Prinsip

Sistem Sequencing Generasi Selanjutnya telah diperkenalkan dalam dekade terakhir yang
memungkinkan untuk reaksi sekuensing paralel masif. Sistem ini mampu menganalisis jutaan atau
bahkan miliaran reaksi berurutan pada saat yang sama. Meskipun mesin yang berbeda telah
dikembangkan dengan berbagai rincian teknis yang berbeda, mereka semua berbagi beberapa fitur
umum yang diuraikan di bawah ini (Gambar 2):

1. Persiapan Sampel:

Semua platform Sequencing Generasi Selanjutnya membutuhkan pustaka yang diperoleh baik dengan
amplifikasi atau ligasi dengan urutan adaptor khusus. Urutan adaptor ini memungkinkan hibridisasi
perpustakaan ke chip pengurutan dan menyediakan situs priming universal untuk mengurutkan primer.
pelajari lebih lanjut tentang persiapan sampel dari Sequencing Generasi Selanjutnya - basis pengetahuan
Desain Eksperimental.

2. mesin Sequencing:

Setiap fragmen perpustakaan diamplifikasi pada permukaan padat (baik manik-manik atau permukaan
silikon yang diturunkan datar) dengan pengikat DNA yang terpasang secara kovalen yang membuat
hibridisasi adaptor perpustakaan. Amplifikasi ini menciptakan kumpulan DNA, masing-masing berasal
dari satu fragmen perpustakaan; setiap kluster akan bertindak sebagai reaksi sekuensing individu.

Urutan setiap kluster dibaca secara optik (baik melalui generasi cahaya atau sinyal fluoresen) dari siklus
berulang penggabungan nukleotida. Setiap mesin memiliki kondisi bersepeda yang unik; misalnya,
sistem Illumina menggunakan siklus berulang penggabungan nukleotida fluorescent dan terminasi yang
diikuti dengan perolehan sinyal dan penghilangan kelompok fluoresen dan terminator.

3. Output data:

Setiap mesin menyediakan data mentah pada akhir proses sequencing. Data mentah ini adalah
kumpulan sekuens DNA yang dihasilkan pada setiap cluster. Data ini dapat dianalisis lebih lanjut untuk
memberikan hasil yang lebih bermakna.
Perbedaan antara Teknologi NGS yang berbeda (6) (7) (8) (9)

Perbedaan antara platform Next Generation Sequencing berbeda terutama terletak pada detail teknis
dari reaksi sequencing. Di bawah ini kami jelaskan perbedaan teknis ini secara singkat. Untuk penjelasan
lengkap, silakan kunjungi halaman web produsen di tautan yang disediakan di setiap bagian.

Pyrosequencing

Dalam pyrosequencing, reaksi sekuensing dimonitor melalui pelepasan pirofosfat selama penggabungan
nukleotida. Nukleotida tunggal ditambahkan ke chip sequencing yang akan mengarah pada
penggabungannya dengan cara yang bergantung pada template. Penggabungan ini akan menghasilkan
pelepasan pirofosfat yang digunakan dalam serangkaian reaksi kimia yang menghasilkan pembentukan
cahaya. Emisi cahaya dideteksi oleh kamera yang merekam urutan cluster yang sesuai. Setiap basa yang
tidak berhubungan terdegradasi oleh apyrase sebelum penambahan nukleotida berikutnya. Siklus ini
berlanjut hingga reaksi sekuensing selesai (Tabel 1).

Table 1 — Technical details for all available pyrosequencing based NGS machines.

GS FLX+ System
  GS Junior GS Junior Plus
GS FLX Titanium XL+ GS FLX Titanium XLR70

700bp 450bp
Read Length 400bp 700bp
(up to 1,000bp) (up to 600bp)

Throughput 35Mb 70Mb 700Mb 450Mb

100,000 Shotgun, 100,000 shotgun, 1,000,000 shotgun,

Reads per Run 1,000,000 shotgun
70,000 amplicon 70,000 amplicon 700,000 amplicon

Accurarcy 99% at 400bp 99% at 700bp 99.997% 99.995%

Run Time 10 hr 18 hr 23 hr 10 hr

Kekurangan:

Biaya reagen tinggi, dan tingkat kesalahan tinggi pada string 6 atau lebih basa nukleotida tunggal.

Sequencing oleh Sintesis

Sekuensing dengan sintesis menggunakan penggabungan langkah demi langkah nukleotida fluoresen
dan terminasi reversibel untuk sekuensing DNA dan digunakan oleh platform Num Illumina. Nukleotida
yang digunakan dalam metode ini telah dimodifikasi dengan dua cara: 1) setiap nukleotida secara
reversibel melekat pada molekul fluoresen tunggal dengan panjang gelombang emisi yang unik, dan 2)
masing-masing nukleotida juga diakhiri secara terbalik memastikan bahwa hanya satu nukleotida
tunggal yang akan dimasukkan per siklus . Keempat nukleotida ditambahkan ke chip pengurutan dan
setelah penggabungan nukleotida, basis DNA yang tersisa dihanyutkan. Sinyal fluoresens dibaca di setiap
cluster dan direkam; baik molekul fluoresens maupun kelompok terminator kemudian dibelah dan
dihanyutkan. Proses ini diulangi sampai reaksi sekuensing selesai. Sistem ini mampu mengatasi kerugian
dari sistem pyrosequencing dengan hanya memasukkan nukleotida tunggal pada suatu waktu (Tabel 2).

Table 2 — Technical details for all available sequencing by synthesis based NGS machines.

HiSeq
  MiSeq NextSeq 500 HiSeq 2500 HiSeq 4000
3000

Mid- High- High-

Run Mode N/A Rapid Run N/A N/A
Output Output Output

Flow Cells Per Run 1 1 1 1 or 2 1 or 2 1 1 or 2

10-300 50-1000 125-750 125-1500

Output Range 0.3-15 Gb 20-39 Gb 30-120 Gb
Gb Gb Gb Gb

<1-3.5
Run Time 5-55 hrs 15-26 hrs 12-30 hrs 7-60 hrs <1-6 days <1-3.5 days
days

130 300
Reads per Flow Cell 25million 400 million 2 billion 2.5 billion 2.5 billion
million million

Maximum Read
Length

Kekurangan:

Saat reaksi berurutan berlangsung, tingkat kesalahan mesin juga meningkat. Hal ini disebabkan oleh
penghapusan sinyal fluoresens yang tidak lengkap yang mengarah ke tingkat kebisingan latar belakang
yang lebih tinggi.

Sequencing oleh Ligation

Sekuensing dengan ligasi berbeda dari dua metode lainnya karena tidak menggunakan DNA polimerase
untuk menggabungkan nukleotida. Sebaliknya, ia bergantung pada probe oligonukleotida pendek yang
diikat satu sama lain. Oligonukleotida ini terdiri dari 8 basa (dari 3'-5 '): dua basa spesifik probe (ada
total 16 probe 8-mer yang semuanya berbeda pada dua posisi dasar ini) dan enam basis berdegenerasi;
satu dari empat pewarna fluoresen melekat di ujung probe 5. Reaksi urutan dimulai dengan mengikat
primer ke urutan adaptor dan kemudian hibridisasi probe yang sesuai. Hibridisasi probe ini dipandu oleh
dua basis spesifik probe dan setelah anil, diikat ke sekuens primer melalui ligase DNA. Oligonukleotida
yang tidak terikat dihanyutkan, sinyalnya terdeteksi dan dicatat, sinyalnya fluoresen terpecah (3 basa
terakhir), dan kemudian siklus berikutnya dimulai. Setelah sekitar 7 siklus ligasi, untai DNA didenaturasi
dan primer sekuensing lain, diimbangi oleh satu basis dari primer sebelumnya, digunakan untuk
mengulangi langkah-langkah ini - total 5 primer sekuensing digunakan (Tabel 3).

Table 3 — Technical details for all available sequencing by ligation based NGS machines:

Genetic Analyzer V2.0

5500W System 5500xl W System

Instrument Throughput

1 x 50 80 Gb 160 Gb

1 x 75 120 Gb 240 Gb

2 x 50 MP 160 Gb 320 Gb

50 x 50 PE 160 Gb 320 Gb

Accuracy 99.99% 99.99%

Run Time 7 days 7 days

Kekurangan:

Metode ini mengarah ke membaca sekuensing yang sangat singkat.

Sequencing Semikonduktor Ion

Sekuensing semikonduktor ion memanfaatkan pelepasan ion hidrogen selama reaksi sekuensing untuk
mendeteksi urutan gugus. Setiap kluster terletak tepat di atas transistor semikonduktor yang mampu
mendeteksi perubahan pH larutan. Selama penggabungan nukleotida, satu H + dilepaskan ke dalam
larutan dan dideteksi oleh semikonduktor. Reaksi sekuensing itu sendiri berlangsung mirip dengan
pyrosequencinging tetapi dengan sebagian kecil dari biaya (Tabel 4).

Table 4 — Technical details for all available ion semiconductor sequencing based NGS machines:

Ion Proton System

Output up to 10 Gb

Reads 60-80 million Reads

Read Length up to 200bp

Run time 2-4 hrs

Kekurangan:

Tingkat kesalahan yang tinggi pada rentang homopolimer nukleotida.

Ketentuan yang Berguna

Next Generation Sequencing adalah bidang muda, dengan mesin pertama dipasarkan pada tahun 2005.
Namun, dalam waktu kurang dari satu dekade NGS telah menjadi landasan biologi molekuler dan
genetika. Karena itu, mengenal istilah-istilah teknisnya akan membantu dalam lebih memahami literatur
yang tersedia dan menjadi anggota komunitas yang terus berkembang. Di bagian ini, istilah paling umum
yang digunakan dalam bidang ini dijelaskan:

Sequencing Generasi Selanjutnya:

Next Generation Sequencing, atau NGS, adalah metode sekuensing di mana jutaan reaksi sekuensing
dilakukan secara paralel, meningkatkan throughput sekuensing.

Membaca:

Output dari reaksi sekuensing NGS. Bacaan adalah serangkaian nukleotida tunggal tanpa gangguan yang
mewakili urutan templat.
Baca Panjang: Panjang setiap membaca urutan. Variabel ini selalu direpresentasikan sebagai panjang
pembacaan rata-rata karena masing-masing pembacaan memiliki panjang yang bervariasi.

Cakupan:

Jumlah berapa kali nukleotida tertentu diurutkan. Karena reaksi sekuensing-kesalahan siap, kesalahan
acak dapat terjadi. Oleh karena itu, cakupan 30x biasanya diperlukan untuk memastikan setiap urutan
nukleotida akurat.

Sequencing dalam:

Mengurutkan dimana cakupan lebih besar dari 30x. Ini digunakan dalam kasus-kasus di mana berurusan
dengan polimorfisme langka yang hanya sebagian dari sampel mengekspresikan mutasi. Metode ini
meningkatkan jangkauan, kompleksitas, sensitivitas, dan akurasi hasil.

Urutan Berpasangan-Akhir:

Mengurutkan dari kedua ujung fragmen sambil melacak data yang dipasangkan. Dengan metode ini,
reaksi sekuensing akan dimulai dari salah satu ujung fragmen. Setelah selesai, fragmen didenaturasi dan
primer sekuensing digabungkan ke adaptor sisi sebaliknya. Fragmen tersebut kemudian diurutkan lagi.
Menggunakan metode ini akan memungkinkan konfirmasi lebih lanjut dari keakuratan urutan atau itu
dapat digunakan untuk meningkatkan panjang baca keseluruhan.

Pasangan Berpasangan berbunyi:

Langkah persiapan sampel di mana fragmen DNA besar (~ 10 kb) diedarkan dengan urutan adaptor
diikuti oleh degradasi DNA melingkar. Metode ini menghubungkan fragmen DNA yang dipisahkan satu
sama lain dengan jarak tertentu dan digunakan dalam aplikasi seperti perakitan de novo, deteksi varian
struktural, dan identifikasi penyusunan ulang genom yang kompleks.

Adaptor:

Sekuens unik digunakan untuk menutup ujung DNA yang terfragmentasi. Fungsi adaptor adalah sebagai
berikut: 1) memungkinkan hibridisasi ke permukaan padat; 2) memberikan lokasi priming untuk primer
amplifikasi dan sequencing; dan 3) menyediakan barcode untuk multiplexing sampel yang berbeda
dalam proses yang sama.

Perpustakaan:
Kumpulan fragmen DNA dengan adaptor yang diikat ke masing-masing ujung. Persiapan perpustakaan
diperlukan sebelum menjalankan urutan. Basis pengetahuan kami selanjutnya akan mempelajari
berbagai metode persiapan sampel dan perpustakaan yang tersedia.

Penjajaran:

Memetakan urutan dibaca ke genom referensi yang dikenal

Rujukan urutan / genom:

Genom yang sepenuhnya diurutkan dan dipetakan digunakan untuk pemetaan urutan membaca.

Majelis De Novo:

Majelis urutan dibaca untuk menghasilkan urutan referensi.

Kekhususan:

Persentase urutan yang memetakan ke target yang dimaksudkan dari total basis per run.

Keseragaman:

Variabilitas dalam cakupan urutan di seluruh wilayah target. Ketika melakukan pengurutan seluruh
genom atau pengurutan exome, diharapkan hasilnya akan sangat seragam (karena harus ada rasio 1: 1
dalam bahan awal). Namun, sekuensing RNA tidak akan seragam karena perbedaan ekspresi mengubah
bahan awalnya.

Homopolimer:

Hamparan basa nukleotida tunggal, seperti AAAA atau GGGGGG.

Prinsip di balik Next Generation Sequencing (NGS) mirip dengan sekuensing Sanger, yang bergantung
pada elektroforesis kapiler. Untaian genomik terfragmentasi, dan pangkalan di masing-masing fragmen
diidentifikasi oleh sinyal yang dipancarkan ketika fragmen diikatkan pada untai templat.

Metode Sanger memerlukan langkah-langkah terpisah untuk sekuensing, pemisahan (dengan

elektroforesis) dan deteksi, yang membuatnya sulit untuk mengotomatisasi persiapan sampel dan
terbatas dalam throughput, skalabilitas dan resolusi. Metode NGS menggunakan sekuensing berbasis
array yang menggabungkan teknik yang dikembangkan dalam sekuensing Sanger untuk memproses
jutaan reaksi secara paralel, menghasilkan kecepatan dan throughput yang sangat tinggi dengan biaya
yang lebih rendah. Proyek sekuensing genom yang memakan waktu bertahun-tahun dengan metode
Sanger sekarang dapat diselesaikan dalam hitungan jam dengan NGS, meskipun dengan panjang baca
lebih pendek (jumlah pangkalan yang diurutkan pada satu waktu) dan kurang akurasi.

Metode sekuensing DNA generasi berikutnya memiliki tiga langkah umum:

Persiapan perpustakaan: perpustakaan dibuat menggunakan fragmentasi acak DNA, diikuti oleh ligasi
dengan penghubung khusus

Amplifikasi: perpustakaan diperkuat menggunakan metode amplifikasi klon dan PCR

Sequencing: DNA diurutkan menggunakan salah satu dari beberapa pendekatan yang berbeda
AMPLIFIKASI

Diperlukan amplifikasi perpustakaan sehingga sinyal yang diterima dari sequencer cukup kuat untuk
dideteksi secara akurat. Dengan amplifikasi enzimatik, fenomena seperti 'biasing' dan 'duplikasi' dapat
terjadi yang mengarah pada amplifikasi preferensial fragmen perpustakaan tertentu. Sebagai gantinya,
ada beberapa jenis proses amplifikasi yang menggunakan PCR untuk membuat cluster DNA dalam
jumlah besar.

Emulsi PCR

Minyak emulsi, manik-manik, campuran PCR dan DNA perpustakaan dicampur untuk membentuk emulsi
yang mengarah pada pembentukan sumur mikro (Gambar 2).