12/3/2020

Morfin dan
Analognya
Najwa Kusuma Putri Antariksa
(1808511006)
Diterjemahkan Oleh:
Maria Irnawati Weta (1808511019)
Lorensa Nainggolan (1808511023)
 2.3

II.2.3 Morfin
dan analognya
oleh Hideyuki Yamada dan Kazuta Oguri

Pengantar

Terdapat sejumlah senyawa, seperti morfin dan kodein, dimana diklasifikasikan ke

dalam alkaloid opium (opiat). Mereka digunakan sebagai obat resep analgesik narkotika dan
tussives anti; 1% bubuk kodein atau dihidrokodein umumnya termasuk dalam perhitungan
berlebihan obat antitusif.
> Gambar 3.1 menunjukkan jalur metabolisme morfin, heroin dan kodein. Sejak
morfin dan kodein akhirnya diekskresikan dalam urin dalam bentuk terkonjugasi dengan
asam glukuronat [1-3], perlu untuk menghidrolisis bentuk terkonjugasi senyawa ini sebelum
analisis GC / MS. Heroin dengan cepat terdeasetilasi dan akhirnya diekskresikan dalam urin
sebagai glukuronida morfin. oleh karena itu, tidak mudah untuk membedakan penggunaan
heroin dari penggunaan morfin [4, 5]. Deteksi 6-asetilmorfin dianjurkan untuk diagnosis
penggunaan heroin, karena waktu paruh yang relatif panjang di dalam tubuh [4].
Untuk diagnosis yang akurat dari penyebab kematian dalam kasus keracunan opiat, rasio
bentuk bebas ke bentuk terkonjugasi menjadi penting (lihat bagian 4 dari bab ini). Dalam
kasus seperti itu, Opiat hidrolisis sebelum (bentuk bebas) dam setelah (dalam jumlah total)
harus dianalisis. Jumlah bentuk yang terkonjugasi dapat dihitung dengan mengurangkan
jumlah bentuk bebas dari jumlah total yang ada. Oleh HPLC, analisis yang simultan dari
bentuk bebas dan terkonjugasi adalah mungkin tanpa adanya hidrolisis apapun; dalam waktu
dekat, LC / MS mungkin dapat menjadi alat utama untuk analisis opiat dan metabolitnya.
Namun, untuk saat ini, GC / MS banyak digunakan untuk analisis candu.
Untuk analisis HPLC bentuk terkonjugasi dari opiat, standar autentik dari morfin-3-
glukuronida (M-3-G) dan morfin-6-glukuronida (M-6-G) sangatlah diperlukan. Di Amerika
Serikat dan Eropa, sangatlah mudah untuk mendapatkan senyawa autentik ini dari sumber-
sumber komersial, namun kegiatan impor senyawa ini ke Jepang dikontrol dengan ketat;
pelonggaran impor untuk senyawa-senyawa tersebut harus direalisasikan.

GC dan GC / MS analisis

Reagen dan persiapan mereka

 Etilmorfin (internal standar, IS) Sebuah larutan: alikuot 1-mg etilmorfin hidroklorida
(Sankyo Co, Ltd, Tokyo, Jepang) dilarutkan dalam air murni untuk membuat larutan 1
mg / mL. 0,1 mL alikuot dari larutan ini dicampur dengan 1,9 ml air murni untuk
pengenceran sebanyak 20 kali lipat (konsentrasi akhir dalam bentuk garam hidroklorida:
50 ug / mL), yang disimpan pada suhu -20 ° C.

© Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2005

 19
6
⊡ Gambar 3.1 M
or
ph
in
e
da
n
an
al
og
ny

jalur metabolik utama morfin, heroin dan kodein. Panah tebal dan tipis menunjukkan jalur metabolisme utama dan minor, masing-masing.
 GC dan GC / MS
analysis197
 solusi standar morfin untuk kurva kalibrasi (2, 6 dan 20 mg / mL): alikuot 1-mg morfin
hidroklorida (Shionogi & Co, Ltd, Osaka, Jepang dan produsen lain) dilarutkan dalam air
murni untuk membuat 1 mg / mL; 0,1 mL larutan. Larutan ini dicampur dengan 4,9 mL
air murni untuk pengenceran sebanyak 50 kali lipat (20 ug / mL). Larutan terakhir ini
diencerkan 3,33 kali lipat dan 10 kali lipat untuk mempersiapkan larutan 6 dan 2 mg /
mL, masing-masing, yang juga disimpan pada -20 ° C. Untuk mempersiapkan larutan
standar yang akan digunakan untuk kurva kalibrasi 6-asetilmorfin hidroklorida atau
kodein fosfat (Shionogi & Co), prosedur pengenceran yang sama diikuti. 6-Asetilmorfin
hidroklorida dapat disintesis dengan metode dilaporkan sebelumnya [6].
 5 M NaOH solusi (100 ml): 20-g aliquot dari NaOH dilarutkan dalam sekitar 70 mL
dimurnikan air dalam gelas volume yang beaker 100-mL dengan mengaduk
dalam bak es. Setelah suhu larutan didinginkan sampai suhu kamar, kemudian
dipindahkan ke 100 mL-volume volumetrik labu bersama-sama dengan larutan
air yang telah digunakan untuk mencuci gelas kaca di atas, dan volume
disesuaikan dengan 100 mL persis . Solusinya disimpan pada suhu kamar;
adalah penting untuk menutup termos kedap udara, karena CO2 di udara
atmosfer dapat diserap ke dalam larutan NaOH untuk menghasilkan NaHCO3,
mengakibatkan penurunan titer dari larutan.
 5 M NH4Cl / NH3 larutan buffer (pH 9, sekitar 200 mL): volume 23,7 mL 28% ammonia
larutan air dilarutkan dalam air murni untuk mempersiapkan larutan 250 mL (5 solusi M
NH3). Sebuah 13,4 g aliquot dari NH4Cl dilarutkan dalam air murni untuk
mempersiapkan 50 mL larutan (5 solusi M NH4Cl). Jumlah yang tepat dari larutan 5 M
NH3 dicampur dengan larutan 5 M NH4Cl untuk menyesuaikan pH menjadi 9,0. buffer
dapat disimpan pada suhu kamar.
 Larutan 10 M KOH jenuh dengan KHCO3 (100 mL): 56-g aliquot dari KOH dilarutkan
dalam sekitar 70 mL air murni dalam 100 mL volume yang beaker glass dengan
mengaduk dalam bak es. Volume larutan disesuaikan menjadi sekitar 85 mL
dengan air dimurnikan dan dibiarkan sampai didinginkan sampai suhu kamar.
The KHCO3 bubuk ditambahkan ke dalam larutan NaOH sampai jenuh dengan
pengadukan (sekitar 30 g diperlukan). Setelah saturasi, volume larutan menjadi
menjadi sekitar 100 mL. Ini dapat digunakan untuk percobaan dan diawetkan
pada suhu kamar.
 pra-perawatan dari cartridge ekstraksi fase padat (Obligasi Elut Sertifikasi) b: Volume 2-mL
metanol dan 2 mL air dimurnikan dilewatkan melalui cartridge Obligasi Elut Sertifikasi
(Var- ian, Harbour City, CA, USA) sebelum digunakan. Untuk kartrid baru, setiap solusi
dapat mengalir dengan tekanan alami melalui itu tanpa aspirasi apapun. Ketika aliran
berhenti, itu disedot sejenak; maka metanol atau air dapat mengalir melalui itu hanya
dengan gravitasi. Air dimurnikan tidak harus melewati cartridge benar-benar; cartridge
tidak harus dikeringkan. Aliran air harus dihentikan, ketika volume air di waduk menjadi
kecil.

kondisi analisis

kolom GC: DB-1 (15 m × 0,25 mm id, ketebalan film 0,25 µm, J & W Ilmiah, Folsom, CA,
USA).
Kondisi GC / MS; Instrumen: sebuah HP5890 GC-HP 5989A MS Mesin (Agilent-
teknologi gies, Palo Alto, CA, USA); Kolom (oven) suhu: 200 ° C (0,5 menit) → 5 ° C /
menit → 260 ° C (3 menit); Suhu injeksi: 200 ° C; Volume injeksi: 1 µL (modus pisah); gas
pembawa: He; mengalir tekanan: 6 psi; Modus ionisasi: EI; energi elektron: 70 eV.
198Morphine dan analognya

Prosedur
Dua metode ekstraksi, ekstraksi cair-cair dan ekstraksi fase padat, tersedia; yang terakhir
memberikan ekstrak yang lebih bersih untuk analisis GC dan GC / MS.
i.ekstraksi cair-cair
i. Sebuah volume 2-mL urin c dan 1,5 ml asam klorida pekat ditempatkan dalam tabung
centrifuge Volume kaca 50-mL dengan tanah-in stopper, dan dipanaskan pada 100 ° C
selama 30 menit dalam bak air untuk menghidrolisis bentuk terkonjugasi dari senyawa
target. Tingkat air mandi air harus sedikit di atas tingkat permukaan larutan hidrolisis
dalam tabung. Sebagai tes kosong, 2 mL urin yang diperoleh dari subjek yang sehat juga
diperlakukan seperti di atas. Untuk percobaan kuantitatif, di samping itu, volume 0,1 mL
masing-masing larutan pada tiga konsentrasi candu (2,6 dan 20 µg / mL) ditambahkan ke
2 mL masing-masing dari urin kosong; sampel ini juga diproses dengan cara yang sama
seperti di atas.
ii. Setelah pendinginan sampai suhu kamar, 0,1 mL IS larutan ditambahkan ke solusi
terhidrolisis. Volume 3-mL dari 5 M NaOH ditambahkan ke solusi untuk netralisasi,
diikuti dengan penambahan 4 ml 5 M NH4Cl / NH3 larutan buffer (pH 9). PH akhir dari
tion solu- harus diperiksa dengan kertas tes (Whatman, tipe CF); jika pH bergeser solusi
dari 9, harus menyesuaikan dengan pH 9,0 dengan menambahkan larutan amonium
penyangga di atas.
iii. Larutan di atas diekstraksi dengan 15 ml kloroform / isopropanol (9: 1, v / v) dengan
gemetar.
iv. Setelah sentrifugasi pada 3.000 rpm selama 5 menit, lapisan organik (lebih rendah)
dipindahkan dengan hati-hati ke tabung centrifuge kaca volume 50 mL lainnya dari jenis
yang sama dengan pipet, diikuti dengan penambahan jumlah yang cukup dari natrium
sulfat anhidrat ( 2–3 g), dan tercampur rata .
v. Larutan organik dilewatkan melalui kertas saringan yang dilipat untuk menghilangkan
dehidrator dan dikumpulkan dalam tabung centrifuge kaca d volume 10 mL dengan
penghenti ground-in (bentuk dasar tabung lebih disukai berbentuk kerucut). Larutan ini
diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen dengan menghangatkan tabung pada 30-
40 ° C.
vi. Residu dalam tabung dicampur dengan 50 μL reagen e N, O-bis (trimetilsilil) asetamam
(B SA), ditutup dengan kedap udara dan dipanaskan pada suhu 80 ° C selama 20 menit;
alikuot 1-μL dari larutan yang diderivatisasi diinjeksikan ke GC atau GC / MS.
vii. Untuk bentuk morfin, kodein, dan 6-asetilamorfin (bebas) tak terkonjugasi, ekstraksi dibuat
sebagai berikut f. Volume urin 2 mL diencerkan 2 kali lipat dengan air murni dan dicampur
dengan 0,1 mL larutan IS dan 0,2 mL larutan buffer 5 M NH4Cl / NH3 (pH 9). PH larutan
dikonfirmasikan menjadi 9 dengan kertas uji pH; jika tidak, ditambahkan larutan amonium
buffer dalam jumlah yang sesuai. Larutan tersebut diekstraksi dengan 10 mL kloroform /
isopropanol (9: 1, v / v), dan prosedur berikut dilakukan sesuai dengan langkah iv-vi di atas.
Sampel urin dan kalibrasi kosong juga diproses dengan cara yang sama
ii. ekstraksi fase padat
i. Hidrolisis urin dibuat sesuai dengan langkah saya dari bagian atas.
ii. Larutan terhidrolisis dicampur dengan larutan IS a, diikuti dengan penambahan 1,5 mL
larutan KOH 10 M secara hati-hati dan bertahap yang jenuh dengan KHCO3 (muncul
gelembung), dicampur dengan 3 mL larutan buffer Tris-HCl 2 M (pH 8.1). dan diaduk
dengan baik. PH larutan akhir dipersiapkan menjadi 8–9 dengan kertas uji. Jika tidak, pH
larutan diatur ke 8-9 menggunakan larutan KOH 10 M jenuh dengan KHCO3 atau larutan
1 M HCl.
 GC dan GC / MS
analysis199

iii. Larutan tersebut dituangkan ke dalam Bond Elut Certify Cartridge untuk membiarkan
larutan mengalir di dalam cartridge perlahan-lahan membutuhkan waktu lebih dari 2
menit untuk menyerap opiat.
iv. Cartridge dicuci dengan 2 mL masing-masing air murni, 0,1 M larutan buffer asetat (pH
4) dan metanol, dan dikeringkan selama 2 menit dengan aspirasi dengan manifold
vakum, diikuti dengan pencucian dengan 3 mL methanol dan pengeringan selama 5
menit lagi.
v. Target opiat dielusi, dengan melewati 2 mL diklorometana / isopropanol / amonia wa ter
(80: 20: 2, v / v) melalui cartridge, ke tabung sentrifus Volume kaca 10-mL dengan
tanah-in stopper ( bentuk bagian bawah tabung sebaiknya menjadi kerucut). eluat yang
diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen dengan pemanasan pada 30-40 ° C.
vi. The derivatisasi dan injeksi ke GC atau GC / MS yang dibuat persis dengan cara yang
sama seperti yang dijelaskan dalam langkah vi) di atas bagian ekstraksi cair-cair.
vii. Untuk yang tak terkonjugasi (gratis) bentuk morfin, codeine dan 6-asetilmorfin, yang
pencabutan yang dibuat sebagai berikut. Sebuah volume 2-mL urin diencerkan 2 kali
lipat dengan air murni dan dicampur dengan 0,1 mL IS solusi dan 0,2 ml 2 M Tris-HCl
larutan buffer (pH 8.1). PH larutan dikonfirmasi untuk menjadi 8-9; jika tidak, jumlah
yang tepat dari larutan penyangga di atas ditambahkan ke dalamnya. Kosong urine dan
kalibrasi sampel diproses dengan cara yang sama. Sampel ini sama-sama diperlakukan
sesuai dengan langkah di atas iii-vi.

Penilaian dan beberapa komentar pada metode

Analisis kualitatif dilakukan dengan menemukan puncak muncul pada waktu retensi yang
sama seperti yang dari standar otentik setelah trimethylsilyl (TMS) derivatisasi; juga tant
impor- untuk mengkonfirmasi tidak adanya yang sesuai puncak dalam spesimen kosong. The
tification iDEN- akhir dibuat dengan membandingkan spektrum massa yang diperoleh dari
spesimen uji dengan yang diperoleh dari standar otentik. Sebuah ion Total kromatogram
(TIC) dari com- otentik
pon ditunjukkan pada > Gambar. 3.2; spektrum massa senyawa diderivatisasi
ditampilkan di> Gambar. 3.3. Penghitungan dilakukan dengan ion yang dipilih
pemantauan (SIM) menggunakan ketinggian puncak atau rasio area senyawa tes untuk
IS; rasio diterapkan untuk kurva kalibrasi, yang
telah dipersiapkan sebelumnya, untuk menghitung konsentrasi senyawa uji di speci- sebuah

⊡ Gambar
3.2

TIC derivatif TMS morfin dan analog nya dengan GC / MS. Heroin tidak diderivatisasi.
Puncak turunan TMS dari ethylmorphine tidak termasuk dalam kromatogram ini; tetapidielusi
pada 9,4 menit di bawah kondisi yang sama.
200Morphine dan yang analog

⊡ Gambar 3.3
Kelimpahan

J00
200 300 400

N-CH>
Kelimpahan

100
000 300 400 m ^ z

N-
CMH
Kelimpahan

I00
200 300 400 m / z

100 20 300 400

0
 HPLC analisis201

laki-laki. Puncak untuk dideteksi adalah sebagai berikut (nomor massa digarisbawahi yang akan
digunakan untuk kuantisasi).
morfin-TMS: m / z 429 (M +), 414, 401, 287
6-acetylmorphine-TMS: m / z 399 (M +), 340, 287, 204
kodein-TMS: m / z 371 (M +), 343, 234, 178
ethylmorphine-TMS: m / z 385 (M
+) nalorphine-TMS: m / z 455 (M
+)

Dengan SIM dari GC / MS, tingkat rendah morfin kurang dari 100 ng / mL dapat dideteksi
dan kuantitas produk tated; Namun, ketika tingkat rendah morfin terdeteksi, perawatan
khusus harus diambil, karena alasan berikut. tingkat rendah (0,1-25 pmol / g jaringan) morfin
yang ada di berbagai mals ani- termasuk manusia sebagai senyawa endogen; tingkat
meningkat secara signifikan oleh berbagai tekanan [7]. Oleh karena itu, deteksi rendahnya
tingkat morfin mulai dari sejumlah besar spesimen tidak bisa menjadi bukti asupan obat.
Tingkat morfin dalam urin dari subyek sehat ditentukan oleh GC / MS dilaporkan menjadi
sekitar 1 ng / mL [8]. Benih poppy yang digunakan untuk berbagai makanan; ketika
makanan termasuk biji yang dimakan, sebuah jumlah yang cukup morfin (termasuk
konjugat-nya) dilaporkan akan diekskresikan ke dalam urin [9]. Karena alasan ini,
tampaknya masuk akal untuk menetapkan nilai cutoff morfin dalam urin menjadi 300 ng /
mL. Namun, hati-hati diperlukan, karena konsentrasi morfin lebih tinggi dari tingkat cutoff
dapat dideteksi pada beberapa sampel urin mata pelajaran yang telah makan makanan yang
mengandung biji poppy [9]. Perlu dicatat bahwa jumlah codeine sebanding dengan morfin
juga termasuk dalam poppy seed makanan yang mengandung [10].
Waktu paruh heroin lenyapnya dalam tubuh manusia dilaporkan menjadi hanya sekitar 2
menit. Hal ini, oleh karena itu, tidak mungkin untuk mendeteksi heroin diri dari urine untuk
membuktikan penyalahgunaan nya. 6-Asetilmorfin adalah alternatif yang dianalisis sebagai
indikator penyalahgunaan heroin; Namun, bahkan dengan metabolit ini, paruhnya hanya
sekitar 40 menit, yang jauh lebih pendek daripada morfin tak terkonjugasi (3,7 h) [4].
Bahkan jika nilai cutoff dari 6- Asetilmorfin ditetapkan menjadi serendah 0,8 ng / mL, ia
sedang pertimbangan- ered diperlukan untuk menganalisis spesimen urin sampel tidak lebih
dari 5 jam setelah asupan heroin [4].

analisis HPLC
Reagen dan persiapan mereka

 Larutan standar morfin untuk kurva kalibrasi (2, 6 dan 20 mg / mL): lihat “Reagen dan
persiapan mereka”, di atas GC dan GC / MS bagian analisis.
 0,5 M Larutan amonium sulfat (pH 9,4, 100 mL): alikuot 6,6-g amonium sulfat
dilarutkan dalam sekitar 80 mL air murni, diikuti dengan penyesuaian pH-nya menjadi
9,4 dengan larutan amonia encer. Volume ini disesuaikan menjadi 100 mL menggunakan
volume volumetrik dan disimpan pada suhu kamar E
 Massa spektrum TMS turunan dari morfin otentik dan analognya. A: morfin-TMS; B: 6-
asetilmorfin-TMS; C: kodein-TMS; D: etilmorfin-TMS; E: nalorfin-TMS. Sebuah volume 50-
uL BSA ditambahkan ke 20 µg masing-masing opiat untuk derivatisasi [lihat bagian 2-3) -
(1) -vi)];0,4- µL aliquot setiap disuntikkan ke GC / MS.
202Morphine dan analognya

 Larutan 5 mM Ammonium sulfate (pH 9.4): alikuot 66-mg amonium sulfat yaitu
mengalami penyedotan prosedur di atas, dan disimpan pada suhu kamar.
 0,5 M Fosfat larutan buffer (pH 2.1, 500 mL): a 24,5-g aliquot dari asam fosfat adalah
dilarutkan dalam 400 mL air murni, diikuti dengan penyesuaian pH untuk 2,1
menggunakan beberapa persen larutan NaOH. Volume akhir larutan disesuaikan dengan
500 mL dengan menambahkan air murni, dan disimpan pada suhu kamar.
 50 mM fosfat larutan buffer (pH 2.1, 100 mL): 0,5-g aliquot dari asam fosfat adalah
dilarutkan dalam sekitar 80 mL air murni, diikuti dengan penyesuaian pH untuk 2,1
menggunakan encer larutan NaOH. Volume akhir larutan disesuaikan dengan 100 mL
dengan menambahkan air murni, dan disimpan pada suhu kamar.
 0,2 M Sodium dodecyl sulfat (SDS) solusi (100 ml): 5,8-g aliquot dari SDS dilarutkan
di sekitar 70 mL air murni dalam labu volumetrik, dan meninggalkan semalam untuk
gelembung menyia-nyiakan. air murni yang lembut ditambahkan ke dalam larutan di atas
untuk mempersiapkan 100 solusi mL, dicampur dengan baik dan disimpan pada suhu
kamar.
 fase gerak, 5 mM-SDS mengandung 100 mM larutan buffer fosfat (pH 2.1) / ACE
tonitrile (76:24, v / v, 1 L): volume 152 mL 0,5 M larutan buffer fosfat dan 19 mL di atas
0,2 solusi M SDS ditempatkan dalam sebuah gelas Volume 1-L lulus silinder; volume
akhir larutan disesuaikan dengan 760 mL dengan menambahkan air murni, baik
dicampur dan ditransfer ke 1-L Volume Erlenmeyer. Sebuah volume 240 mL asetonitril
dari HPLC kelas diukur dengan silinder di atas kosong lulus, dan ditambahkan ke dalam
larutan dalam labu Erlenmeyer. Setelah pencampuran, solusi fase gerak dilewatkan
melalui filter (Millicup-HV, Millipore, Bedford, MA, USA) g di bawah tekanan
berkurang. filtrat disimpan dalam wadah kaca bersih dengan stopper pada suhu kamar.
Sebuah jumlah yang diperlukan dari solusi di atas ditransfer ke wadah kaca yang lain,
 10 mM fosfat larutan buffer (pH 2,1) -10% asetonitril (100 mL): volume 20 mL
50 mM larutan buffer fosfat (pH 2,1) dan 10 mL asetonitril ditempatkan dalam silinder
lulus, dan volume larutan disesuaikan dengan air murni untuk 100 mL dan dicampur
dengan baik.
 Pretreatment dari cartridge Sep-Pak C18 b: 5 mL metanol, 3 mL dari 10 mM fosfat
penyangga (pH 2,1) -10% asetonitril dan 5 mL air murni secara berturut-turut melewati
cartridge Sep-Pak C18 (Waters, Milford, MA, USA) untuk mengaktifkan cartridge
sebelum digunakan. Untuk metode penanganan, lihat “Reagen dan persiapan mereka”,
dari GC dan GC / MS bagian analisis dari bab ini.

kondisi analisis
HPLC kolom; banyak metode analisis menggunakan fase terbalik C18 kolom dilaporkan;
contoh adalah: kolom cartridge Nova-Pak C18 dilengkapi dengan RCM × 10 bertekanan
modul; precolumn: Nova-Pak C18 Garda-pak Insert.
kondisi HPLC; Instrumen: a Hitachi 655 HPLC instrumen (Hitachi Ltd, Tokyo, Jepang)
yang dilengkapi monitor gelombang-variabel UV (Hitachi 655A); fase gerak: 5 mM-SDS
con- taining 100 mM buffer fosfat (pH 2.1) / asetonitril (76:24, v / v); flow rate: 1,2 mL /
menit; deteksi panjang gelombang: 220 nm.
 Racun dan berakibat fatal konsentrasi203
Prosedur
Sebuah modifikasi dari metode yang dikembangkan oleh Svensson et al. [11] ditampilkan di
bawah.
i. Sebuah volume 5 mL 0,5 M larutan amonium sulfat (pH 9,4) ditambahkan ke 2 plasma
darah mL atau 4 mL urin 2 kali lipat diencerkan. Bila diperlukan, larutan campuran
dilewatkan melalui filter (Selulosa Asetat 0,45 µm, Advantec, Tokyo, Jepang). laki-laki
A urin kosong speci- diperoleh dari subjek yang sehat dan spesimen urin dibubuhi 0,1
mL masing-masing larutan standar (2, 6 dan 20 µg / mL) juga ditangani dengan cara
yang sama seperti di atas.
ii. Setiap solusi di atas dilewatkan melalui dipretreatment Sep-Pak C18 cartridge.
iii. cartridge dicuci dengan 20 mL 5 mM larutan amonium sulfat (pH 9.4) dan
0,5 mL air murni.
iv. senyawa opiat (bentuk bebas dan terkonjugasi) terjebak dalam cartridge dielusi dengan
1,2 mL methanol.
v. eluat yang diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen dengan pemanasan pada
suhu 40 ° C. Residu dilarutkan dalam 200 µL dari fase gerak HPLC; alikuot 20- µL itu
disuntikkan ke dalam HPLC.

Penilaian dan beberapa komentar pada metode

Analisis kualitatif dilakukan oleh perbandingan waktu retensi dari puncak spesimen dengan
yang standar otentik dan juga oleh konfirmasi tidak adanya puncak seperti di
spesimen kosong. Sebuah kromatogram HPLC untuk senyawa otentik ditunjukkan pada>
gambar. 3.4. Untuk kuantisasi, daerah puncak atau tinggi dari senyawa uji dalam spesimen
diterapkan ke mantan kurva kalibrasi ternal untuk menghitung konsentrasi. Penggunaan IS
adalah lebih baik untuk membuat tuduhannya tingkat kuantisasi, tetapi penulis belum
mempelajari di atasnya. Ethylmorphine mungkin dapat digunakan sebagai IS seperti dalam
kasus analisis GC / MS. Dengan detektor UV, linearitas yang baik morfin dapat dikonfirmasi
dalam berbagai tidak lebih rendah dari 20 ng / mL; batas deteksi dilaporkan menjadi 5 ng / mL
[11]. Dengan detektor elektrokimia, analisis opiat dilaporkan dapat dicapai dengan sensitivitas
yang lebih tinggi (batas deteksi kurang dari 1 ng / mL) [12]. Namun, karena deteksi trochemical
elektroforesis didasarkan pada potensi oksidoreduktif dari kelompok hidroksil dari bagian
fenol, tidak cocok untuk analisis codeine atau M-3-G. Untuk memperingatkan dan nilai-nilai
cutoff pada deteksi tingkat jejak morfin,
Dengan LC / MS, morfin dan 6-asetilmorfin memberi puncak dasar [M + H] + ion; M-3-
G dan M-6-G juga memberikan [M + H] + ion (ion dengan fragmen besar karena
pengurangan asam glukuronat dari molekul) [13, 14]. The quantitativeness dalam modus
SIM dikonfirmasi; linearitas dapat diperoleh di berbagai lebih dari 30 ng / mL, dan batas
deteksi adalah 1-3 ng / mL [13].

konsentrasi beracun dan mematikan

Dosis morfin dan heroin yang fatal (dalam bentuk garam hidrogen klorida mereka, per os)
dilaporkan masing-masing 70–500 mg dan 10–600 mg [15], dengan variasi besar menurut
masing-masing individu. Sebagai salah satu alasan peningkatan dosis fatal, resistensi
terhadap opiat diperoleh dengan penggunaan berulangnya dapat disebutkan. Pada pasien
yang tergantung pada opiat kronis, beberapa gram opiat kadang-kadang tidak menyebabkan
kematian.
204Morphine dan analognya

⊡ Gambar 3.4

HPLC kromatogram (dideteksi pada 220 nm) dari morfin otentik dan senyawa terkait. A:
morfin-6-sulfat; B: normorphine-3-glukuronida; C: morfin-3-glukuronida; D: morphine- 6-
glukuronida; E: codeine glukuronida; F: morfin. Opiat dan bentuk mereka terkonjugasi,
10 mg masing-masing, dilarutkan dalam 4 mL dimurnikan solusi, dan dianalisis sesuai
prosedur dijelaskan di bagian 3-3).

Sebagai hasil dari analisis dari 203 kasus yang fatal dengan morfin dan heroin, tiga
parameter dilaporkan terkait dengan kematian tersebut; mereka adalah konsentrasi darah
morfin bebas (tidak lebih rendah dari 0,24 µg / mL), rasio bentuk bebas dengan total morfin
(bentuk gratis plus terkonjugasi) dalam darah (tidak lebih rendah dari 37%) dan konsentrasi
morfin total otak (tidak lebih rendah dari
0,08 µg / g dan / atau lebih tinggi dari konsentrasi bentuk bebas dalam darah) [16]. Dalam
kematian mendadak yang terjadi dalam 3 jam setelah asupan morfin, sebuah fenomena yang
rasio morfin bebas untuk jumlah total dalam darah tidak lebih rendah dari 44% dikatakan
khas diamati [16].

Catatan

a) Nalorphine pada konsentrasi yang sama dapat juga digunakan sebagai IS. Dalam
pengalaman penulis, itu kurang stabil dan solusinya harus disiapkan sebelum digunakan.
Jika morfin deuterium-berlabel tersedia untuk digunakan, itu adalah yang paling
diinginkan untuk analisis MS.
b) perangkat kaca dibuat tebal nyaman untuk membantu elusi kartrid ekstraksi yang com-
mercially tersedia (GL-SPE Vacuum Manifold, Ilmu GL, Tokyo, Jepang dan beberapa
ufacturers manusia-di USA); memungkinkan lampiran dari 12 peluru, dan simultan
wash- ing, elusi dan pengeringan kartrid dapat dibuat di bawah tekanan berkurang.
 Racun dan berakibat fatal konsentrasi205
c) Ketika spesimen adalah plasma darah (1,5 ml), volume yang sama dari 20% asam
trikloroasetat ditambahkan, dicampur dengan baik dan disentrifugasi pada 3.000 rpm
selama 5 menit; fraksi supernatan yang dihasilkan dikenakan untuk menjadi prosedur
yang sama seperti yang untuk urin [17, 18]. Sebuah jaringan organ padat (1 g)
dihomogenisasi dengan volume yang sama dari air murni; homogenat tersebut deprotei-
nized seperti dalam kasus plasma darah di atas dan diproses dengan cara yang sama [18].
Metabolit utama M-3-G tidak mudah dihidrolisis; itu membutuhkan pemanasan pada 100
° C selama 30 menit di hadapan 15% asam klorida. Morfin bebas relatif tidak stabil dan
tive sensi- untuk dekomposisi oksidatif. Untuk melindungi morfin bebas dari
dekomposisi, 0,1 mL 40% natrium hydrosulfite dapat ditambahkan pada hidrolisis [17,
18].
d) Karena dalam langkah derivatisasi berikutnya reaksi dibuat dalam volume yang lebih
kecil, filtrat fase organik dikumpulkan dalam tabung centrifuge Volume kaca 10-mL
dengan tanah-in stopper. Dalam hal ini, langkah filtrasi dibagi menjadi beberapa kali;
sekitar 5 ml filtrat pertama di 10-mL tabung volume yang centrifuge dikenakan
penguapan untuk mengurangi volumenya, diikuti dengan penambahan filtrat berikutnya.
Prosedur ini diulang beberapa kali. Setelah filtrasi diulang, tidak perlu untuk mengubah
kertas filter.
e) Setiap BSA reagen komersial yang tersedia dapat digunakan. N, O-Bis (trimethylsilyl)
trifluoroacet amida (BSTFA) / trimetilklorosilan (TMCS) (99: 1) dapat juga digunakan,
tetapi tidak ada perbedaan dalam reaktivitas dari penggunaan BSA dapat ditemukan.
Trifluoroacetic anhydride atau anhidrida propionat dapat digunakan untuk asilasi dari
opiat. Namun, reaksi pengasilasi kadang-kadang memberikan campuran monoacyl dan
diasil derivatif.
f) Sejak codeine mengandung gugus hidroksil alkohol dalam 3-posisi dan dengan demikian
bukan merupakan dasar fenolik, itu diekstrak dari larutan basa kuat. Memanfaatkan
properti ini, adalah mungkin untuk menghapus codeine dari ekstrak [17, 19].
Konkretnya, ekstrak pelarut organik, mengandung opiat seperti morfin dan kodein,
adalah back-diekstraksi dengan 1 M HCl solu- tion; setelah pH fasa air dibawa ke 12,
fase diekstraksi dengan bentuk kloro-, menghasilkan ekstraksi kodein saja.
g) filtrat dapat dikumpulkan dalam labu Erlenmeyer atau botol galon daur ulang
dibersihkan. Ketika labu Erlenmeyer digunakan, diameter mulut labu tidak harus dekat
dengan yang Millicup-HV, karena ada kemungkinan kehancuran gelas karena
diketengahkan berkurang tekanan.

Referensi

1) Fujimoto JM, Way EL (1957) Isolasi dan kristalisasi “darah” morfin dari urin pecandu manusia. J
Pharmacol Exp Ther 121: 340-346
2) Yoshimura H, Tsukamoto H, Oguri K (1969) Metabolisme obat-LXII. Isolasi dan identifikasi
morfinglucuronides dalam urin dan empedu kelinci. Biochem Pharmacol 18: 279-286
3) Yoshimura H, Mori M, Oguri K et al. (1970) Metabolisme obat-LXV. Studi pada tabolites saya-
terkonjugasi kemih kodein. Biochem Pharmacol 19: 2353-2360
4) Cone EJ, Welch P, Mitchell JM et al. (1991) pengujian obat forensik untuk opiat: I. Deteksi 6-acetylmorphine
diurine sebagai indikator paparan heroin baru-baru ini, pertimbangan obat dan uji dan waktu deteksi. J
Anal Toxicol 15: 1-7
5) Ohshita T (1993) Penentuan diacetylmorphine dalam urin manusia menggunakan kromatografi gas kapiler /
massa spektrometri. Eisei Kagaku 39: 431-436 (dalam bahasa Jepang dengan abstrak bahasa Inggris)
6) Fehn J, Megges G (1985) Deteksi O6-monoacetylmorphine dalam sampel urin dengan GC / MS
sebagai bukti penggunaan heroin. J Anal Toxicol 9: 134-138
7) Stefano GB, Goumon Y, Casares F et al. (2000) morfin endogen. Tren Neurosci 23: 436-442
206Morphine dan analognya

8) Matsubara K, Fukushima S, Akane A et al. (1992) Peningkatan morfin kemih, kodein dan garis
tetrahydropapavero- pada pasien menjalani terapi L-3,4-dihydroxyphenylalanine Parkinsonian: a path-
biosintesis mungkincara morfin dari L-3,4-dihydroxyphenylalanine pada manusia. J Pharmacol Exp
Ther 260: 974-978
9) ElSohly HN, ElSohly MA, Stanford DF (1990) menelan biji Poppy dan opiat urinalisis: melihat lebih dekat. J
AnalToxicol 14: 308-310
10) Hasegawa M, Maseda C, Kagawa M et al. (1992) Morfin dan kodein yang terkandung dalam biji poppy
dan makanan biji mengandung poppy. Eisei Kagaku 38: 192-195 (dalam bahasa Jepang dengan
abstrak bahasa Inggris)
11) Svensson JO, Rane A, Sawe J et al. (1982) Penentuan morfin, morfin-3-glukuronida dan (tenta-tively)
morfin-6-glukuronida dalam plasma dan urin menggunakan ion-pair kinerja tinggi kromatografi cair. J
Chromatogr 230: 427-432
12) Mason JL, Ashmore SP, Aitkenhead AR (1991) Metode sederhana untuk penentuan morfin dan yang aktif
glucuronide metabolit dalam plasma manusia dengan kinerja tinggi kromatografi cair dengan deteksi
elektrokimia. J Chromatogr 570: 191-197
13) Nishikawa M, Nakajima K, Igarashi K et al. (1992) Analisis morfin-3-glukuronida dalam urin oleh LC / APCI-
MS.Eisei Kagaku 38: 121-126 (dalam bahasa Jepang dengan abstrak bahasa Inggris)
14) Tatsuno M, Nishikawa M, Katagi M et al. (1996) penentuan simultan dari obat-obatan terlarang dalam
urin manusia dengan spektrometri massa kromatografi cair. J Anal Toxicol 20: 281-286
15) Nagano T, Wakasugi C (eds) (1995) Obat Modern Hukum, 3 edisi. Kanehara-Shuppan, Tokyo, pp 181-
183(Dalam bahasa Jepang)
16) Spiehler VR (1998) interpretasi dibantu komputer dalam toksikologi forensik: kematian morfin-terlibat. J
FOrensic Sci 34: 1104-1115
17) Yoshimura H (ed) (1991) Kimia Forensik, 2 edisi. Nanzando, Tokyo, pp 155-159 (dalam bahasa
Jepang)
18) Spiehler V, Brown R (1987) morfin Uncojugated dalam darah dengan spektrometri radioimmunoassay
dan gas kromatografi / massa. J Forensik Sci 32: 906-916
19) Lembaga Farmasi Jepang (ed) (1992) Standar Metode Analisis Kimia di Keracunan - Dengan Commentary
-, edisi ke-4. Nanzando, Tokyo, pp 230-234 (dalam bahasa Jepang)