacillus spp. dimasukkan ke dalam telaga
dan dieram dalam inkubator pada suhu 37oC selama 24 jam. Diameter zon perencatan
yang berlaku pada agar diperhatikan dan diukur untuk menentukan hubungkait antara
Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. Ujian untuk setiap supernatan bebas sel
37
Lactobacillus spp. terhadap Salmonella spp. dilakukan tiga kali ulangan dengan
duplikat setiap masing-masingnya.
3.7.3 Kaedah Cakera Kosong
Sebanyak lima cakera kosong steril diletakkan di atas piring petri yang mengandungi
agar nutrien (Merck) dimana 50 µl inokulum Salmonella spp. telah diinokulat ke
dalam agar nutrien tersebut. Kertas cakera kosong steril tersebut diletakkan 4 di tepi
dan 1 di tengah. Sebanyak 50 µl supernatan strain Lactobacillus spp. dititikkan di atas
kertas cakera kosong steril yang berada di tepi. Sebagai kawalan, 50 µl kaldu MRS
dititikkan pada kertas cakera kosong yang ada di tengah. Piring petri tersebut
kemudian dieram dalam inkubator pada suhu 37 oC selama 24 jam. Diameter zon
perencatan yang berlaku di sekeliling kertas cakera kosong diperhatikan dan diukur
untuk menentukan hubungkait antara Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. Ujian
untuk setiap supernatan bebas sel Lactobacillus spp. terhadap Salmonella spp.
dilakukan tiga kali ulangan dengan duplikat setiap masing-masingnya
3.7.4 Penyediaan Inokulum Salmonella spp
Sebanyak 4-5 koloni tunggal Salmonella spp. di ambil daripada agar nutrien dan
diinokulatkan ke dalam 100 ml kaldu nutrien yang steril. Kaldu dieram menggunakan
mesin penggoncang (Infors HT multitron, German) pada suhu 37oC selama 18 hingga
24 jam dengan kadar goncangan 150 rpm.
3.7.5 Penyediaan Supernatan Bebas Sel (CFCS)
Sebanyak 4-5 koloni tunggal setiap strain Lactobacillus spp. diinokulatkan ke dalam
kelalang goncangan 500 ml yang mengandungi 100 ml kaldu MRS steril (Merck).
Kaldu dieram dalam mesin penggoncang (Infors HT Multitron, German) pada suhu
37oC selama 18 hingga 24 jam dengan kadar goncangan 150 rpm. Selepas 18 hingga
24 jam, kaldu diempar pada kelajuan 4000 rpm selama 15 minit pada suhu 4oC bagi
memisahkan supernatan dan sel. Supernatan diambil untuk penentuan aktiviti
antibakteria di mana supernatan perlu dituraskan terlebih dahulu menggunakan kertas
38
turas yang steril dengan saiz liang 0.22 µm (Millipore) sebelum dipindahkan ke dalam
tiub falkon steril.
3.8 PENYEDIAAN MEDIUM FERMENTASI
3.8.1 Medium Inokulum
Medium inokulum adalah kaldu De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (De Man et al. 1960)
(Merck) dengan pH 6.0 ± 0.2. Medium disteril pada suhu 121oC selama 15 min.
Komponen kaldu MRS dapat dilihat pada (Jadual 3.1).
3.8.2 Medium Pengkulturan
Medium pengkulturan adalah kaldu deMan, Rogosa, Sharpe (MRS) (De Man et al.
1960) (Merck) dengan pH 6.0 ± 0.2. Komponen medium pengkulturan per liter sesuai
dengan jadual 3.1 adalah sebagai berikut: (a) Pepton 10 g, Ekstrak lembu 10 g,
Ekstrak yis 5 g, Tween 80 1 g, Triammonium sitrat 2 g, Sodium asetat 5 g,
Magnesium sulfat 0.1 g, Manganum sulfat 0.05 g, di-potassium fosfat 2 g; dan (b)
Glukosa 20 g. Untuk membuat kaldu MRS daripada komponen tersebut, komponen
(a) dan (b) diautoklaf berasingan. Penyesuaian pH 6.0 ± 0.2 dilakukan dengan
menambahkan HCl 0.5 N pada komponen (a) sebelum diautoklaf. Ubahsuai medium
dilakukan pada kajian kesan kepekatan glukosa ke atas pertumbuhan Lactobacillus
spp. Ubahsuai medium dilakukan dengan mempertingkatkan lagi kepekatan glukosa
mengikut parameter tertentu. Kepekatan glukosa diubah kepada 30 dan 40 g/L.
Peningkatan kepekatan glukosa dilakukan dengan pemberian larutan glukosa steril
dengan kepekatan yang dikehendaki ke dalam kaldu MRS yang sudah disterilkan.
Pensterilan kaldu MRS dan larutan glukosa dilakukan berasingan. Kaldu MRS
diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 min, sedangkan larutan glukosa diautoklaf pada
suhu 110˚C selama 10 min. Hal ini dilakukan untuk mengelakkan terjadinya tindak
balas antara larutan glukosa dan kaldu MRS semasa autoklaf yang boleh
menyebabkan rosaknya medium yang dikehendaki.
39
Jadual 3.1 Komponen medium kaldu De Man-Rogosa-Sharpe (MRS)

Komponen Kepekatan (g/L)
Pepton 10.0
Ekstrak lembu 10.0
Ekstrak yis 5.0
Glukosa 20.0
Tween 80 1.0
Triammonium sitrat 2.0
Sodium asetat 5.0
Magnesium sulfat 0.1
Manganum sulfat 0.05
di-potassium fosfat 2.0
3.9.......PENGKULTURAN L. salivarius subsp. salivarius IG DALAM KULTUR

KELOMPOK
Semua eksperimen pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius IG sama ada dalam

kelalang goncangan mahupun dalam fermentor, dijalankan pada suhu 37oC, sebab
menurut Buchanan & Gibson (1974), Lactobacillus salivarius tumbuh optimum pada
suhu 35-40oC.
3.9.1 Penyediaan Inokulum
Sebanyak 4-5 koloni tunggal bakteria dimasukkan ke dalam kelalang goncangan 250
ml yang mengandungi 100 ml kaldu MRS dan dieram pada suhu 37oC dengan
goncangan 150 rpm (Incubator shaker, INFORS) selama 18 jam. Inokulum pada
setiap eksperimen dipiawaikan pada nilai ketumpatan optik (OD) 0.5 ± 0.02 dengan
dibaca pada jarak gelombang 600 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS
(UVmini-1240, Shimadzu). Pemiawaian dilakukan dengan mengampaikan balik
kultur pada medium segar MRS dan ketumpatan optiknya disesuaikan pada bacaan
0.5 ± 0.02 atau bersamaan dengan 107-108 cfu/ml.
40
3.9.2 Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam Kelalang

Goncangan
L. salivarius subsp. salivarius IG dikulturkan di dalam kelalang goncangan 500 ml

yang mengandungi 100 ml kaldu MRS (Merck) pada suhu 37oC. Sebanyak 10% (v/v)
inokulum dimasukkan ke dalam kelalang goncangan. Kesan goncangan, pH awal dan
kepekatan glukosa awal dilakukan dalam kelalang goncangan tersebut. Pengkulturan
dilakukan pada goncangan 100, 150, 200 dan 250 rpm untuk mengkaji kesan
goncangan ke atas profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG.
Pengkulturan juga dilakukan pada pH awal 2, 3, 4, 5, 6 dan 7 untuk mengkaji kesan
pH awal ke atas profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG pada goncangan
yang terbaik. Selain itu, pengkulturan pada kepekatan glukosa awal 10, 20, 30, 40
dan 50 g/L juga dilakukan untuk mengkaji kesan kepekatan glukosa awal ke atas
profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG pada goncangan dan pH yang
terbaik. Pensampelan sebanyak 1 ml dilakukan pada jam ke-2, 4, 6, 8, 10, 12, 18 dan
24 untuk penentuan ketumpatan sel dan pengasaian kepekatan biojisim. Setiap
eksperimen dibuat dua kali ulangan dan setiap pembacaan merupakan purata daripada
dua kali pencerapan.
3.9.3 Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam Fermentor
Fermentasi secara kultur kelompok dilakukan dalam fermentor 5 L (Infors HT

Minifors, UK). Sebanyak 10% (v/v) inokulum dimasukkan ke dalam fermentor
dengan isipadu akhir kultur sebanyak 2 L yang mengandungi 1800 ml medium
pengkulturan. Pengkulturan dilakukan pada suhu 37oC, pH 6.0, aliran gas nitrogen
0.5 v/v/m dan goncangan 150 rpm selama 48 jam. pH dikawal dengan menambahkan
larutan NaOH 10N secara automatik. Pensampelan 3 ml dilakukan pada jam ke-2, 4,
6, 8, 10, 12, 18, 24, 36 dan 48 untuk penentuan ketumpatan sel, pengasaian kepekatan
biojisim, pembentukan unit koloni, kepekatan glukosa terguna dan kepekatan
ammonium terguna. Eksperimen dilakukan dua kali ulangan dan setiap pembacaan
merupakan purata daripada dua kali pencerapan.
41
3.10 PENGKULTURAN L. salivarius subsp. salivarius IG DALAM KULTUR

SELANJAR
3.10.1 Kesan Kadar Pencairan ke atas Pertumbuhan L. salivarius subsp.

salivarius IG
Penyediaan inokulum dilakukan sama seperti dalam bahagian 3.8.1. Kultur selanjar
dilakukan dalam fermentor 5 L (Infors HT Minifors, UK). Sebanyak 10% (v/v)
inokulum dimasukkan ke dalam fermentor dengan isipadu kultur sebanyak 2 L yang
mengandungi 1800 mL medium penghasilan. Kultur selanjar dimulakan selepas 6 jam
pertumbuhan dalam kultur kelompok pada suhu 37oC, pH 6.0, aliran gas nitrogen
0.5 v/v/m dan goncangan sebanyak 150 rpm dengan enam kadar pencairan (D) yang
berbeza iaitu 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.35, 0.45/jam dan setiap eksperimen dilakukan dua
replikasi. Aliran medium masuk dan keluar setiap kadar pencairan dikawal oleh pam
peristaltik (Watson-Marlow LTD., Falmouth., Cornwall, UK). Sebelum memulakan
eksperimen, pam peristaltik perlu dikalibrasikan terlebih dahulu agar kadar alir
dikehendaki dapat beroperasi dengan tepat di sepanjang eksperimen (Lampiran C.2).
Keenam-enam eksperimen mengkaji kesan kadar pencairan dilakukan dalam enam
eksperimen yang berasingan. Sebanyak 10 ml sampel diambil pada jam ke-2, 4, 6, 8,
10, 12, 18, 24, 36, 48, 60, 72, 84 dan 96. Penentuan ketumpatan sel, pengasaian
kepekatan biojisim, pembentukan unit koloni, kepekatan glukosa dan kepekatan
ammonium dilakukan seperti dalam bahagian 3.11. Nilai bacaan dipuratakan dengan
penentuan triplikasi.
3.10.2 Kesan Kepekatan Glukosa ke atas Pertumbuhan L. salivarius subsp.

salivarius IG
Secara umum, pengkulturan sama seperti dalam bahagian 3.10.1. Pengkulturan dalam
ujian kesan kepekatan glukosa ini, dilakukan pada kadar pencairan yang terbaik
berdasarkan hasil yang didapatkan pada eksperimen 3.10.1. Selain itu, pengkulturan
dalam ujian ini, dilakukan dengan mempertingkatkan lagi kepekatan glukosa awal
dalam medium pengkulturan menjadi 30 dan 40 g/L.
42
3.11 PENGASAIAN
3.11.1 Penentuan Berat Kering Biojisim
Sebanyak 1 ml sampel di ambil dan nilai ketumpatan optik (OD) dibaca pada jarak
gelombang 600 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS (UVmini-1240,
Shimadzu). Kepekatan biojisim dapat ditentukan melalui lengkuk piawai sel berat
kering lawan dengan bacaan OD (Lampiran A.1 ).
3.11.2 Penentuan Unit Pembentukan Koloni
Sebanyak 0.1 ml cecair kultur diambil daripada setiap pencairan dan disebarkan di
atas agar MRS dengan menggunakan kayu hoki (Kask et al. 1999). Kemudian agar
dieram pada suhu 37oC selama 24 jam. Koloni bakteria yang tumbuh dikira bagi
menentukan pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG.
3.11.3 Penentuan Kepekatan Glukosa
Kepekatan glukosa dalam medium kultur ditentukan dengan menggunakan Kit GOD-
glucose oxidase (Manheim Boehringer). Sampel medium dicairkan berdasarkan
faktor pencairan yang dikehendaki (10, 20 atau 50 kali) (Lampiran A.2). Sebanyak 10
µl hasil pencairan ditambahkan ke dalam 1 ml reagen Kit GOD-glucose oxidase yang
telah dipraeram selama 2 min di dalam pengeram air pada 37oC. Campuran
digoncang dan dibiarkan selama 10 min. Selepas 10 min, bacaan ketumpatan optik
pada jarak gelombang 500 nm diambil menggunakan spektrofotometer UV-VIS
(UVmini-1240, Shimadzu) dan kepekatan ditentukan berdasarkan lengkuk piawai
glukosa.
3.11.4 Penentuan Kepekatan Ammonium
Ujian indofenol menggunakan kaedah Chaney dan Marbach (1962) dilakukan bagi
menentukan kepekatan ammonium. Sampel medium kultur dicairkan berdasarkan
faktor pencairan yang dikehendaki. Sebanyak 2.5 ml reagen A (10 ml fenol/L dan 50
43
mg sodium nitroprusside/L) dan 2.5 ml reagen B (5 g NaOH/L dan 19.8 ml sodium

hipoklorida) bersuhu bilik dicampurkan dengan 0.5 ml sampel yang telah dicairkan.
Campuran digoncang dan dibiarkan pada suhu bilik selama 30-45 min. Bacaan
ketumpatan optik pada jarak gelombang 625 nm diambil menggunakan
spektrofotometer UV-VIS (UVmini-1240, Shimadzu) dan kepekatan ditentukan
berdasarkan lengkuk piawai ammonium.
3.12 UJIAN STATISTIK
Ujian statistik dilakukan terhadap data kesan kepekatan glukosa awal (20, 30 dan 40
g/L) pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas kepekatan biojisim menggunakan Ujian
sampel T berpasangan (perisian SPSS versi 13, USA) di mana aras keyakinan adalah
95% (p<0.05).
3.13 CARTA ALIR PENYELIDIKAN
Pertama-tama yang dilakukan dalam penyelidikan ini adalah memencil dan

mengenalpasti strain Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. daripada usus ayam
kampung tempatan. Setelah itu, ujian agregasi, koagregasi, kerintangan terhadap pH
rendah, kerintangan terhadap garam hempedu dan ujuan aktiviti perencatan ke atas
Salmonella spp. dilakukan untuk mengesahkan Lactobacillus spp. yang unggul.
Kemudian pengkulturan Lactobacillus spp. yang unggul (L. salivarius subsp.
salivarius IG) dalam kelalang goncangan dilakukan untuk mengetahui kadar
goncangan, pH awal dan kepekatan glukosa awal yang terbaik. Selanjutnya
pengkulturan secara kelompok dilakukan dalam fermentor untuk mengkaji kinetik dan
analisis data pertumbuhan bagi pembangunan kultur selanjar. Kajian kultur selanjar
dalam fermentor dilakukan dengan mengkaji kesan kadar pencairan terhadap
produktiviti biojisim L. salivarius subsp. salivarius IG. Setelah itu, kajian kepekatan
glukosa awal terhadap produktiviti biojisim L. salivarius subsp. salivarius IG
dilakukan pada kadar pencairan yang terbaik. Carta alir penyelidikan ini terdapat
pada Rajah 3.1.
44
Pemencilan dan pengenalpastian Pemencilan dan pengenalpastian

Lactobacillus spp. Salmonella spp.
Pengesahan Lactobacillus spp. yang ▪ ujian agregasi

memiliki ciri unggul dan berdaya ▪ ujian koagregasi
merencat pertumbuhan Salmonella spp. ▪ ujian kerintangan
terhadap pH
rendah
L. salivarius subsp. salivarius IG ▪ ujian kerintangan
terhadap garam
hempedu
▪ ujian aktiviti
Eksperimen dalam kelalang goncangan perencatan
Kesan goncangan terhadap

pertumbuhan L. salivarius subsp.
salivarius IG
Kesan pH awal terhadap pertumbuhan

L. salivarius subsp. salivarius IG
Kesan kepekatan glukosa awal terhadap

salivarius IG
Eksperimen dalam Fermentor
Kultur kelompok Kultur selanjar
Kesan kadar pencairan terhadap

Kajian kinetik dan analisis data produktiviti L. salivarius subsp.
pertumbuhan bagi pembangunan salivarius IG
kultur selanjar
Kesan kepekatan glukosa awal terhadap

salivarius IG
Rajah 3.1. Carta alir penyelidikan

BAB IV
HASIL DAN PERBINCANGAN
4.1 PEMENCILAN Lactobacillus spp. DAN Salmonella spp.
Sebanyak lapan isolat Lactobacillus spp. berjaya dipencilkan daripada usus ayam
kampung tempatan dan dikenalpasti menggunakan Kit API 50 CHL. Strain tersebut
ialah L. fermentum IA, L. fermentum IB, L. fermentum IC, L. fermentum ID,
L. salivarius subsp. salicinus IE, L. salivarius subsp. salicinus IF, L. salivarius
subsp. salivarius IG, dan Lactobacillus spp. IH (Jadual 4.1.1). Dua strain Salmonella
juga berjaya dipencilkan daripada sumber yang sama dan dikenalpasti menggunakan
Kit API 20 E. Strain tersebut iaitu Salmonella spp. 3B21 dan Salmonella spp. 1A12
(Jadual 4.1.1). Profil biokimia atau profil fermentasi daripada pencilan Lactobacillus
spp. dan Salmonella spp. dapat dilihat pada Jadual 4.1.2 dan 4.1.3. Morfologi
Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. disahkan melalui pencerapan menggunakan
mikroskop cahaya (Gambar 4.1) dan pengimbasan mikroskop elektron (SEM)
(Gambar 4.2).
Jadual 4.1.1 Pengenalpastian strain Lactobacillus spp. dan Salmonella spp.
Kod Pengenalpastian biokimia
IA Lactobacillus fermentum
IB Lactobacillus fermentum
IC Lactobacillus fermentum
ID Lactobacillus fermentum
IE Lactobacillus salivarius subsp. salicinus
IF Lactobacillus salivarius subsp. salicinus
IG Lactobacillus salivarius subsp. salivarius
IH Lactobacillus spp.
3B21 Salmonella spp.
1A12 Salmonella spp.
46
Jadual 4.1.2 Profil biokimia strain Lactobacillus spp. pada kit API 50 CHL
Sumber Strain Lactobacillus spp.

Karbon IA IB IC ID IE IF IG IH
LArabinosa w - + - - - - +
Cellobiosa - - - - - - - +
Fruktosa - - - - + + + +
Galaktosa + + + + + + + +
Glukosa + + + + + + + +
Laktosa + + + + + + + +
Maltosa + + + + + + + +
Mannitol - - - - + + + +
Mannosa - - - - + + + +
Melezitosa - - - - - - - +
Mellibiosa + + + + + + + +
Raffinosa + + + + + + + w
Rhamnosa - - - - - - + w
Ribosa + w w - - - - +
Salisin - - - - + + - +
Eskulin - - - - + + - +
Sorbitol - - - - + + + +
Sukrosa + w + + + + + +
Trehalosa - - - - + + + +
Xilosa - - - - - - - -
Glukonat + - + + - - - +
Xilitol - - - - - + - -
Tindak balas (+) positif, (-) negatif, (w) lemah
Jadual 4.1.3 Profil biokimia strain Salmonella spp. pada kit API 20 E
Strain Salmonella spp.

Substrat Salmonella spp. Salmonella spp.
3B21 1A12
Sodium thiosulfat H2S + H2S +
Gelatin + -
D-Glukosa + +
D-Mannitol + +
Inositol - +
D-Sorbitol + +
L-Rhamnosa + +
D-Sukrosa + -
D-Mellibiosa + +
Amigdalin - -
L-Arabinosa + +
Tindak balas (+) positif, (-) negatif, (H2S +) menghasilkan H2S
47
A B
C D
E F
Gambar 4.1 Fotomikrograf Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. menggunakan

mikroskop cahaya. L. fermentum IA (A); L. salivarius subsp.
salicinus IF (B); Lactobacillus spp. IH (C); L. salivarius subsp.
salivarius IG (D); Salmonella spp. 3B21 (E); Salmonella spp. 1A12
(F) (x1000).
48
Gambar 4.2 Fotomikrograf mikroskop elektron imbasan terhadap sel L. salivarius

subsp. salivarius IG (A) dan Salmonella spp. 3B21 (B) (x20,000).
Spesies Lactobacillus yang didapatkan dalam kajian ini bersesuaian dengan

kajian oleh Hammes & Hertel (2006) dan kajian oleh Walter (2005). Menurut
(Hammes & Hertel 2006; Walter 2005), spesies Lactobacillus yang biasanya
dijumpai dalam saluran gastrousus ayam ialah L. acidophilus, L. crispatus,
L. gallinarum, L. johnsonii, L. animalis, L. salivarius, L. agilis, L. aviarius,
L. reuteri, L. fermentum dan L. brevis. Dari spesies-spesies tersebut, yang majoriti
terdapat dalam usus ayam ialah L. crispatus, L. gallinarum, L. johnsonii,
L. salivarius dan L. reuteri (Hammes & Hertel 2006; Walter 2005).
49
4.2 UJIAN PENCIRIAN IN VITRO Lactobacillus spp.
4.2.1 Ujian Agregasi
Daripada lapan strain Lactobacillus spp. yang dipencilkan daripada saluran

gastrousus ayam kampung tempatan, aktiviti agregasi dijumpai pada 6 pencilan
(Jadual 4.2). Hasil tersebut menunjukkan bahawa semua strain Lactobacillus spp.
tersebut memiliki kemampuan untuk beragregasi dalam saluran gastrousus ayam.
Huis in’t Veld et al. (1994) berpandangan bahawa salah satu mekanisma yang dapat
meningkatkan potensi bakteria untuk wujud dan bertahan hidup dalan saluran
gastrousus adalah kemampuan mereka untuk beragregasi. Oleh itu, keenam-enam
pencilan tersebut diduga mampu bertahan hidup di dalam saluran gastrousus ayam.
Kemampuan beragregasi disebabkan kerana pengumuhan protein bersaiz

32 kDa sebagaimana yang dilaporkan oleh Reniero et al. (1992). Protein tersebut
dijumpai di dalam supernatan dan bertindak sebagai aggregation-promoting factor
(APF). Protein APF sangat penting bagi Lactobacillus spp. yang secara langsung
dapat mengawal bentuk selnya, dan secara tidak langsung terlibat dalam proses
sintesis peptidoglikan, eksopolisakarida, asid lipoteichoic dan asid teichoic (Jankovic
et al. 2003). Aktiviti agregasi pada bakteria asid laktik diduga menggunakan
komponen ekstraselularnya iaitu protein, lipid, karbohidrat dan asid lipoteichoic
(Gusils et al. 2002a).
A B
Gambar 4.3 .Agregasi positif Lactobacillus salivarius subsp. salivarius IG (A)......

.dan agregasi negatif Lactobacillus fermentum IB (B)
50
4.2.2 Ujian Koagregasi
Kemampuan koagregasi lapan spesies Lactobacillus spp. terhadap Salmonella

spp. dalam kajian ini secara umumnya menunjukkan peratusan dalam julat 1.0-13.8%
(Jadual 4.2). Peratus koagregasi tertinggi terhadap kedua-dua Salmonella sehingga
13.8% dijumpai pada L. salivarius subsp. salivarius IG, manakala L. fermentum IA
menunjukkan peratusan yang paling rendah (1.0%).
Disebabkan peratus koagregasi L. salivarius subsp. salivarius IG adalah yang

tertinggi, L. salivarius subsp. salivarius IG dianggap sangat berpotensi sebagai
probiotik untuk ayam dibandingkan dengan Lactobacillus yang lain. Data koagregasi
menjelaskan bahawa L. salivarius subsp. salivarius IG memiliki kemampuan
memerangkap Salmonella spp. dan menghasil bahan antimikrob bila berada dalam
satu sekitaran yang sama dengan Salmonella spp. tersebut, sebagaimana yang
dilaporkan oleh (Rinkinen 2004). Menurut Reid et al. (1988), kemampuan koagregasi
merupakan suatu mekanisma mempertahankan diri yang penting bagi mikroflora
normal.
Jadual 4.2 Agregasi, koagregasi dan kerintangan terhadap pH rendah pada

Lactobacillus spp. yang dipencilkan daripada ayam kampung Malaysia
Strain Lactobacillus spp.

IA IB IC ID IE IF IG IH
Agregasi +
a
-
b - + + + + +
Koagregasi
dengan:
Salmonella 2.9±2.3 c 2.3±1.1 3.4±1.2 3.4±2.2 6.9±1.6 12.4±1.3 6.4±1.9
1.9±1.4
3B21
Salmonella 1.0±2.0 1.2±1.7 2.8±2.5 3.6±3.7 5.9±4.6 4.5±2.9 13.8±2.1 5.1±2.8
1A12
Kerintangan
terhadap pH
rendah
2 - - - - - - - -
2.5 - e - + - + + +
-
3 + + + + + + + +
3.5 d + + + + + + +
+
a. agregasi positif ; b agregasi negatif; c. purata peratusan koagregasi (%) ± sisihan piawai
d. tumbuh; e. tidak tumbuh
51
4.2.3 Kerintangan terhadap pH Rendah
Kerintangan terhadap variasi pH (Jadual 4.2) menunjukkan bahawa seluruh

strain Lactobacillus spp. yang diuji mampu bertahan pada pH 3 dan 3.5 setelah
pengeraman selama 3 jam. Tetapi, tidak satupun strain yang mampu bertahan pada
pH 2. Di sisi lain, ada 4 strain yang mampu bertahan pada pH 2.5, iaitu L. fermentum
ID, L. salivarius subsp. salicinus IF, L. salivarius subsp. salivarius IG, dan
Lactobacillus spp. IH.
Jacobsen et al. (1999) berpendapat bahawa pH 2.5 nampaknya cukup untuk

merosakkan sel bakteria, oleh itu keempat-empat strain tersebut menunjukkan ciri
probiotik Lactobacillus spp. yang baik, justeru mampu mandiri di dalam saluran
gastrousus ayam dimana pH saluran tersebut dapat serendah 0.5-2.0 sebagaimana
yang dilaporkan oleh Ehrmann et al. (2002). Gotcheva et al. (2002) menyatakan
bahawa syarat bagi suatu mikroorganisma tersebut untuk menjadi probiotik ialah
dapat bertahan pada pH 3.0 selama 2 jam.
Keupayaan yang tinggi daripada keempat-empat strain Lactobacillus tersebut

(ID, IF, IG dan IH) untuk koagregasi boleh meningkatkan kerintangan terhadap pH
rendah. Sel-sel bakteria yang berada di sebelah luar daripada suatu kumpulan
koagregasi, jika berada dalam sekitaran pH rendah dapat meningkatkan daya bertahan
hidup sel-sel yang dilindungi di dalam kumpulan koagregasi tersebut. Sel-sel sebelah
luar mungkin akan mati. Maka sel-sel yang sebelah dalam akan berjaya sampai ke
tempat dituju untuk meneruskan pembiakan.
4.2.4 Kerintangan terhadap Garam Hempedu
Rajah 4.1 menunjukkan bahawa garam hempedu berkesan merencat

pertumbuhan lapan strain Lactobacillus spp. Semua strain Lactobacillus spp. yang
diuji mengalami masa lag yang lama dalam kehadiran garam hempedu 0.5% dan 1%.
L. fermentum ID adalah pencilan yang paling toleran terhadap garam hempedu 0.5%
dan 1% sebab masa lagnya adalah terpendek, manakala masa lag L. salivarius subsp.
salicinus IE adalah yang terpanjang.
52
a) Lactobacillus fermentum IA 3
b) Lactobacillus fermentum IB
3
Serapan optik (600 nm)

Serapan optik (600 nm) 2.5
2.5
2 2
1.5 1.5
1 1
0.5 0.5
0 0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 48 0 2 4 6 8 10 12 18 24 48
Masa (j) Masa (j)
c) Lactobacillus fermentum IC d) Lactobacillus fermentum ID

3 3

2.5 2.5
2 2
1.5 1.5
1 1
0.5 0.5
0 0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 48 0 2 4 6 8 10 12 18 24 48
Masa (j) Masa (j)
e) Lactobacillus salivarius ss. salicinus IE f) Lactobacillus salivarius ss. salicinus IF

3 3
2.5 2.5
2 2
1.5 1.5
1 1
0.5 0.5
0 0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 48 0 2 4 6 8 10 12 18 24 48
Masa (j) Masa (j)
g) Lactobacillus salivarius ss. salivarius IG h) Lactobacillus spp. IH
3 3
2.5 2.5
2 2
1.5 1.5
1 1
0.5 0.5
0 0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 48 0 2 4 6 8 10 12 18 24 48
Masa (j) Masa (j)
Rajah 4.1 Profil pertumbuhan strain Lactobacillus spp. (a-h) dalam kaldu MRS
dengan pemberian 0.1-1.0% (w/v) garam hempedu (bile salts). Kultur
kawalan tanpa garam hempedu (bile salts). 0.30%
kawalan 0.10% 0.30% 0.50% 1%
53
Dalam kehadiran garam hempedu 0.3%, pertumbuhan L. salivarius subsp.

salivarius IG dan Lactobacillus spp. IH menunjukkan masa lag yang lebih pendek
dibandingkan Lactobacillus spp. yang lain. Hasil ini menyokong data sebelumnya
bahawa L. salivarius subsp. salivarius IG memiliki ciri probiotik yang baik. Hal
tersebut disebabkan ketahanan terhadap pH rendah dan kerintangan terhadap garam
hempedu adalah ciri yang sangat penting untuk kemandirian dan pertumbuhan
probiotik didalam saluran gastrousus ayam (Havenaar et al. 1992).
Kerintangan terhadap garam hempedu pada beberapa strain berhubungkait

dengan aktiviti enzim spesifik-bile salt hydrolase (BSH) yang membantu
menghidrolisis konjugat garam hempedu sehingga mengurangkan kesan toksiknya
(Du Toit et al. 1998). Aktiviti BSH sering kali dijumpai pada organisma yang
dipencilkan daripada usus atau tahi haiwan (Bateup et al. 1995; Tanaka et al. 1999).
4.3 HUBUNGKAIT DIANTARA Lactobacillus spp. DAN Salmonella spp.
Beberapa hipotesis dapat dikemukakan terhadap hubungkait Lactobacillus-

Salmonella, dimana laktobacilli menentang mikrob patogen dengan merembeskan
bahan-bahan rencatan seperti asid laktik dan bakteriosin (Vandenbergh 1993), serta
wujudnya persaingan antara lactobacilli dengan mikrob patogen untuk mendapatkan
nutrien yang mencukupi. Kajian aktiviti hubungkait yang wujud antara Lactobacillus
spp. dengan Salmonella spp. dapat dijelaskan dengan terhasilnya zon perencatan pada
medium agar.
Ujian aktiviti perencatan Lactobacillus spp. terhadap Salmonella spp.

diperlihatkan dalam Jadual 4.3. Sebanyak lapan strain Lactobacillus spp.
menunjukkan zon perencatan terhadap kedua-dua strain Salmonella spp. Berdasarkan
ujian agar titik (Gambar 4.4 A), jejari zon perencatan berjulat antara 4.8 mm hingga
12.4 mm. Daripada lapan strain tersebut, L. salivarius subsp. salicinus IE,
L. salivarius subsp. salicinus IF, L. salivarius subsp. salivarius IG, dan Lactobacillus
spp. IH berkesan dalam merencat pertumbuhan Salmonella spp., dimana L. salivarius
subsp. salivarius IG adalah yang paling berkesan merencat pertumbuhan Salmonella
spp. dengan jejari zon perencatan yang paling lebar (10.6 mm dan 12.4 mm) terhadap
54
masing-masing strain Salmonella spp. Manakala, L. fermentum IC adalah yang

paling rendah dalam merencat pertumbuhan Salmonella spp. dengan jejari zon
perencatan yang paling kecil (4.8 mm dan 5.5 mm).
Pertumbuhan kedua-dua strain Salmonella spp. tersebut juga direncat oleh

supernatan bebas sel (CFCS) daripada kesemua Lactobacillus spp. Berdasarkan data
asai telaga sebaran dan kaedah cakera kosong (Jadual 4.3), hasil menunjukkan
bahawa supernatan bebas sel (CFCS) L. salivarius subsp. salivarius IG juga
menunjukkan zon perencatan yang paling besar terhadap kedua-dua Salmonella spp.,
dimana pada asai telaga sebaran, jejari zon perencatan masing-masing Salmonella
spp. ialah 8.4 mm dan 8.9 mm, manakala pada kaedah cakera kosong, jejari zon
perencatan masing-masing Salmonella spp. ialah 7.3 mm dan 8.7 mm.
Hasil ini bersesuaian dengan laporan Gariga et al. (1998) dan Walter (2005)
bahawa L. salivarius merupakan spesies dominan diantara mikroflora dalam usus
anak ayam dan ayam dewasa. Pascual et al. (1999) juga menyimpulkan bahawa
keupayaan L. salivarius sangat kuat dalam mengurangkan pengkolonian Salmonella
enteritidis secara in vivo. Laporan tersebut menyerlahkan data kajian bahawa
L. salivarius sebagai strain yang sesuai untuk penggunaan secara luas dalam industri
avian untuk meminimumkan pengkolonian Salmonella spp.
Jadual 4.3 Ujian aktiviti perencatan Lactobacillus spp. terhadap Salmonella spp.
Jejari zon cerah perencatan (mm) Salmonella spp.
Strain Lactobacillus Ujian agar titik Asai telaga sebaran Kaedah cakera kosong
S. 3B21 S. 1A12 S. 3B21 S. 1A12 S. 3B21 S. 1A12
L. fermentum IA 5.2 6.3 5.7 5.3 5.3 5.7
L. fermentum IB 5.3 6.1 6.0 6.4 5.0 5.6
L. fermentum IC 4.8 5.5 4.9 5.8 4.2 5.1
L. fermentum ID 5.7 5.6 5.5 6.0 5.2 5.9
L. salivarius ss. salicinus IE 10.3 10.9 7.8 8.3 6.5 7.0
L. salivarius ss. salicinus IF 9.9 10.1 8.0 8.8 6.3 6.5
L. salivarius ss. salivarius IG 10.6 12.4 8.4 8.9 7.3 8.7
Lactobacillus spp. IH 10.0 11.5 6.9 7.8 6.2 7.2
Setiap nilai adalah purata daripada tiga eksperimen dengan duplikat setiap masing-masingnya.
Aktiviti perencatan oleh supernatan bebas sel (CFCS) kemungkinan

disebabkan kerana beberapa bahan-bahan antibakteria yang terdapat dalam CFCS.
Bahan-bahan antibakteria daripada Lactobacillus berhubungkait dengan hasil
55
metabolisma seperti asid organik, bakteriosin dan hidrogen peroksida (Ehrmann et al.
2002). Keupayaan Lactobacillus untuk menghasilkan metabolit seperti asid laktik,
hidrogen peroksida dan bakteriosin telah disyorkan sebagai bahan-bahan yang
bertanggung jawab atas kemampuannya untuk merencat bakteria lain (Juven at al.
1992). Langhendries et al. (1995) juga melaporkan bahawa Lactobacillus spp.
mempertingkatkan kesan perlindungan dan terapeutiknya melalui penurunan pH usus
dengan cara perangsangan produksi asid laktik.
A B C
Gambar 4.4 Zon perencatan Salmonella spp. 3B21 terhadap strain Lactobacillus spp.
melalui ujian agar titik (A); asai telaga sebaran (B); kaedah cakera
kosong (C). a. L. salivarius subsp. salicinus IF; b. Lactobacillus spp.
IH; c. L. fermentum IA; d. L. salivarius subsp. salivarius IG;
e. kaldu MRS
Beberapa rujukan telah dikesan melaporkan perencatan Salmonella spp. oleh

Lactobacillus spp. Makras et al. (2006) melaporkan bahawa aktiviti antibakteria
daripada L. acidophilus IBB 801, L. amylovorus DCE 471, L. casei Shirota dan
L. rhamnosus GG adalah semata-mata disebabkan penghasilan asid laktik. Hasil
yang sama dilaporkan oleh Jin et al. (1996), bahawa aktiviti perencatan kultur
supernatan Lactobacillus spp. terhadap bakteria patogen adalah bukan disebabkan
oleh penghasilan bakteriosin ataupun hidrogen peroksida, melainkan kemungkinan
disebabkan oleh asid organik. Makras et al. (2006) berpandangan bahawa asid laktik
yang dihasilkan adalah bertanggungjawab untuk aktiviti perencatan signifikan ke atas
serangan Salmonella spp. ke dalam sel Caco-2/TC7. Kesemua laporan diatas
menyokong data-data yang diperolehi dalam kajian ini, bahawa Lactobacillus spp.
yang dipencilkan berjaya merencat Salmonella spp. yang juga dipencilkan daripada
sumber yang sama.
56
Berdasarkan ciri-ciri diatas: agregasi positif, peratus koagregasi sehingga

13.8% terhadap strain Salmonella spp., toleran terhadap pH 2.5, masa lag yang
singkat dalam kehadiran garam hempedu 0.3%, dan memiliki aktiviti perencatan yang
paling kuat terhadap Salmonella spp., maka L. salivarius subsp. salivarius IG
merupakan calon yang unggul untuk dijadikan sebagai probiotik untuk ayam.
L. salivarius subsp. salivarius IG selanjutnya digunakan sebagai strain probiotik
dalam pembangunan kultur kelompok dan selanjar dalam kajian ini.
4.4 PROFIL PERTUMBUHAN L. salivarius subsp. salivarius IG DALAM

KELALANG GONCANGAN
4.4.1 Kesan Kadar Goncangan, pH Awal dan Kepekatan Glukosa Awal

terhadap Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG
Kadar goncangan merupakan salah satu parameter yang perlu diperhatikan dalam
pengkulturan Lactobacillus spp. Pada suatu operasi dalam kelalang goncangan, ianya
berguna supaya kultur mencapai keseragaman dari segi kepekatan, suhu dan
pemindahan haba serta percampuran yang baik antara mikroorganisma dengan
substrat (Rushton 1946; Pirt 1975).
5
Kepekatan biojisim (g/L)
1 100 rpm
150 rpm
200 rpm
250 rpm
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Masa (j)
Rajah 4.2 Kesan kadar goncangan terhadap profil pertumbuhan L. salivarius
57
Rajah 4.2 menunjukkan kadar goncangan 150 rpm adalah kadar goncangan
yang terbaik untuk pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG. Kadar goncangan
150 rpm pada eksperimen tersebut menunjukkan kepekatan biojisim (g/L) yang lebih
tinggi dibandingkan dengan kadar goncangan 100, 200 dan 250 rpm. Hasil ini
bersesuaian dengan kajian Natarajan & Rajendran (2009) mengenai kesan kadar
goncangan ke atas penghasilan biojisim L. plantarum, dimana pada kajian tersebut
didapati bahawa kadar goncangan 150 rpm adalah kadar goncangan terbaik bagi
penghasilan biojisim L. plantarum. Di dalam fermentasi Lactobacillus spp.,
penggunaan kadar goncangan 150 rpm sering dilakukan. Contohnya, Ding & Tan
(2006) menggunakan kadar goncangan 150 rpm pada fermentasi L. casei secara suap
kelompok (fed-batch). Walaupun demikian, banyak kajian mengenai pertumbuhan
spesies Lactobacillus spp. yang menggunakan kadar goncangan selain daripada
150 rpm. Sebagai contoh, Gänzle et al. (2000) menggunakan kadar goncangan
200 dan 250 rpm dalam kajian pencirian reutericyclin yang dihasilkan oleh L. reuteri,
sedangkan De Vuys et al. (1996) menggunakan kadar goncangan 50 rpm untuk
biosintesis bakteriosin oleh L. amylovorus.
Kadar goncangan adalah salah satu faktor yang penting dalam proses
fermentasi kerana ianya boleh meningkatkan jumlah oksigen terlarut dalam medium
pengkulturan (Darah & Ibrahim 1996). Kadar goncangan yang optimum pada tiap
spesies Lactobacillus adalah berbeza dan ianya bergantung pada keperluan oksigen
Lactobacillus tersebut. Pada kajian ini, kadar goncangan yang terlalu tinggi (200 dan
250 rpm) menghasilkan kepekatan biojisim yang rendah. Hal ini boleh disebabkan
goncangan yang tinggi membuat kadar oksigen terlarut dalam medium kultur semakin
tinggi dan membuat pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG lebih rendah
dibandingkan dengan kadar goncangan 150 rpm. Kadar oksigen terlarut yang tinggi
dalam medium boleh jadi kurang disukai oleh L. salivarius subsp. salivarius IG
mengingat bakteria tersebut adalah fakultatif anaerob.
Menurut Rushton (1946), goncangan pada kultur berperan untuk

meningkatkan koefisien pertukaran gas (KLa) melalui tiga cara. Pertama,
mencencang aliran udara menjadi gelembung-gelembung kecil sehingga
meningkatkan ‘interfacial area’. Kedua, mengedarkan cecair dalam olakan yang
cepat sehingga menangguhkan gelembung-gelembung terlepas secara normal, dimana
58
ianya memperkuat masa sentuhan yang mempengaruhi peningkatan ‘interfacial area’

Ketiga, menciptakan ‘turbulent shear’ yang mengurangi tebalnya lapisan cecair.
Pirt (1975) menambahkan, goncangan di dalam kultur berfungsi untuk membantu
pertukaran jisim di antara fasa yang berbeza (gas, cecair dan pepejal) di dalam kultur
dan untuk membancuh kultur sehingga mengekalkan keadaan fizikal dan kimia yang
homogen di dalam kultur.
5
pH awal 2
pH awal 3
1 pH awal 4
pH awal 5
pH awal 6
pH awal 7
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Masa (j)
Rajah 4.3 .Kesan pH awal terhadap profil pertumbuhan L. salivarius subsp.
salivarius IG
Rajah 4.3 menunjukkan bahawa pH awal 6 adalah pH awal yang terbaik untuk
pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG. Hal tersebut ditunjukkan oleh
kepekatan biojisim (g/L) yang lebih tinggi dibandingkan dengan pH yang lain. Hasil
tersebut bersesuaian dengan Natarajan & Rajendran (2009) yang menunjukkan pH 6
adalah pH terbaik bagi pertumbuhan L. plantarum. Rao et al. (2004) juga melaporkan
bahawa julat pH awal antara 6 hingga 6.6 adalah julat pH yang baik untuk
pertumbuhan L. plantarum. Hasil yang berbeza dilaporkan oleh LeBlanc et al. (2004)
yang menyatakan bahawa penghasilan biojisim dan kebolehhidupan sel L. fermentum
sedikit lebih tinggi jika diselenggarakan pada pH 5.5 dibandingkan pada pH 6.
Sedangkan Idris & Suzana (2006) melaporkan bahawa pH optimum untuk
pertumbuhan L. delbrueckii untuk menghasilkan asid laktik tertinggi adalah pada pH
6.5. Idris & Suzana (2006) menyatakan bahawa pH yang terlalu rendah atau tinggi
59
boleh menyebabkan tekanan yang tinggi terhadap kemampuan metabolik

mikroorganisma. Idris & Suzana (2006) melaporkan bahawa pada pH awal 6.5, sel
mikrob mulai menggunakan glukosa lebih awal dan lebih cepat daripada pH lainnya,
yang dengan demikian pH awal 6.5 menggalakkan L. delbrueckii menggunakan
glukosa lebih cepat yang pada akhirnya menyumbang kepada kepekatan sel yang
lebih tinggi. Berdasarkan laporan diatas, pH awal yang optimum pada tiap-tiap
spesies Lactobacillus spp. boleh jadi akan berbeza, namun julat pH optimum untuk
pertumbuhan Lactobacillus spp berada pada pH 5.5-6.5.
4
10 g/L
1 20 g/L
30 g/L
40 g/L
50 g/L
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Masa (j)
Rajah 4.4 Kesan kepekatan glukosa awal terhadap profil pertumbuhan L. salivarius
Rajah 4.4 menunjukkan kepekatan glukosa awal antara 20 dan 30 g/L adalah
kepekatan glukosa awal yang terbaik untuk pertumbuhan L. salivarius subsp.
salivarius IG. Kepekatan biojisim pada kepekatan glukosa awal 20 dan 30 g/L
menunjukkan hasil yang terbaik dibandingkan dengan kepekatan glukosa awal yang
lain.
Beberapa kajian mengenai kinetik pertumbuhan strain Lactobacillus spp.

dalam pelbagai keadaan, sering menggunakan kaldu MRS dengan kepekatan glukosa
20 g/L (Rao et al. 2004; Natarajan & Rajendran 2009). Hal ini menunjukkan bahawa
60
kepekatan glukosa awal 20 g/L dalam kaldu MRS merupakan kepekatan glukosa
yang sesuai untuk pertumbuhan Lactobacillus spp. (De Man et al. 1960). Namun,
untuk peningkatan hasil pertumbuhan yang lebih tinggi, kepekatan glukosa tersebut
dapat dipertingkatkan lagi hingga mencapai kepekatan optimumnya. Hal ini
bergantung pada matlamat kajian dan spesies Lactobacillus yang digunakan.
Melalui eksperimen dalam kelalang goncangan, didapati L. salivarius subsp.

salivarius IG memiliki pertumbuhan optimum pada kadar goncangan 150 rpm dan pH
awal 6. Hasil ini bersesuaian dengan kajian yang dilakukan oleh Mel et al. (2006)
yang mengkaji kesan pelbagai parameter proses pada fermentasi asid laktik
menggunakan Lactobacillus rhamnosus dalam fermentor skala makmal. Mel et al.
(2006) mendapati bahawa pengkulturan Lactobacillus rhamnosus akan lebih
produktif jika diselenggarakan pada pH 6 dan kadar goncangan 150 rpm. Mel et al.
(2006) menambahkan bahawa kadar goncangan yang terlalu tinggi daripada suatu
impeller fermentor tidak begitu berkesan terhadap pertumbuhan sel Lactobacillus
spp., kerana sel mikrob tersebut bukanlah sel ‘shear sensitive’ dan juga sel tersebut
merupakan suatu bakteria Gram positif.
Pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kajian ini,

diselenggarakan pada suhu 37oC, kerana menurut Buchanan & Gibson (1974),
L. salivarius subsp. salivarius tumbuh optimum pada suhu 37oC. Selain itu, Salih
et al. (2009) telah membuktikan bahawa kepekatan biojisim maksimum diperolehi
jika pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius diselenggarakan pada suhu 37oC.
Sedangkan, kepekatan glukosa 20 g/L sebagaimana yang terdapat dalam medium
MRS yang dijual secara komersial menunjukkan pertumbuhan yang baik bagi
L. salivarius subsp. salivarius IG. Namun, hasil yang diperoleh tidak jauh berbeza
jika kepekatan glukosa pada medium MRS dipertingkatkan kepada 30 g/L.
Oleh itu, eksperimen selanjutnya di dalam fermentor untuk kajian kinetik

pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG secara kelompok dan kajian kesan
kadar pencairan secara selanjar terhadap pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius
IG, diselenggarakan pada kadar goncangan 150 rpm dan pH awal 6 (sesuai dengan
hasil kajian dalam kelalang goncangan dan kajian oleh Mel et al. 2006), suhu 37oC
61
(sesuai dengan Buchanan & Gibson 1974) dan kepekatan glukosa awal dalam
medium MRS 20 g/L. Eksperimen tersebut diselenggarakan pada aliran gas nitrogen
0.5 v/v/m untuk memastikan kehomogenan fermentasi dalam keadaan anaerob.
4.5 PROFIL PERTUMBUHAN L. salivarius subsp. salivarius IG DALAM

FERMENTOR
4.5.1 Profil Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG Secara Kultur

Kelompok
Rajah 4.5, menunjukkan fasa eksponen didapati berlaku sehingga 8 jam,

manakala pada fasa pegun kepekatan biojisim maksimum yang diperolehi adalah 4.16
g/L dan kepekatan sel hidup maksimum adalah 17.85 log (cfu/ml). Produktiviti
biojisim yang diperolehi ialah 0.470 g/L/j. Hasil ini berbeza dengan yang dilaporkan
oleh Berry et al. (1999) dimana kepekatan biojisim maksimum 10.5 g/L pada
pengkulturan secara kelompok L. rhamnosus. Perbezaan ini boleh disebabkan oleh
medium yang digunakan oleh Berry et al. (1999) adalah medium kompleks kaya
nutrien dengan kepekatan glukosa awal 80 g/L.
25 20 5 2.2
18 2.0
Kepekatan ammonium (g/L)

20 4
Kepekatan glukosa (g/L)
16 1.8
15 3
14 1.6
log (cfu/ml)
10 12 2 1.4
10 1.2
5 1
8 1.0
0 0
6 0.8
4 0.6
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48
Masa (j) log (cfu/ml)
Rajah 4.5 .Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kultur

kelompok. Pengkulturan dijalankan pada suhu 37oC, aliran gas nitrogen
0.5 v/v/m, 150 rpm selama 48 jam.
62
Masa lag didapati selama 1.5 jam, manakala fasa mati bermula selepas 18 jam
dimana kepekatan sel (log cfu/ml) menunjukkan penurunan yang cepat. Glukosa
didapati telah habis pada masa 12 jam. Kadar pertumbuhan spesifik (µ) adalah
0.569/jam dengan masa gandaan (td) selama 1.22 jam. Nilai µ yang diperolehi ini
adalah lebih rendah berbanding yang dilaporkan oleh O-Dichara et al. (1997)
mengenai pertumbuhan L. casei subsp. rhamnosus dalam medium pengayaan
(0.63/jam). Kajian LeBlanc et al. (2004) juga menunjukkan nilai µ yang lebih tinggi
pada pengkulturan L. fermentum dalam medium MRS (0.78/jam). Namun demikian,
kepekatan sel maksimum yang dihasilkan dalam kajian ini (17.85 log cfu/ml) hampir
dua kali lebih tinggi berbanding dengan yang dilaporkan oleh LeBlanc et al. (2004)
(9.35 log cfu/ml). Perbezaan ini mungkin disebabkan oleh perbezaan sifat intrinsik
mikrob dan medium asas yang digunakan.
Hasil pertumbuhan Yx/s yang didapatkan dalam kajian ini adalah 0.202 g/g
(biojisim/substrat terguna) dengan darjah penggandaan (n) 4.91 dan kadar
penggunaan substrat spesifik 2.82/jam. Hasil pertumbuhan ini lebih tinggi daripada
yang diperolehi oleh O-Dichara et al. (1997) (0.08 g/g) dalam kajiannya mengenai
pertumbuhan L. casei subsp. rhamnosus dalam medium pengayaan dengan kepekatan
glukosa 50 g/L. Hasil ini membuktikan kecekapan bakteria L. salivarius subsp.
salivarius IG menggunakan medium asas MRS dengan kepekatan glukosa 20 g/L.
4.5.2 Kesan Kadar Pencairan dalam Kultur Selanjar terhadap Pertumbuhan

dan Produktiviti L. salivarius subsp. salivarius IG
Keberkesanan sistem kultur selanjar semakin baik apabila sistem berjaya dioperasi
pada keadaan mantap dalam jangka masa yang lama (T besar) serta pada nilai kadar
pencairan (mendekati Dkritikal) yang tinggi (Lampiran D.5). Dalam kajian ini,
pertumbuhan sel dan produktiviti biojisim L. salivarius subsp. salivarius IG yang
didapati bergantung pada nilai kadar pencairan (D) yang telah ditetapkan berdasarkan
kadar alir. Berdasarkan teori yang sudah dijelaskan sebelumnya, keadaan mantap
ialah apabila dx/dt = 0, maka nilai kadar pertumbuhan spesifik adalah setara dengan
nilai kadar pencairan iaitu D = F/V = µ. Dalam kajian ini, enam eksperimen per
kadar pencairan yang berbeza (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.35 dan 0.45/jam) telah dikaji.
63
Melalui eksperimen kesan kadar pencairan ke atas pertumbuhan L. salivarius

subsp. salivarius IG, didapati kadar pencairan 0.3/jam merupakan kadar pencairan
yang terbaik. Hasil ini bersesuaian dengan teori yang menyatakan bahawa kadar
pencairan yang terbaik pada kultur selanjar berada di bawah nilai kadar pertumbuhan
spesifiknya (Stanbury et al. 1995).
Rajah 4.6 hingga 4.11 menunjukkan pada kadar pencairan 0.05/jam hingga
0.3/jam, pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG berlangsung malar dari mula
pam medium baru pada jam ke-6 hingga akhir operasi pada jam ke-96, manakala pada
kadar pencairan 0.35 dan 0.45/jam, pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG
mulai menurun pada jam ke-18. Walaupun purata kepekatan biojisim (4.57 g/L) dan
kepekatan sel (31.94 log cfu/ml) yang tertinggi didapati pada kadar pencairan 0.2/jam
(Jadual 4.4), namun produktiviti biojisim dan kepekatan sel yang tertinggi diperolehi
pada kadar pencairan 0.3/jam (Rajah 4.16; Jadual 4.5). Hasil ini sedikit berbeza
dengan yang diperolehi oleh Major & Bull (1985) yang telah melaporkan bahawa
kadar pencairan yang memberikan produktiviti biojisim tertinggi pada pengkulturan
selanjar L. delbrueckii adalah 0.35/jam. Major & Bull (1985) melaporkan bahawa
pada kadar pencairan 0.05 dan 0.1/jam, kepekatan glukosa sisa pada keadaan mantap
adalah sangat rendah (< 0.004 g/L). Sedangkan dalam kajian ini, kepekatan glukosa
sisa pada keadaan mantap adalah kurang daripada 0.5 g/L bagi kadar pencairan
0.5 hingga 0.2/jam. Pada kadar pencairan 0.3/jam didapati kepekatan glukosa sisa
adalah ± 2.7 g/L, manakala pada kadar pencairan melebihi 0.3/jam, kepekatan
glukosa sisa melebihi 10 g/L (Jadual 4.4).
Jadual 4.4 Kesan kadar pencairan ke atas purata kepekatan biojisim, kepekatan
sel hidup, kepekatan glukosa sisa, dan kepekatan ammonium sisa pada
keadaan mantap.
Kadar Kepekatan Kepekatan sel Kepekatan Kepekatan

pencairan (D) biojisim (g/L) hidup glukosa sisa ammonium
(/jam) log (cfu/ml) (g/L) sisa (g/L)
0.05 4.19 24.64 0.26 1.14
0.1 4.52 27.88 0.30 1.17
0.2 4.57 31.94 0.49 1.22
0.3 3.96 26.87 2.77 1.32
0.35 2.89 20.26 10.71 1.36
0.45 1.47 9.22 10.65 1.47
64
Kajian yang dilakukan Ragout & Siñeriz (1994) menyatakan bahawa

produktiviti biojisim Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus tertinggi didapati
pada kadar pencairan 0.99/jam, mendekati kadar pencairan kritikalnya (1.03/jam).
Hasil tersebut cukup jauh berbeza dengan yang didapatkan dalam kajian ini, dimana
kadar pencairan kritikal yang diperoleh adalah 0.35/jam. Kajian lain mengenai kesan
kadar pencairan ke atas produktiviti bakteria asid laktik telah banyak dilakukan.
Sebagai contoh, B-Vial et al. (1997) melaporkan bahawa kadar pencairan kritikal
(Dkritikal) pada kultur selanjar Carnobacterium divergens (bakteria asid laktik yang
dipencilkan daripada ikan) adalah 0.2/jam. Sedangkan B-Bárcena et al. (1998)
melaporkan bahawa kadar pencairan kritikal (Dkritikal) dalam pengkulturan selanjar
L. fermentum untuk penghasilan plantarisin C (suatu bakteriosin yang dihasilkan oleh
L. fermentum) adalah 0.62/jam. Perbezaan yang terdapat pada kadar pencairan
kritikal (Dkritikal) ini dapat disebabkan oleh strain bakteria yang digunakan, medium
pengkulturan dan keadaan fizikal dan kimia kultur. Hal ini menunjukkan bahawa
Dkritikal khusus tertakluk kepada sistem tertentu.
25 30 5 2.2

2.0
20 4

25
1.8
15 3
log (cfu/ml)
20
1.6
10 2
1.4
15
5 1
1.2
10
0 0 1.0
-5 5 0.8
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

Rajah 4.6 ..Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kultur

selanjar, apabila kadar pencairan ditetapkan pada 0.05/jam
65
25 35 5 2.2
2.0

20 30 4
kepekatan biojisim (g/L)

1.8
15 25 3
log (cfu/ml)
1.6
10 20 2
1.4
5 15 1
1.2
0 10 0 1.0
5 0.8
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

Rajah 4.7 …Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kultur

.selanjar, apabila kadar pencairan ditetapkan pada 0.1/jam
25 35 5 2.2

2.0
20 30 4 Kepekatan biojisim (g/L)
1.8
15 25 3
log (cfu/ml)
1.6
10 20 2
1.4
5 15 1
1.2
0 10 0 1.0
5 0.8
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

Rajah 4.8 ...Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kultur

66
25 30 5 2.2

4 2.0

20 25
3 1.8
log (cfu/ml)
15 20
2 1.6
10 15
1 1.4
5 10
0 1.2
0 5 1.0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

Rajah 4.9 . .Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kultur

..selanjar, apabila kadar pencairan ditetapkan pada 0.3/jam
25 30 5 2.2

4 2.0
20 25
3 1.8
log (cfu/ml)
15 20
2 1.6
10 15
1 1.4
5 10
0 1.2
0 5 1.0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

Rajah 4.10 Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kultur

67
25 30 5 2.2

4 2.0

20 25
3 1.8
log (cfu/ml)
15 20
2 1.6
10 15
1 1.4
5 10
0 1.2
0 5 1.0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

Kepekatan biojisim setara (g/L)
Rajah 4.11 ..Profil pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam kultur

. selanjar, apabila kadar pencairan ditetapkan pada 0.45/jam
Kepekatan ammonium sisa pada keadaan mantap yang diperoleh dalam kajian
ini selalu melebihi 1 g/L untuk semua kadar pencairan (Jadual 4.4; Rajah 4.15). Hasil
tersebut menunjukkan rendahnya penggunaan triammonium sitrat yang dibekalkan
pada medium pengkulturan sebanyak 2.0 g/L. Hal ini menunjukkan rendahnya
penggunaan sumber nitrogen tak organik dalam medium MRS oleh L. salivarius
subsp. salivarius IG, dan tingginya penggunaan sumber nitrogen organik yang
dibekalkan ke dalam medium, iaitu pepton, ekstrak yis dan ekstrak lembu. Menurut
Hofvendahl & Hagerdal (2000), penggunaan ekstrak yis adalah superior
dibandingkan dengan sumber nitrogen yang lain, dan peningkatan yis ekstrak
daripada 5 g/L kepada 30 g/L mampu meningkatkan biojisim kering sebanyak 46%
dan asid laktik 31% (Nancib et al. 2001).
Namun demikian, penggunaan ekstrak yis yang tinggi sangatlah tidak

ekonomi dari segi kos penghasilan. Oleh itu menurut Altaf et al. (2005), perlu dicari
sumber nitrogen lain yang lebih murah untuk fermentasi Lactobacillus. Sebagai
contoh, Altaf et al. (2005) menjumpai bahawa kacang merah (red lentil) dan ibu roti
68
(baker’s yeast cells) merupakan alternatif terbaik yang lebih murah untuk
menggantikan ekstrak yis dalam fermentasi Lactobacillus amylophilus untuk
menghasilkan asid laktik.
Rajah 4.12 hingga 4.15 menunjukkan kesan kadar pencairan pada masa mula
pam medium segar jam ke-6 ke atas kepekatan sel hidup (log cfu/ml), biojisim (g/L),
kepekatan glukosa (g/L) sisa dan kepekatan ammonium (g/L) sisa. Hasil
menunjukkan bahawa pada kadar pencairan melebihi 0.3/jam, berlaku ‘wash out’
dalam sistem pengkulturan kerana kadar pengeluaran biojisim dalam medium
melebihi kadar pertumbuhan maksimum.
Pada keadaan mantap, kepekatan kepekatan bijisim dan kepekatan sel hidup
pada kadar pencairan 0.05/jam adalah 4.19 g/L dan 24.64 log (cfu/ml). Kepekatan
tersebut semakin meningkat pada kadar pencairan 0.2/jam, iaitu 4.57 g/L dan 31.94
log (cfu/ml). Pada kadar pencairan 0.3/jam, pengkulturan mampu bertahan dalam
keadaan malar selama 96 jam.
35
30
25
Log (cfu/mL)
20
15
10
5 D = 0.05
D = 0.1
D = 0.2
0 D = 0.3
D = 0.35
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96 D = 0.45
Masa (j)
Rajah 4.12 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan sel hidup [log (cfu/ml)]
L. salivarius subsp. salivarius IG
Namun pada kadar pencairan 0.3/jam, kepekatan biojisim dan kepekatan sel
hidup menjadi sedikit menurun (3.96 g/L dan 26.87 log cfu/ml). Pada kadar
pencairan 0.35 dan 0.45/jam, didapati pengkulturan tidak mampu bertahan dalam
69
keadaan malar hingga akhir masa operasi. Tambahan pula, kepekatan glukosa sisa
pada kadar pencairan 0.35 dan 0.45/jam lebih tinggi berbanding dengan kadar
pencairan 0.05 sehingga 0.3/jam. Hal ini boleh terjadi kerana pada kadar pencairan
0.35 dan 0.45/jam, nilai masa mastautin sel L. salivarius subsp. salivarius IG dalam
kultur selanjar menjadi lebih kecil, sehingga glukosa dan komponen medium lainnya
kurang digunakan oleh sel L. salivarius subsp. salivarius IG. Hal ini membuat
pertumbuhan sel pada kadar pencairan 0.35 dan 0.45/jam menjadi menurun drastik
setelah jam ke-18.
5
5
4
4
3
3
2
2
1 D = 0.05
D = 0.1
1 D = 0.2
D = 0.3
0 D = 0.35
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96 D = 0.45
Masa (j)
Rajah 4.13 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan biojisim (g/L) L. salivarius
25
20
15
10
5 D = 0.05
D = 0.1
D = 0.2
D = 0.3
0 D = 0.35
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96 D = 0.45
Masa (j)
Rajah 4.14 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan glukosa sisa (g/L)
70
2.5

2.0
1.5
1.0
0.5 D = 0.05
D = 0.1
D = 0.2
0.0 D = 0.3
D = 0.35
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96 D = 0.45
Masa (j)
Rajah 4.15 Kesan kadar pencairan ke atas kepekatan ammonium sisa (g/L)
Berdasarkan teori pengiraan produktiviti kultur selanjar iaitu R = D X

(Lampiran D.5), apabila D ialah kadar pencairan dan X adalah purata kepekatan
biojisim atau kepekatan sel hidup Lactobacillus spp., didapati bahawa apabila nilai D
ditingkatkan lagi sehingga D mendekati kadar pencairan kritikalnya (Dkritikal), maka
nilai R juga akan meningkat. Data-data yang diperoleh menunjukkan bahawa kajian
ini bersesuaian dengan teori kultur selanjar iaitu pengkulturan secara kultur selanjar
mampu meningkatkan produktiviti biojisim atau kepekatan sel hidup Lactobacillus
spp. berbanding kultur kelompok. Hasil kajian ini menunjukkan bahawa pada kadar
pencairan 0.3/jam, pengkulturan tersebut menghasilkan nilai produktiviti kepekatan
biojisim dan kepekatan sel hidup Lactobacillus spp. yang paling tinggi iaitu sebanyak
1.19 g/L/j dan 8.06 log (cfu/ml)/j (Jadual 4.5). Produktiviti biojisim (1.19 g/L/j) yang
didapati pada kultur selanjar dengan kadar pencairan 0.3/jam tersebut menunjukkan
bahawa kultur selanjar tersebut mampu meningkatkan produktiviti biojisim sehingga
2.5 kali ganda daripada kultur kelompok (0.470 g/L/j).
71
Rajah 4.16 ...Kesan kadar pencairan ke atas purata produktiviti biojisim dan
produktiviti kepekatan sel hidup L. salivarius subsp. salivarius IG
pada keadaan mantap
Apabila kadar pencairan (D) ditingkatkan lagi melebihi kadar pencairan

kritikalnya (Dkritikal), didapati produktiviti biojisim atau kepekatan sel hidup
L. salivarius subsp. salivarius IG menurun dan tidak dapat mencapai keadaan mantap,
kerana kadar alir medium dalam reaktor yang terlalu tinggi berbanding dengan nilai
kadar pembiakan spesifik. Hal ini, sebagaimana disebutkan di atas, akan
menyebabkan berlakunya ‘wash out’ dalam sistem pengkulturan. Oleh itu, hasil
kajian ini mendapati bahawa kadar pencairan 0.3/jam menghasilkan produktiviti
maksimum (Rmaks) (Rajah 4.16; Jadual 4.5).
72
Jadual 4.5 Kesan kadar pencairan ke atas produktiviti biojisim dan produktiviti
kepekatan sel hidup L. salivarius subsp. salivarius IG pada keadaan
mantap
Kadar pencairan Produktiviti R = D X Produktiviti R = D X

(D) (j-1) (biojisim) (kepekatan sel hidup)
(g/L/j) log (cfu/ml)/j
0.05 0.21 1.23
0.1 0.45 2.79
0.2 0.91 6.39
0.3 1.19 8.06
0.35 1.01 7.09
0.45 0.66 4.15
4.5.3 Kesan Kepekatan Glukosa Awal dalam Kultur Selanjar terhadap

Pertumbuhan dan Produktiviti L. salivarius subsp. salivarius IG
Kepekatan glukosa yang berbeza didapati mempengaruhi kepekatan biojisim pada

keadaan mantap (Rajah 4.17 dan 4.18; Jadual 4.6), kerana sumber karbon diketahui
mampu mencetuskan pembentukan sel (Tortora et al. 2001). Peningkatan kepekatan
glukosa dalam medium MRS daripada 20 g/L sehingga ke 30 g/L pada kadar
pencairan 0.3/jam didapati berjaya meningkatkan produktiviti biojisim (1.19 menjadi
1.28 g/L/j) secara signifikan (p<0.05) (Lampiran E). Peningkatan glukosa sehingga
40 g/L tidak berjaya meningkatkan produktiviti biojisim. Hasil kajian ini agak
berbeza dari teori kultur selanjar X = Y(Sr- S ) di mana peningkatan kepekatan
substrat merupakan satu faktor yang mampu meningkatkan kepekatan biojisim pada
keadaan mantap. Mengikut rumus kultur selanjar X = Y(Sr- S ), dijangkakan bahawa
apabila S rendah atau S = 0 maka X akan meningkat. Tetapi hasil yang diperolehi
daripada kajian ini menunjukkan bahawa kepekatan glukosa awal 40 g/L memberikan
purata biojisim pada keadaan mantap yang lebih rendah daripada kepekatan glukosa
awal 30 g/L. Hal ini boleh disebabkan kepekatan glukosa yang tinggi boleh
menyebabkan asid laktik yang terhasil menjadi lebih tinggi sehingga menjadi toksik
bagi mikrob itu sendiri, sehingga pertumbuhan menjadi lebih rendah. Kemungkinan
lainnya ialah percampuran medium dengan kultur menjadi tak sempurna ketika
kepekatan glukosa ditingkatkan menjadi 40 g/L.
73
35 35 5 2.2

30 2.0
30 4

25 1.8
25 3
log (cfu/ml)
20 1.6
20 2
15 1.4
15 1
10 1.2
10 0
5 1.0
0 5 0.8
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96


selanjar, apabila kadar pencairan ditetapkan pada 0.3/jam dengan
kepekatan glukosa awal 30 g/L.
45 30 5 2.2

40
4 2.0
25
35
3 1.8
log (cfu/ml)
20
30
2 1.6
25
15
1 1.4
20
10
0 1.2
15
10 5 1.0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96


selanjar, apabila kadar pencairan ditetapkan pada 0.3/jam dengan
kepekatan glukosa awal 40 g/L.
74
Jadual 4.6 menunjukkan bahawa pada kepekatan glukosa awal 40 g/L,

kepekatan glukosa sisa yang terhimpun semakin tinggi. Hal ini menyebabkan
produktiviti biojisim dan kepekatan sel hidup L. salivarius subsp. salivarius IG yang
dihasilkan menurun. Hasil kajian ini menunjukkan bahawa X maks yang diperolehi
dalam kajian ini adalah pada kepekatan glukosa 30 g/L dan data menunjukkan
perbezaan yang signifikan (p<0.05) berbanding dengan menggunakan kepekatan
glukosa 20 g/L dan 40 g/L. Hasil ini sedikit berbeza dengan eksperimen dalam
kelalang goncangan dalam kajian ini, yang berkesimpulan bahawa kepekatan glukosa
awal 20 dan 30 g/L menunjukkan pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG
yang lebih kurang sama. Anggapan yang dapat dikemukakan ialah, eksperimen
dalam fermentor secara selanjar memiliki parameter yang berbeza dan tentunya lebih
akurat dalam hal menentukan kinetik pertumbuhan dibandingkan dengan eksperimen
dalam kelalang goncangan.
Jadual 4.6 Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas
purata kepekatan biojisim, kepekatan sel hidup, kepekatan glukosa
sisa, dan kepekatan ammonium sisa pada keadaan mantap.
Kepekatan Kepekatan Kepekatan sel Kepekatan Kepekatan

glukosa awal biojisim (g/L) hidup glukosa sisa ammonium
(g/L) [log (cfu/ml)] (g/L) sisa (g/L)
20 3.96 26.87 2.77 1.32
30 4.25 29.08 7.77 1.29
40 3.96 25.36 13.60 1.33
Rajah 4.19 hingga 4.22 menunjukkan kesan kepekatan glukosa awal pada
kadar pencairan 0.3/jam terhadap kepekatan sel hidup L. salivarius subsp. salivarius
IG [log (cfu/ml)], kepekatan biojisim (g/L), kepekatan glukosa sisa (g/L) dan
kepekatan ammonium sisa (g/L). Hasil menunjukkan kepekatan biojisim (g/L) dan
kepekatan sel hidup L. salivarius subsp. salivarius IG [log (cfu/ml)] yang maksimum
dapat dihasilkan dengan menggunakan kepekatan glukosa awal 30 g/L. Hasil ini
agak bersesuaian dengan kajian Lim et al. (2007) mengenai pengoptimuman medium
pertumbuhan L. salivarius menggunakan kaedah gerakbalas permukaan (Response
Surface Metodology), yang menyatakan bahawa kepekatan glukosa optimum yang
diperlukan untuk pertumbuhan L. salivarius ialah 33.24 g/L.
75
35
30
25
Log (cfu/mL) 20
15
10
0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96
20 g/L
Masa (j) 30 g/L
40 g/L
Rajah 4.19 . Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas
kepekatan sel hidup [log (cfu/ml)] L. salivarius subsp. salivarius IG
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96
20 g/L
Masa (j) 30 g/L
40 g/L
Rajah 4.20 ...Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas
kepekatan biojisim (g/L) L. salivarius subsp. salivarius IG
76
45
40

35
30
25
20
15
10
0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96
20 g/L
Masa (j) 30 g/L
40 g/L
Rajah 4.21 Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas
kepekatan glukosa sisa (g/L).
2.5
1.5
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12 18 24 36 48 60 72 84 96
20 g/L
Masa (j) 30 g/L
40 g/L
Rajah 4.22 . Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas
kepekatan ammonium sisa (g/L).
Kepekatan ammonium sisa (g/L) yang dihasilkan berada pada paras yang
hampir sama pada semua kepekatan glukosa awal (± 1.3 g/L) (Jadual 4.6). Hal
tersebut boleh disebabkan oleh rendahnya penggunaan sumber nitrogen tak organik.
L. salivarius subsp. salivarius IG kemungkinan lebih banyak menggunakan sumber
77
nitrogen organik, seperti ekstrak yis, ekstrak lembu dan pepton. Menurut Lim et al.
(2007), kepekatan ekstrak yis yang diperlukan untuk pertumbuhan optimum
L. salivarius adalah 43.1 g/L, manakala ekstrak lembu, pepton dan triammoniun sitrat
tidak begitu diperlukan.
Jadual 4.7 Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas
produktiviti biojisim dan kepekatan sel hidup L. salivarius subsp.
salivarius IG pada keadaan mantap
Kepekatan Produktiviti R = D X Produktiviti R = D X

glukosa awal (biojisim) (g/L/j) (kepekatan sel hidup)
(g/L) log (cfu/ml)/j
20 1.19 8.06
30 1.28 8.72
40 1.18 7.61
Jadual 4.7 menunjukkan bahawa produktiviti maksimum biojisim dan

kepekatan sel hidup diperoleh pada kepekatan glukosa awal 30 g/L (p<0.05). Hasil
ini menunjukkan bahawa untuk menghasilkan kepekatan biojisim dan kepekatan sel
hidup L. salivarius subsp. salivarius IG yang tinggi secara selanjar, maka operasi
pengkulturan yang terbaik ialah menggunakan kepekatan glukosa awal 30 g/L dan
kadar pencairan tidak melebihi 0.3/jam. Penambahan kepekatan glukosa awal
menjadi 40 g/L ke dalam sistem pengkulturan, tidak berjaya meningkatkan kepekatan
biojisim dan kepekatan sel hidup L. salivarius subsp. salivarius IG.
4.6 PROSEDUR OPERASI PIAWAI (SOP) PENGKULTURAN

Lactobacillus salivarius subsp. salivarius DALAM FERMENTOR 5 L
YANG MENGANDUNGI 2 L MEDIUM PENGKULTURAN DALAM
KULTUR SELANJAR
4.6.1 Penyediaan Inokulum
Berdasarkan hasil yang diperolehi dalam eksperimen, L. salivarius subsp. salivarius

IG berjaya dikultur dalam kultur selanjar, dan menghasilkan produktiviti yang lebih
tinggi (1.19 g/L/j) berbanding dengan kultur kelompok (0.470 g/L/j). Menurut data
kajian, L. salivarius subsp. salivarius IG tumbuh optimum dalam keadaan-keadaan
berikut: pH awal 6, kadar goncangan 150 rpm, suhu 37oC, masa mula pam medium
78
segar adalah 6 jam, kadar pencairan 0.3/jam dan kepekatan glukosa awal 30 g/L.
Langkah-langkah yang perlu dilakukan dalam pengkulturan L. salivarius subsp.
salivarius IG adalah seperti berikut:
Bakteria dikulturkan di atas piring agar MRS (Gambar 4.6).
Piring MRS dieram pada suhu 37 oC selama 24 jam.
Koloni tunggal L. salivarius subsp. salivarius IG (Gambar 4.6) dimasukkan

ke dalam kelalang 250 ml yang mengandungi 100 ml medium inokulum
(Penyediaan medium inokulum adalah seperti sub-bab 3.8.1).
Kelalang yang sudah dimasukkan L. salivarius subsp. salivarius IG di atas,

dieram dalam shaker incubator (INFORS) pada suhu 37oC dengan kadar
goncangan 150 rpm selama 18 jam (Gambar 4.7).
Inokulum pada setiap eksperimen dipiawaikan pada nilai ketumpatan optik

(O.D) 0.5 ± 0.02 yang dibaca pada jarak gelombang 600 nm dengan
menggunakan spektrofotometer UV-VIS (UVmini-1240, Shimadzu).
4.6.2 Penyediaan Medium Pengkulturan
Medium pengkulturan disediakan sebanyak 1800 ml dalam fermentor 5 L

(Infors HT Minifors, UK). (Penyediaan medium adalah seperti sub-bab
3.8.2).
Semua medium diautoklaf, dimana glukosa diautoklaf pada suhu 110oC

selama 10 minit. Bahan-bahan kimia yang lain diautoklaf pada suhu 121oC
selama 15 minit.
Selepas diautoklaf, semua bahan dicampurkan dalam fermentor.

79
4.6.3 Penyediaan Fermentor
Lakaran skematik operasi kultur selanjar adalah seperti Gambar 4.5 berikut.
Sebanyak 2 buah pam peristaltik (Watson-Marlow LTD., Cornwall, UK) digunakan
untuk membekalkan medium ke fermentor dan untuk mengepam hasil keluar dari
fermentor. Tiub silikon digunakan untuk menghubungkan pam-pam tersebut dan
penyambungannya dipastikan kemas dan setiap hujungnya dibalut dengan Whatman
Labolatory Seal untuk mengelakkan risiko kontaminasi.
Udara
Pam F1 keluar
Pam F2
Penuras
udara
Pam udara
Medium segar masuk
Hasil
BIOREAKTOR
Gambar 4.5 Lakaran skematik operasi sistem kultur selanjar satu tahap
Pengudaraan masuk dan keluar akan melalui sistem tapisan udara yang terdiri
daripada penapis ultra (Millex®-AP) untuk mengelakkan sebarang kontaminasi.
Pembusasan yang berlaku di dalam reaktor dikawal dengan menggunakan anti busa
(Antiforam A Emulsion, Sigma). Suhu dalam reaktor ditetapkan pada 37oC. Suhu
tersebut dikawal oleh penebat suhu.
80
4.6.4 Pengkulturan Secara Selanjar
Sebanyak 10% (v/v) inokulum (200 ml) (Gambar 4.7) dimasukkan

ke dalam fermentor 5 L yang mengandungi 1800 ml medium pengkulturan
sehingga isipadu akhir menjadi 2 L.
Pada awalnya, L. salivarius subsp. salivarius IG dikultur selama 6 jam

dalam kultur kelompok pada suhu 37oC, aliran gas nitrogen ditetapkan
pada 0.5 v/v/m dengan kadar goncangan 150 rpm.
Selepas dikultur selama 6 jam secara kelompok, medium segar mula

dipam dengan berterusan pada kadar aliran medium masuk dan keluar
ditetapkan untuk mencapai kadar pencairan 0.3/jam. Gambar 4.10
menunjukkan operasi kultur selanjar dengan menggunakan
fermentor 5 L ( Infors HT Minifors, UK).
Penuaian dapat dilakukan dengan berterusan
Kultur yang dituai, diambil bacaan OD600, sebanyak 1 ml diambil untuk

pencairan bersiri, sisanya diempar pada 4000 rpm selama 15 minit.
Supernatan digunakan untuk pengasaian
4.6.5 Pengasaian Sampel
1. Penentuan berat kering biojisim, dilakukan seperti dalam sub-bab 3.11.1

2. Penentuan unit pembentukan koloni, dilakukan seperti dalam sub-bab 3.11.2
3. Penentuan kepekatan glukosa, dilakukan seperti dalam sub-bab 3.11.3
4. Penentuan kepekatan ammonium, dilakukan seperti dalam sub-bab 3.11.4
81
Gambar 4.6 Koloni L. salivarius subsp. salivarius IG yang ditumbuhkan di atas

agar De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) selama 24 jam
Gambar 4.7 Inokulum yang berumur 18 jam yang dikulturkan dalam kaldu MRS
82
Gambar 4.8 Koloni Salmonella 3B21 yang ditumbuhkan di atas agar Brain Heart
Infusion (BHI) selama 24 jam
Gambar 4.9 Koloni Salmonella 3B21 yang ditumbuhkan di atas agar Xylose Lysine
Desoxycholate (XLD) selama 24 jam
Udara keluar
Penapisan udara
masuk
Pam medium
keluar
Pam medium
masuk
Hasil
Medium masuk
Gambar 4.10 Operasi kultur selanjar dalam fermentor 5 L ( Infors HT Minifors, UK)
83
BAB V
KESIMPULAN DAN CADANGAN KAJIAN LANJUTAN
5.1 KESIMPULAN
Berdasarkan ujian pencirian in vitro yang dilakukan, L. salivarius subsp. salivarius IG

merupakan calon yang terbaik sebagai probiotik untuk ayam. Keadaan optimum
untuk pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG pada pH 6, suhu 37oC dan kadar
goncangan 150 rpm. Pengkulturan secara kelompok menunjukkan kepekatan biojisim
maksimum adalah 4.16 g/L dengan masa gandaan (td) selama 1.22 jam. Hasil
pertumbuhan (Yx/s) secara kultur kelompok adalah 0.202 g/g (biojisim/substrat
terguna) dengan darjah penggandaan (n) 4.91 dan produktiviti biojisim sebanyak
0.470 g/L/j. Pengkulturan secara selanjar mampu menunjukkan produktiviti yang
lebih tinggi daripada kultur kelompok (2.5 kali ganda). Pada kadar pencairan 0.2/jam,
kepekatan biojisim paling tinggi (4.57 g/L) pada keadaan mantap diperolehi.
Sedangkan nilai produktiviti biojisim maksimum (Rmaks) sebanyak 1.19 g/L/j dicapai
pada kadar pencairan 0.3/jam. Kadar pencairan kritikal (Dkritikal) didapati pada kadar
pencairan melebihi 0.3/jam. Kepekatan glukosa sehingga 30 g/L pada kadar pencairan
0.3/jam didapati berjaya meningkatkan produktiviti biojisim daripada 1.19 g/L/j
(apabila kepekatan glukosa 20 g/L) kepada 1.28 g/L/j secara signifikan (p<0.05).
5.2 CADANGAN KAJIAN LANJUTAN
Perlu dilakukan kajian mengenai kesan penambahan sumber karbon lain, seperti
laktosa, dan kajian dalam medium kompleks pada operasi kultur selanjar pada kadar
pencairan optimum. Uji aplikasi L. salivarius subsp. salivarius IG dalam industri
ternakan ayam perlu juga dilakukan untuk mengesahkan keberkesanan probiotik.
85
RUJUKAN
Altaf, M., Naveena, J.B. & Reddy, G. 2005. Screening of inexpensive nitrogen
sources for production of L(+) lactic acid from starch by amylolytic
Lactobacillus amylophilus GV6 in single step fermentation. Food Technology
and Biotechnology 43(3): 235–239.
Amrane, A. & Prigent, Y. 1997. Growth and lactic acid production coupling for
Lactobacillus helveticus cultivated on supplemented whey: influence of
peptidic nitrogen deficiency. Journal of biotechnology 55: 1-8.
Anderson, D.B. 2002. Intestinal microbes: When does normality change into a health
and performance insult? Proceedings of the Elanco Global Enteritis
Symposium, hlm. b3–b9.
Anon. 2006a. Malaysia Poultry and Products Annual 2006.

http://www.thepoultrysite.com/articles/661/malaysia-poultry-and-products-
annual-2006 [29 Disember 2009].
Anon. 2006b. Salesema Asia membentuk suatu bayangan terhadap prospek

pertumbuhan penghasilan avian di Asia. CP-Bulletin Service. No. 77: 1-4.
http://www.ciptapangan.com/files/downloadsmodule/@random4413d8539818
8/1151035674_Buletin_CP_mei_2006.pdf [3 Ogos 2009].
Anuradha, R., Suresh, A.K. & Venkatesh, K.V. 1999. Simultaneous saccharification
and fermentation of starch to lactic acid. Process Biochemistry 35: 367–375.
Apata, D.F. 2009. Antibiotic resistance in poultry. International Journal of Poultry

Science 8(4): 404-408.
Arasaratnam, V., Senthuran, A. & Balasubramaniam. 1996. Supplementation of whey

with glucose and different nitrogen sources for lactic acid production by
Lactobacillus delbrueckii. Enzyme and Microbial Technology 19: 482-486.
Avonts, L., Uytven, E.V. & De Vuyst, L. 2004. Cell growth and bacteriocin
production of probiotic Lactobacillus strains in different media. International
Dairy Journal 14: 947–955
Axelsson, L. 2004. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. Dlm.

Salminen, S., von Wright, A. & Ouwehand, A. (pnyt.). Lactic Acid Bacteria:
Microbiology and Functional Aspects, hlm. 1-66. New York: Marcel Dekker,
Inc.
B-Bárcena, J.M., Ragout, A.L., Cόrdoba, P.R. & Siñeriz, F. 1999. Continuous
production of L(+)-lactic acid by Lactobacillus casei in two-stage systems.
Applied Microbiology and Biotechnology 51: 316-324.
86
B-Bárcena, J.M., Siñeriz, F., De Llano, D.G., Rodríguez, A. & Suárez, J.E. 1998.
Chemostat production of Plantaricin C by Lactobacillus plantarum LL441.
Applied and Environmental Microbiology 64(9): 3512-3514.
B-Vial, P., Grajek, W., Dousset, X. & Boyaval, P. 1997. Continuous bacteriocin
production with high cell density bioreactors. Enzyme and Microbial
Technology 21: 450-457.
Barrow, P.A. 1992. Probiotics for chickens. Dlm. Fuller, R. (pnyt.). Probiotics: A
Scientific basis, hlm. 225-257. London: Chapman & Hll.
Bateup, J. M., McConnell, M.A., Jenkinson, H.F. & G. Tannock. 1995. Comparison
of Lactobacillus strains with respect to bile salt hydrolase activity,
colonization of the gastrointestinal tract and growth rate of the murine host.
Applied and Environmental Microbiology 61: 1147-1149.
Berry, A.R., Franco, C.M.M., Zhang, W. & Middleberg, A.P.J. 1999. Growth and
lactic acid production in batch culture of Lactobacillus rhamnosus in a defined
medium. Biotechnology Letters 21: 163–167.
Bourlioux, P., Koletzko, B., Guarner, F. & Braesco, V. 2003. The intestine and its
microflora are partners for protection of the host. American Journal of Clinical
Nutrition 73: 675–683.
Buchanan, R.E. & Gibson, N.E. 1974. Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology. Ed. ke-8. Baltimore: William and Wilkins Company.
Chaney, A.L. & Marbach, E.P. 1962. Modified reagents for the determination of
ammonium and urea. Clinical chemistry 8: 130-132.
Charalampopoulos, D., Pandiella, S.S. & Webb, C. 2003. Evaluation of the effect of
malt, wheat and barley extracts on the viability of potentially probiotic lactic
acid bacteria under acidic conditions. International Journal of Food
Microbiology 82: 133-141.
Chiang, J.Y.L. 1998. Regulation of bile acid synthesis. Frontiers In Bioscience 3:

d176-d193.
Chou, L.S. & Weimer, B. 1999. Isolation and characterization of acid and bile tolerant
isolates from strains of lactobacillus acidophilus. Journal of Dairy Science 82:
23-31.
D’Aoust, J.-Y., 1997. Salmonella species. Dlm. Doyle, M.P., Beuchat, L.R. &
Montville, T.J. (pnyt.). Food Microbiology Fundamentals and Frontiers, hlm.
129-158. Washington, DC: ASM Press.
Dahiya, J.P., Wilkie, D.C., Van Kessel, A.G. & Drew, M.D. 2006. Potential strategies
for controlling necrotic enteritis in broiler chickens in post-antibiotic era.
Animal Feed Science and Technology 129: 60-88.
87
Dalloul, R.A., Lillehoj, H.S., Tamim, N.M., Shellem, T.A. & Doerr, J.A. 2005.
Induction of local protective immunity to Eimeria acervulina by a
Lactobacillus-based probiotic. Comparative Immunology, Microbiology &
Infectious Diseases 28: 351-361.
Darah, I. & Ibrahim, C.O. 1996. Effect of agitation on production of lignin-degrading

enzymes by Phanerochaete chrysosporium grown in shake-flask cultures.
Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 4(3): 174-182.
De Man, Rogosa, J.C. & Sharpe, M.E. 1960. A medium for cultivation of
Lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology 23: 130-135.
De Vuys, L., Callewaert, R. & Crabbe, K. 1996. Primary metabolite kinetics of

bacteriocin biosynthesis by Lactobacillus amylovorus and evidence for
stimulation of bacteriocin production under unfavourable growth conditions.
Ding, S. & Tan, T. 2006. L-lactic acid production by Lactobacillus casei fermentation
using different fed-batch feeding strategies. Process Biochemistry 41: 1451–
1454.
Doyle, M.E. 2001. Alternatives to antibiotic use for growth promotion in animal
husbandry. Food Research Institute Briefings. Madison: 1-16.
Doroshchuk, N.A., Gelfand, M.S. & Rodionov, D.A. 2006. Regulation of nitrogen
metabolism in Gram-positive bacteria. Molekulyarnaya Biologiya 40 (5): 919-
926.
Drisko, J.A., Giles, C.K. & Bischoff, B.J. 2003. Probiotics in health maintenance and
disease prevention. Alternative Medicine Review 8 (2): 143-155.
Du Toit, M., Franz, C., Schillinger, U., Warles, B. & Holzappfel, A. 1998.
Characterization and selection of probiotic lactobacilli for a preliminary
minipig-feeding trail and their effect on serum cholesterol level, faeces pH and
faeces moiture contents. International Food Microbiology 40: 93-104.
Ehrmann, M.A., Kurzak, P., Bauer, J. & Vogel, R.F. 2002. Characterization of
lactobacilli towards their use as probiotic adjuncts in poultry. Journal of
applied microbiology 92: 966-975.
FAO/WHO. 2001. Evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food

including powder milk with live lactic acid bacteria. Food and Agriculture
Organization of the United Nations and World Health Organization Expert
Consultation Report, Cordoba.
Fooks, L.J. & Gibson, G.R. 2002. Probiotics as modulators of the gut flora. Journal of
Nutrition. 88 (1): s39–s49.
Fuller, R., 1989. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology 66:
365-378.
88
Fuller, R. 1992. History and development of probiotics. Dlm. Fuller, R. (pnyt.).

Probiotics: The scientific basis, hlm. 1-8. London: Chapman & Hall.
Gänzle, M.G., Höltzel, A., Walter, J., Jung, G. & Hammes, W.P. 2000.
Characterization of Reutericyclin produced by Lactobacillus reuteri
LTH2584. Applied and Environmental Microbiology 66(10): 4325–4333.
Gariga, M., Pascual, M., Monfort, J.M. & Hugas, M. 1998. Selection of lactobacilli
for chicken probiotic adjuncts. Journal of Applied Microbiology 84:125-132.
Gibson, G.R. & Fuller, R. 2000. Aspects of in vitro and in vivo research approaches
directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use. American
Society for Nutritional Sciences 130: 391S-395S.
Gilliland, S. E. & Walker, D.K. 1990. Factors to consider when selecting a culture of
Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a
hypocholesterolemic effect in humans. Journal of Dairy Science 73: 905-911.
Gismondo, M.R., Drago, L. & Lombardi, A. 1999. Review of probiotics available to

modify gastrointestinal flora. International Journal of Antimicrobial Agents
12: 287–292.
Gorman, C., Bjerklie, D. & Park, A. 2002. Playing chicken with our antibiotics.
http://www.time.com/time/magazine/article/0,9171,1001675,00.html [29 Jun
2010].
Gotcheva, V., Hristozova, E., Hristozova, T., Guo, M., Roshkova, Z. & Angelov, A.
2002. Assessment of potential probiotic properties of lactic acid bacteria and
yeast strains. Food Biotechnology 16: 211-225.
Grill, J.P., Schneider, F., Crociani, J. & Ballongue. 1995. Purification and
characterization of conjugated bile salt hydrolase from Bifidobacterium
longum BB536. Applied and Environmental Microbiology 61(7): 2577-2582.
Gueimonde, M., Jalonen, L., Fang He, Hiramatsu, M. & Salminen, S. 2006.
Adhesion and competitive inhibition and displacement of human
enteropathogens by selected lactobacilli. Food Research International 39(4):
467-471.
Guerra, N.P., Bern`ardez, P.F., M`endez, J., Cachaldora, P. & Castro, L.P. 2007.
Production of four potentially probiotic lactic acid bacteria and their
evaluation as feed additives for weaned piglets. Animal Feed Science and
Technology 134: 89-107.
Gusils, C., Cuozzo, S., Sesma, F. & S. Gonzales. 2002a. Examination of adhesive
determinants in three spesies of lactobacillus isolated from chicken. Canadian
Journal of Microbiology 48: 34-42.
Gusils, C., Bujazha, M. & Gonzales, S. 2002b. Preliminary studies to design a

probiotic for use in swine feed. Interciencia 27(8): 409-413.
89
Hammes, W.P. & Hertel, C. 2006. The Genera Lactobacillus and Carnobacterium.
Prokaryotes 4:320-403.
Handley, P.S., Harty, D.W.S., Wyatt, J.E., Brown, C.R., Doran, J.P. & Gibbs, A.C.C.
1987. A comparison of the adhesion, coaggregation and cell-surface
hydrophobicity properties of fibrillar and fimbriate strains of Streptococcus
salivarius. Journal of General Microbiology 133: 3207-3217.
Havenaar, R., Ten Brink, B. & In‘T veld, J.H.J.H. 1992. Selection of strains for
probiotic use. Dalam: Fuller, R. (pnyt.). Probiotics: A scientific basis, hlm.
209-221. London: Chapman & Hall.
Havenaar, R. & Huis in’t Veld, J.H.J. 1992. Probiotics: A general view. Dlm. Wood,
B.J.B. (pnyt.). The Lactic acid bacteria in health and disease, hlm. 151-170.
Essex, UK: Elsevier Applied Science.
Hewitson, J. 2010. When would batch culture be used in preference to continuous

culture? http://www-saps.plantsci.cam.ac.uk/records/rec531.htm.
[13 Disember 2010].
Hofvendahl, K. & Hagerdäl, H.B. 2000. Factors affecting the fermentative lactic acid
production from renewable resources. Enzyme and Microbial Technology 26:
87-107.
Huis in’t Veld, J. H. J., Havenaar, R. & Marteau, P. 1994. Establishing a scientific
basis for probiotic R&D. Trends in Biotechnology 12: 6-8.
Hujanen, M., Linko, S., Linko, Y.Y. & Leisola, M. 2001. Optimisation of media and
cultivation conditions for L(+)(S)-lactic acid production by Lactobacillus
casei NRRL B-441. Applied Microbiology and Biotechnology 56: 126-130.
Hutari, A., Jaseem, W.S., Hamid, A.A. & Yusoff, W.M.W. 2008. An understanding
of the Lactobacillus-Salmonella dynamic interaction both isolated from
Malaysian free-range chicken- A preliminary assessment. Proceedings of the
10th Malaysian Society of Applied Biology Symposium, hlm. 273-278.
Huyghebaert, G. 2003. Replacement of antibiotics in poultry. Proceedings of Eastern

Nutrition Conference, hlm. 55-78.
Idris, A. & Suzana, W. 2006. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter,
initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste
using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochemistry 41: 1117-
1123.
Jacobsen, C.N., Nielsen, V.R., Hayford, A.E., Moller, P.L., Michaelsen, K.F.,
Paerregaard, A., Standstrom, B., Tvede, M. & Jacobsen, M. 1999. Screening
of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp. by in vitro
techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in
human. Applied and Environmental Microbiology 65: 4949-4956.
90
Jankovic, I., Ventura, M., Meylan, V., Rouvet, M., Elli, M. & Zink, R. 2003.
Contribition of aggregation-promoting factor to maintenance of cell shape in
Lactobacillus gasseri 4B2. Journal of Bacteriology 185 (11): 3288-3296.
Jin, L.Z., Ho,Y.W., Abdullah, N., Ali, M.A. & Jalaludin, S. 1996. Antagonistic effect
of intestinal Lactobacillus isolates on pathogens of chicken. Letters in Applied
Jin, L.Z., Ho,Y.W., Abdullah, N. & Jalaludin, S. 1997. Probiotics in poultry: modes of
action. World’s Poultry Science Journal 53: 351-368.
Jin, L.Z., Ho,Y.W., Abdullah, N., Ali, M.A. & Jalaludin, S. 1998. Effect of adherent
Lactobacillus cultures on growth, weight of organs and intestinal microflora
and volatile fatty acids in broilers. Animal Feed Science and Technology 70:
197-209.
Johnston, K.L. 1999. Small intestinal bacterial overgrowth. Veterinary Clinics of

North America: Small Animal Practice 29: 523-550.
Juven, B.J., Schved, F. & Lindner, P. 1992. Antagonistic compounds produced by a

chicken intestinal strain of Lactobacillus acidophilus. Journal of Food
Protection 55: 157-161.
Kabir, S.M.L. 2009. The role of probiotics in the poultry industry. International
Journal of Molecular Sciences 10: 3531-3546.
Kadam, R.S., Patil, S.S., Bastawde, B.K., Khire, M.J. & Gokhale, V.D. 2005. Strain
Improvement of Lactobacillus delbrueckii NCIM 2365 for lactic acid
production. Process Biochemistry 41: 120-126.
Kalavathy, R., Abdullah, N., Jalaludin, S. & Ho, Y.W. 2003. Effect of Lactobacillus
cultures on growth performance, abdominal fat deposition, serum lipids and
weight of organs of broiler chickens. British Poultry Science 44: 139-144.
Kask, S., Laht, T.M. & Paalme, T. 1999. A study on growth characteristic and
nutrient consumption of Lactobacillus plantarum in A-stat culture. Antonie
van Leeuwenhoek 75: 309-320.
Kmet, V. & Lucchini, F. 1997. Aggregation-promoting factor in human vaginal

Lactobacillus strains. FEMS Immunology and Medical Microbiology 19: 111-
114.
Kubitschek, H.E. 1970. Introduction to research with continuous culture. New Jersey:
Prentice-Hall, Inc.
Lacroix, C. & Yildirim, S. 2007. Fermentation technologies for the production of

probiotics with high viability and functionality. Current Opinion in
Biotechnology 18: 176-183.
91
Lan, P.T.N., Binh, L.T. & Benno, Y. 2003. Impact of two probiotic lactobacillus
strains feeding on fecal lactobacilli and weight gains in chicken. The Journal
of General and Applied Microbiology 49: 29-36.
Langhendries, J.P., Detry, J., Van Hees, J., Lamboray, J.M., Darimont, J., Mozin, J.,
Screatin, M.C. & Sentere, J. 1995. Effect of a fermented infant formular
containing viable bifidobacteria on the faecal flora composition and pH of
healthy full-term infants. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition
21: 177-181.
LeBlanc, J.G., Garro, M.S. & deGiori, G.S. 2004. Effect of pH on Lactobacillus
fermentum growth, raffinose removal, α-galaktosidase activity and
fermentation products. Applied Microbiology and Biotechnology 65: 119–123.
Lee, Y.K. 2003. Bioprocess Technology. Dlm. Lee, Y.K. (pnyt.). Microbial
Biotechnology. Principles and Applications, hlm 23-71. Singapore: Word
Scientific Publishing.
Lilly, D.M. & Stillwell, R.H. 1965. Probiotics: Growth promoting factors produced by
microorganisms. Science 147: 747-748.
Lim, C.H., Rahim, R.A., Ho, Y.W. & Arbakariya, B.A. 2007. Optimization of Growth
medium for Efficient Cultivation of Lactobacillus salivarius I 24 using
Response Surface Method. Malaysian Journal of Microbiology 3(2): 41-47.
Lin, W.H., Hwang, C.F., Chen, L.W. & Tsen, H.Y. 2006. Viable counts, characteristic
Evaluation for commercial lactic acid bacteria products. Food Microbiology
23: 74-81.
Lin W.H., Yu, B., Jang, S.H. & Tsen, H.Y. 2007. Different probiotic properties for
Lactobacillus fermentum strains isolated from swine and poultry. Anaerobe
13: 107-113.
Livermore, D.M. 2004. The need for new antibiotics. Clinical Microbiology and
Infection 10 (Suppl. 4): 1–9.
Lopez, J. 2000. Probiotics in animal nutrition. Asian-Australian Journal of Animal

Science 13: 12-26.
M-Patrick, S. & Finn, B. 2008. Modes of fermenter operation. Dlm. McNeil, B. &
Harvey, L.M. (pnyt.). Practical fermentation technology, hlm. 69-95. West
Sussex: John Wiley & Sons, Ltd.
Madigan, M.T., J.M. Martinko & J. Farker. 2000. Brock Biology Microorganisms. 9th
ed. New Jersey: Prentice-Hall International, Inc.
Major, N.C. & Bull, A.T. 1985. Lactic acid productivity of a continuous culture of
Lactobacillus delbreuckii. Biology Letters 7(6): 401-405.
92
Makras, L., Triantafyllou, V., Fayol-Messaoudi, D., Adriany, T., Zoumpopoulou, G.,
Tsakalidou, E., Servin, A. & De Vuyst, L. 2006. Kinetic analysis of the
antibacterial activity of probiotic lactobacilli towards Salmonella enterica
serovar Typhimurium reveals a role for lactic acid and other inhibitory
compounds. Research in Microbiology 157: 241-247.
Maus, J.E. & Ingham, S.C. 2003. Employment of stressful conditions during culture
production to enhance subsequent cold and acid tolerance of bifidobacteria.
Journal of Applied Microbiology 95: 146-154.
Maxon, W.D. 1954. Continuous fermentation. A discussion of its principles and

application. Applied Microbiology 3(2): 110-121.
Mel, M., Karim, M.I.A., Jamal, P., Salleh, M.R.M. & Zakaria, R.A. 2006. The
influence of process parameters on lactic acid fermentation in laboratory scale
fermentation. Journal of Applied Sciences 6(10): 2287-2291.
Metchnikoff, E. 1907. The Prolongation of Life. London: Heinemann.
Moser, S.A. & Savage, D.C. 2001. Bile salts hydrolase activity and resistance to
toxicity of conjugated bile salts are unrelated properties in lactobacilli. Applied
and Environmental Microbiology 67: 3476-3480.
Musikasang, H., Tani, A., H-kittikun, A. & Maneerat, S. 2009. Probiotic potential of
lactic acid bacteria isolated from chicken gastrointestinal digestive tract.
World Journal of Microbiology and Biotechnology 25(8): 1337-1345.
Nancib, N., Nancib, A., Boudjelal, A., Benslimane, C., Blanchard, F. & Boudrant, J.
2001. The effect supplementation by different nitrogen sources on the
production of lactic acid from date juice by Lactobacillus casei subsp.
rhamnosus. Bioresource Technology 78(2): 149-153.
Natarajan, K. & Rajendran, A. 2009. Effect of fermentation parameters on extra

cellular tannase production by Lactobacillus plantarum MTCC 1407.
E-Journal of Chemistry 6(4): 979-984.
Nava, G.M., Bielke, L.R., Callaway, T.R. & Castaneda, M.P. 2005. Probiotic
alternatives to reduce gastrointestinal infections: The poultry experience.
Animal Health Research Reviews 6(1): 105-108.
Nettles, C.G. & Barefoot, S.F. 1993. Biochemical and genetic characteristics of
bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria. Journal of Food
Protection 36: 773–776.
Nowroozi, J., Mirzaii, M., Norouzi, M. 2004. Study of Lactobacillus as Probiotic

Bacteria. Iranian Journal of Public Health 33(2): 1-7.
Nurmi, E. & Rantala, M. 1973. New aspects of Salmonella infection in broiler

production. Nature London 241: 210-211.
93
O-Dichara, A.O., Ampe, F. Uribelarrea, J.-L., Pareilleux, A. & Goma, G. 1997.

Growth and lactic acid production by Lactobacillus casei ssp. rhamnosus in
batch and membrane bioreactor: influence of yeast extract and tryptone
enrichment. 1997. Biotechnology Letters 19 (8): 709-714.
Oyetayo, V.O. & Osho, B. 2004. Assessment of probiotic properties of a strain of

Lactobacillus plantarum isolated from fermenting corn slurry. Food,
Agriculture & Environment 2(1): 132–134.
Palumbi, S.R. 2001. Humans as the world’s greatest evolutionary force. Science 293:
1786-1790.
Pandey, A., Soccol, C.R., Rodriguez-Leon, J.A. & Nigam, P. 2001. Solid state
fermentation in biotechnology: fundamentals and applications. New Delhi:
Asiatech Publishers.
Patterson, J.A. & Burkholder, K.M. 2003. Application of prebiotics and probiotics in
poultry production. Poultry Science Association 82: 627-631.
Parker, R.B. 1974. Probiotics, the other half of the antibiotic story. Animal Nutrition
and Health 29: 4-8.
Parvez, S., Malik, K.A., Ah Kang, S. & Kim, H.-Y. 2006. Probiotics and their
fermented food products are beneficial for health. Jornal of Applied
Pascual, M., Hugas, M., Badiola, J.I., Monfort, J.M. & Garriga, M. 1999.
Lactobacillus salvarius CTC2197 prevents Salmonella enteriditis colonization
in chicken. Applied and Environmental Microbiology 65: 4981-4986.
Pilcher, H.R. 2004. Bacteria banish fowl bugs.

http://www.bioedonline.org/news/news.cfm?art=889. [11 Mac 2009].
Pirt, J.S. 1975. Principles of microbe and cell cultivation. New York: Black Well
Scientific Publication.
Plummer, R.A.S., Blissett, S.J. & Dood, C.E.R. 1995. Salmonella contamination of
retail chickens products sold in the UK. Journal of Food Protection 58(8):
843-846.
Praseno, K. & Yuniwarti, E.Y. 2000. Biologi aves. Semarang: FMIPA Universitas
Diponegoro.
Ragout, A. & Siñeriz, F. 1994. Influence of dilution rate on the morphology and
technological properties of Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus.
Applied Microbiology and Biotechnol 41: 461-464.
Rao, M.S., Munoz, J. & Stevens, W.F. 2000. Critical factor in chitin production from
biomaterials of black tiger shrimp Penaeus monodon by fermentation. Applied
Microbiology and Biotechnology 54: 808-813.
94
Rao, M.S., Pintado, J., Stevens, W.F. & Guyot, J.P. 2004. Kinetic growth parameters
of different amylolytic and non-amylolytic Lactobacillus strain under various
salt and pH condition. Bioresource Technology 94: 331-337.
Ratledge, C. 2001. Biochemistry and physiology of growth and metabolism. Dlm.

Ratledge, C. & Kristiansen, B. (pnyt.). Basic Biotechnology, hlm. 18-44.
Cambridge: University Press.
Reid, G., McGroarty, J.A., Angotti, R. & Cooke, R.L. 1988. Lactobacillus inhibitor
production against Escherichia coli and coaggregation ability with
uropathogens. Canadian Journal of Microbiology 34: 344-351.
Reniero, R., Cocconcelli, P., Bottazzi, V. & Morelli, L. 1992. High frequency of
conjugation in Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor.
Journal of General Microbiology 138: 763-768.
Reque, E. de F., Pandey, A., Franco, S.G. & Soccol, C.R. 2000. Isolation,
identification and physiological study of Lactobacillus fermentum LPB for use
as probiotic in chickens. Brazilian Journal of Microbiology 31: 303-307.
Revolledo, L., Ferreira, C.S.A. & Ferreira, A.J.P. 2003. Comparison of experimental
competitive-exclusion cultures for controlling Salmonella colonization in
broilers chicks. Brazilian Journal of Microbiology. 34: 354-358.
Rinkinen, M. 2004. Methods for assessing the adhesion of probiotic and canine gut-
derived lactic acid producing bacteria to the canine intestinal mucosa in vitro
and measuring mucosal secretory IgA. Academic Dissertation. Faculty of
Veterinary Medicine, University of Helsinki.
Roselli, M., Finamore, A., Britti, M. S., Bossi, P., Oswald, I. & Mengheri, E. 2005.
Alternatives to in-feed antibiotics in pigs: Evaluation of probiotics, zinc or
organic acids as protective agents for the intestinal mucosa. A comparison of
in vitro and in vivo results. Animal Research 54: 203-218.
Rushton, J. H. 1946. Technology of mixing. Chemical Process Indsustry 30: 55-61.
Rusfidra, A. 2007. Ayam kampung diambang kepupusan.

http://www.cimbuak.net/index2.php?option=com_content&do_pdf=1&id=856
.html [5 Mac 2009].
Saarela, M., Rantala, M., Hallamaa, K., Nohyek, L., Virkajarvi, I. & Matto, J. 2004.
Stationary- phase acid and heat treatments for improvement of the viability of
probiotic lactobacilli and bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology 96:
1205-1214.
Salih, N.M.K., Hutari, A., Jaseem, W.S., & Yusoff, W.M.W. 2009. Maximization of
growth and storage of locally isolated Lactobacillus salivarius subsp.
salivarius with high stability and functionality. Proceedings of the 25th
Southern Biomedical engineering Conference, hlm 175-178.
95
Salminen, S., Bouley, C., Boutron-Ruault, M.C., Cummnings, J.H., Frank, A.,
Gibson, G.F.R., Isolauri, E., Moreau, M.C., Roberfroid, M. & Rowland, I.
1998. Functional food science and gastrointestinal physiology and function.
British Journal of Nutrition 80: 147-171.
Sandine, W.E. 1979. Role of Lactobacillus in the intestinal tract. Journal of Food
Protection 42: 259-262.
Schepers, A.W., Thibault, J. & Lacroix, C. 2002. Lactobacillus helveticus growth and
lactic acid production during pH controlled batch cultures in whey
premeate/yeast extract medium. Part I. multiple factor kinetic analysis.
Enzyme and Microbial Technology 30: 176-186.
Schepers, A.W., Thibault, J. & Lacroix, C. 2006. Continuous lactic acid production in
whey permeate/yeast extract medium with immobilized Lactobacillus
helveticus in a two-stage process: Model and experiments. Enzyme and
Microbial Technology 38: 324–337.
Schillinger, U. & Lucke, F. 1989. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated

from meat. Applied and Environmental Microbiology 55 (8): 1901-1906.
Scolari, G., Sarra, P.G., Zacconi, C. & Vescovo, M. 1999. Studies on biochemical
determinant responsible of Lactobacillus salivarius adhesion to chicken crop.
Annali di Microbiologia ed Enzimologia 49: 1-11.
Senthuran, A., Senthuran, V., H-Kaul, R. & Mattiason, B. 1999. Lactic acid
production by immobilized Lactobacillus casei in recycle batch reactor: a step
towards optimization. Journal of Biotechnology 73: 61–70.
Servin, A.L. 2004. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against

microbial pathogens. FEMS Microbiology Reviews 28: 405-440.
Shah, N.P. 2001. Functional foods from probiotics and prebiotics. Food Technology
55 (11): 46-53.
Stanbury, P.F. & Whitaker, A. 1984. Principles of fermentation technology. Oxford:

Pergamon Press.
Stanbury, P.F., Whitaker, A. & Hall, J.S. 1995. Principles of fermentation technology.
Ed. Ke-2. London: Elsevier Science Ltd.
Sun, X. 2004. Broiler performance and intestinal alterations when fed drug-free diets.
Tesis Master. Faculty of the Virginia Polytechnic Institute and State
University, Blacksburg.
Szewezyk, K.W & Warsaw. 1991. The effect of dilution rate vriation on the
performance of continuous fermentation. Bioprocess Engineering (6): 17-19.
96
Tanaka, H., K. Doesburg, T. Iwasaki and I. Mireau. 1999. Screening of lactic acid
bacteria for bile salt hydrolase activity. Journal of Dairy Science 82: 2530-
2535.
Tannock, G.W. 2004. A special fondness for lactobacilli. Applied and Environmental
Tauxe, R.V. 1991. Forward: transmission of human bacterial pathogens through

poultry (Banquet address). Dlm. Blankenship, L.C. (pnyt.). Colonisation
Control of Human Bacterial Enteropathogens, hlm. XV-XXIII. New York:
Academic Press.
Tortora, G.J., Funke, B.R. & Case, C.L. 2001. Microbiology An Introduction. San
Franscisco: Benjamin Cumminga.
Tuomola, E., Crittenden, R., Playne, M., Isolauri, E. & Salminen, S. 2001. Quality
assurance criteria for probiotic bacteria. American Journal of Clinical
Nutrition 73(2): 393s-398s.
Vandenbergh, P.A. 1993. Lactic acid bacteria, their methabolic products and
interference with microbial growth. FEMS Microbiology Reviews 12: 221-238.
Voravuthikunchai, S.P., Bilasoi, S. & Supamala, O. 2006. Antagonistic activity

against pathogenic bacteria by human vaginal lactobacilli. Anaerobe 12: 221-
216.
Walter, J. 2005. The microecology of Lactobacilli in the gastrointestinal tract. Dlm.

Tannock, G.W. (pnyt.). Probiotics & prebiotics: Scientific aspects, hlm 51-82.
Wymondham: Caister Academic Press.
Wang, X., Jin, B. & Mulcahy, D. 2008. Impact of carbon and nitrogen sources on
hydrogen production by newly isolated Clostridium butyricum W5.
International Journal of Hydrogen Energy 33: 4998-5005.
Zacconi, C., Scolari, D. Fraioli, D. & Sarra, P.G. 1999. Colonisation of chicken
intestinal tract by Lactobacillus salivarius A23 strain. Annali di Microbiologia
ed Enzimologia 49: 103-115.
LAMPIRAN A
LENGKUK PIAWAI
A.1 Lengkuk Piawai Berat Kering Sel
4.5
y = 1.6686x - 0.0724
4 2
R = 0.9837
Berat kering biojisim (g/L)
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
OD (600nm)
A.2 Lengkuk Piawai Glukosa
1.2
1 y = 0.3201x
2
R = 0.9982
0.8
OD (500nm)
0.6
0.4
0.2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
98
A.3 Lengkuk Piawai Ammonium
1.4
y = 21.965x
1.2 2
R = 0.9928
1
OD (625nm)
0.8
0.6
O
0.4
0.2
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
kepekatan ammonium (g/L)
99
LAMPIRAN B
PENYEDIAAN REAGEN DAN PENIMBAL
B. 1 Penyediaan Reagen A dan B bagi Pengasaian Ammonium
Reagen A
Fenol 10 mL
Sodium nitroprusside 0.05 g
Dijadikan 1 L dengan penambahan air suling
Reagen B
NaOH 5g
Sodium hipochlorite 19.8 mL
B2. Penyediaan Penimbal Garam Fosfat (PBS)
NaCl 8g
KH2PO4 0.34 g
K2HPO4 1.21 g
pH dikalibrasi menjadi 7.2
100
LAMPIRAN C
FORMULA PENGIRAAN DAN KALIBRASI
C.1 Formula Pengiraan Pencairan
Faktor pencairan yang dikehendaki = Jumlah isipadu pencairan (ml)

Isipadu sampel (ml)
C.2 Kadar Pencairan (D) dan Kalibrasi Pam Peristaltik
D = F/V
Apabila, F = Kadar alir medium
V = Isipadu medium
Isipadu (V) fermentor sepanjang masa pengkulturan adalah 2 L. Pam

peristaltik dikalibrasi sedemikian sehingga kadar alir medium masuk dan
keluar menepati kadar pencairan yang dikehendaki.
D (/jam) F (L/j)
0.05 0.1
0.1 0.2
0.2 0.4
0.3 0.6
0.35 0.7
0.45 0.9
C.3 Formula Pengiraan Unit Pembentukan Koloni (cfu)
Jumlah koloni bakteria (cfu) / ml = jumlah koloni dalam piring petri *

pencairan X 0.1 ml**
* jumlah koloni bakteria yang dikira antara 30 hingga 300
** Hasil pencairan yang dituang kedalam piring petri ialah 0.1 ml
101
LAMPIRAN D
ANALISIS DATA KINETIK
D1. Kadar Pertumbuhan Spesifik (µ)
Fasa log atau eksponen dapat diperihalkan dalam bentuk persamaan matematik:
dX/dt = µX (1)
Dimana, X = kepekatan biojisim (g/L)

t = masa (j)
µ = kadar pertumbuhan spesifik (/jam)
Persamaan ini hanya sah pada fasa eksponen sahaja kerana pada fasa
lag dan pegun, dX/dt = 0. Pada fasa eksponen, kadar pertumbuhan spesifik
dapat diukur.
Apabila persamaan di atas (1) dikamirkan, dapat:
X = Xoeµt
Dimana, Xo = kepekatan biojisim semasa mula pengkulturan
X = kepekatan biojisim semasa pengkulturan
µ dapat dikira apabila X, Xo dan t diketahui
µ dapat ditentukan dari kecerunan pada persamaan linear antara ln X (biojisim)
terhadap masa (j).
ln X
ln Xo t (masa)
Rajah 1. Graf ln X lawan dengan t (masa)

102
D.2 Masa Penggandaan (td)
Masa penggandaan biojisim adalah berkaitan dengan kadar pertumbuhan

spesifik. Persamaan ini ditentukan apabila X = 2Xo dan t = td daripada
persamaan berikut;
ln X/Xo = µt (2)
ln X-ln Xo = µt
ln X = µt + ln Xo
gantikan nilai X = 2Xo dan t = td ke dalam persamaan (2) di atas
ln 2Xo /Xo = µtd (3)
td = ln 2/µ = 0.693/µ (4)
Maka td dapat dikira apabila µ dapat diketahui.
D.3 Darjah Penggandaan (n)
Darjah penggandaan dapat dikira menggunakan formula:

n = 3.32 log (X/Xo)
D.4 Hasil Pertumbuhan
Hasil pertumbuhan (Yx/s) biojisim per substrat terguna dapat dikira

menggunakan formula: Yx/s = dX/dS
X- Xo = Y (So – S)
Dimana, Xo = biojisim awal, So = kepekatan substrat awal
Untuk pertumbuhan yang terhad oleh substrat, X = Xm ; S ≈ 0
sehingga Xmaks – Xo = YSo
Yx/s = Xmaks – Xo / So
103
D.5 Produktiviti Biojisim pada Kultur Kelompok
R = (Xmaks – Xo) / (ti + tiii)

Xmaks = kepekatan biojisim maksimum yang diperolehi pada fasa pegun
Xo = kepekatan biojisim awal semasa inokulasi
ti = masa selama bakteria tumbuh pada µmaks
tiii = masa selama bakteria tidak tumbuh pada µmaks dan termasuk fasa lag,
fasa nyahpecutan, pengsterilan dan penuaian.
D.5 Produktiviti Biojisim pada Kultur Selanjar
R = D X (1-tiii/T)
R = Produktiviti biojisim ( g/L/j)
tiii = tempoh masa sebelum keadaan malar, termasuk persediaan pada saluran
fermentor, termasuk pengsterilan, dan operasi yang berlaku dalam kultur
kelompok sebelum kepada operasi kultur selanjar
D = kadar pencairan (/jam)
T = tempoh masa pengkulturan pada keadaan mantap
X = kepekatan biojisim pada keadaan mantap (g/L)
Apabila T » tiii, maka R = D X
Sumber: Pirt 1975; Stanbury et al. 1995

104
LAMPIRAN E
UJIAN STATISTIK
Ujian samper T berpasangan daripada data kesan kepekatan glukosa awal (20, 30 dan
40 g/L) awal pada kadar pencairan 0.3/jam ke atas kepekatan biojisim.
T-Test
Kepekatan glukosa awal 20 g/L – 30 g/L
Paired Samples Statistics
Std. Error
Mean N Std. Deviation Mean
Pair 1 20g/L 3.3777 45 1.28208 .19112
30g/L 3.7064 45 1.28103 .19096
Paired Samples Correlations
N Correlation Sig.
Pair 1 20g/L & 30g/L 45 .977 .000
Paired Samples Test
Paired Differences
Std. Error 95% Confidence Interval
Mean Std. Deviation Mean of the Difference
Lower Upper
Pair 1 20g/L - 30g/L -.3288 .27271 .04065 -.4107 -.2468
t df Sig. (2-tailed)
-8.087 44 .000
105
T-Test
Std. Error
Pair 1 20g/L 3.3777 45 1.28208 .19112
40g/L 3.4338 45 1.17727 .17550
N Correlation Sig.
Pair 1 20g/L & 40g/L 45 .982 .000
Paired Samples Test
Paired Differences
Lower Upper
Pair 1 20g/L - 40g/L -.0561 .25319 .03774 -.1322 .0200
-1.487 44 .144
106
T-Test
Std. Error
Pair 1 30g/L 3.7064 45 1.28103 .19096
40g/L 3.4338 45 1.17727 .17550
N Correlation Sig.
Pair 1 30g/L & 40g/L 45 .994 .000
Paired Samples Test
Paired Differences
Lower Upper
Pair 1 30g/L - 40g/L .2726 .17241 .02570 .2208 .3244
10.608 44 .000
107
LAMPIRAN F
SENARAI PENERBITAN
Andri Hutari, Aidil Abdul Hamid & Wan Mohtar Wan Yusoff. 2008. Isolation and
identification of Lactobacillus and Salmonella from Malaysian chicken.
Prosiding Kolokium Siswazah Ke-8, Fakulti Sains dan Teknologi, Universiti
kebangsaan Malaysia.
Andri Hutari, Waleed Shaker Jaseem, Aidil Abdul Hamid & Wan Mohtar Wan
Yusoff. 2008. An understanding of the Lactobacillus-Salmonella dynamic
interaction both isolated from Malaysian free-range chicken- A preliminary
assessment. Proceedings of the 10th Malaysian Society of Applied Biology
Symposium. Kuching, Malaysia.
Salih, N.M.K., Hutari, A., Jaseem, W.S., & Yusoff, W.M.W. 2009. Maximization of
growth and storage of locally isolated Lactobacillus salivarius subsp. salivarius
with high stability and functionality. Proceedings of the 25th Southern
Biomedical engineering Conference. Miami, Florida, USA.
Andri, H., Waleed, S.J., Aidil, A.H. & Wan Mohtar, W.Y. 2010. Screening of
Lactobacillus strains against Salmonella both isolated from Malaysian free-
range chicken intestine for use as probiotic. Sains Malaysiana (accepted for
publication).
Waleed, S.J., A. Hutari, N.M.K. Salih & W.M.W. Yusoff. 2010. Interaction between
lactic acid bacteria and Salmonella both isolated from free-range chicken. In
vitro assessment using continuous fermentation. Proceedings of International
Conference of Bioprocessing and Application of Microbial Biotechnology in
Agriculture. Cairo, Egypt.

TESIS Master UKM - Andri PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

TESIS Master UKM - Andri PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PEMENCILAN Lactobacillus spp.

DAN PENINGKATAN PENGHASILAN

TESIS YANG DIKEMUKAKAN UNTUK MEMPEROLEH IJAZAH

FAKULTI SAINS DAN TEKNOLOGI

24 Januari 2011 ANDRI HUTARI

Setinggi-tinggi penghargaan dirakamkan kepada Prof. Dr. Wan Mohtar Wan

Penghargaan teristimewa saya tujukan kepada Zahraini Yumna, istri tercinta,

ISOLATION OF Lactobacillus spp. AND ENHANCE BIOMASS

1.1 Latar Belakang 1

1.2 Objektif Kajian 4

2.1 Probiotik dan Bakteria Asid Laktik 5

2.1.1 Kepentingan bakteria asid laktik 8

2.2 Populasi Bakteria Asid Laktik (LAB) dalam Saluran

2.3 Teknik Pengkulturan untuk Peningkatan Penghasilan

2.4 Pencapaian dan Kelebihan Sistem Kultur Selanjar Berbanding 21

2.5 Faktor-faktor Penting dalam Peningkatan Penghasilan dan

2.5.1 Kesan kadar pencairan 25

BAB III BAHAN DAN KAEDAH 31

3.1 Ayam Kampung 31

3.2 Bahan Kimia untuk Penyediaan dan Pengasaian 31

3.3 Strain Bakteria 32

3.3.1 Pemencilan dan pengenalpastian Lactobacillus spp. 32

3.4 Penyediaan Kultur Stok 33

3.5 Penyediaan Sampel Mikroskop Elektron Imbasan (SEM) 33

3.6 Ujian Pencirian In vitro Lactobacillus spp. 34

3.6.1 Ujian agregasi 34

3.7 Penentuan Hubungkait diantara Lactobacillus spp. dan

3.7.1 Ujian agar titik 36

3.8 Penyediaan Medium Fermentasi 38

3.9 Pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam Kultur

3.9.1 Penyediaan inokulum 39

3.10 Pengkulturan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam Kultur

3.10.1 Kesan kadar pencairan ke atas pertumbuhan L.

3.11.1 Penentuan berat kering biojisim 42

3.12 Ujian Statistik 43

3.13 Carta Alir Penyelidikan 43

BAB IV HASIL DAN PERBINCANGAN 45

4.1 Pemencilan Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. 45

4.2 Ujian Pencirian In vitro Lactobacillus spp. 49

4.2.1 Ujian agregasi 49

4.3 Hubungkait diantara Lactobacillus spp. dan Salmonella spp. 53

4.4 Profil Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam

4.4.1 Kesan kadar goncangan, pH awal dan kepekatan

4.5 Profil Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG dalam

4.5.1 .Profil Pertumbuhan L. salivarius subsp. salivarius IG

4.6 Prosedur Operasi Piawai (SOP) Pengkulturan L. salivarius

4.6.1 Penyediaan inokulum

5.2 Cadangan Kajian Lanjutan 84

B Penyediaan Reagen dan Penimbal 99

C Formula Pengiraan dan Kalibrasi 100

D Analisis Data Kinetik 101

E Ujian Statistik 104

F Senarai Penerbitan 107

No. Jadual Halaman

3.1 Komponen medium kaldu De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) 39

4.1.1 Pengenalpastian strain Lactobacillus spp. dan Salmonella 45

4.1.2 Profil biokimia strain Lactobacillus spp. pada kit API 50 46

4.1.3 Profil biokimia strain Salmonella spp. pada kit API 20 E 46

4.2 Agregasi, koagregasi dan kerintangan terhadap pH rendah

4.3 Ujian aktiviti perencatan Lactobacillus spp. terhadap 54

4.4 Kesan kadar pencairan ke atas purata kepekatan biojisim,

4.5 Kesan kadar pencairan ke atas produktiviti biojisim dan

4.6 Kesan kepekatan glukosa awal pada kadar pencairan 0.3/jam