MATA KULIAH : BIOTEKNOLOGI DASAR

ISOLASI DNA PADA DARAH

DISUSUN OLEH:
KELOMPOK 4
RAHMI ELFIRA 4183220035
TERRY WILLIEM SIHALOHO 4183220040
LENTA BR MANIK 4183220042
FATHIMATUZZAHRO’A 4183520003
LESTARI LAURENCIA SIDABUTAR 4183520002
SALSHA ALZTARA 4183520007

KELAS : PSB A 2018

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNUVERSITAS NEGERI MEDAN
2020
 ISOLASI DNA
A. Pendahuluan
DNA atau deoxyribonucleid acid adalah material genetic yang tersusun atas tiga
komponen. Komponen-komponen tersebut adalah molekul gula pentose (deoxyribosa), gugus
phosphate, dan basa nitrogen. Pada organisme tingkat tinggi (manusia, hewan, dan tumbuhan)
DNA dapat kita temukan dalam inti sel (DNA inti), mitokondria (DNA mitokondria), dan di
dalam kloroplas (DNA kloroplas). DNA yang ditemukan di dalam inti disebut juga DNA
kromosomal sedangkan yang ditemukan di luar inti disebut DNA ekstrakromosomal.
Pada saat ini, DNA dapat disolasi untuk kemudian digunakan untuk proses lanjutan
(PCR, RFLP, dll). Proses isolasi DNA dilakukan melalui serangkaian proses penghancuran
dinding sel atau membrane sel, penghilangan protein dan RNA, dan pengendapan DNA serta
pemanenan. Prinsip dasar pada proses isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-
komponen sel lainnya. Hasil isolasi merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh
sebab itu dalam pelaksanaanya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi, dan
diusahakan didapatkan DNA dalam bentuk rantai panjang.
Proses pemisahan DNA dari tempatnya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan
buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Sedangkan untuk membantu
terjadinya lisis biasanya dilakukan inkubasi pada suhu sekitar 60 oC. Dalam proses ini juga
digunakan senyawa fenol, chloroform, dan isoamyl alcohol untuk memaksimalkan proses lisis.
Ketika DNA sudah didapatkan maka sebelum dilakukan proses lanjutan seperti PCR dan
elektroforesis maka perlu dilakukan pengukuran kuantitas DNA. Alat yang digunakan untuk
melakukan pengukuran tersebut adalah spektrofotometer. Prinsip kerja dari spektrofotometer
adalah iradiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan.
Penyerapan sinar tersebut oleh nukleotida secara maksimal dicapai pada gelombang 260 nm,
sedangkan penyerapan maksimal oleh protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm.
Kemurnian DNA ditentukan oleh tingkat kontaminasi protein dalam larutan. Kemurnian
larutan DNA dapat dilihat dengan membagi nilai OD 260 dengan OD280. Molekul DNA dikatakan
murni jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1.8-2.0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1.8
maka masih ada kontaminasi protein atau fenol di dalam larutan.
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui prinsip dalam isolasi DNA
2. Untuk mengetahui cara memisahkan atau mengisolasi DNA

C. Alat dan Bahan

● Alat
1. Vortex
2. Mikropipet 5-1000 uL
3. Tabung
4. KIT DNA
5. EDTA 30 mikron
● Bahan
1. Ethano 70%
2. Isopropanol
3. Buffer Lysis
4. DNA dehidrasi
5. Protein presipitasi
6. Nuckleid acid lysis
7. Darah

D. Prosedur Kerja
Tabel Protokol Kerja Isolasi DNA
No. Aktivitas Alat dan Bahan Kegunaan

1. Pengambilan sampel darah Torniquet berfungsi dalam penekanan dan

digunakan untuk mengontrol
● Pasang Torniquet pada pasien sirkulasi vena dan arteri pada
daerah pembedahan dalam
● Lakukan palpasi dan usap jangka waktu tertentu.
dengan alcohol swab agar Alcohol swab  merupakan salah satu alat
steril kesehatan berupa kapas atau tisu
alkohol antiseptik yang
● Tunggu sampai alcohol benar- digunakan untuk membersihkan
luka dan pembersih alat-alat
 benar kering medis. Selain itu, dapat juga
digunakan untuk antiseptik pre-
● Tusukkan jarum spuit kearah injeksi, pemasangan IV,
pembuluh darah pengambilan darah, melepas
jahitan, atau tindakan lainnya
● Tarik piston (ujung spuit) yang memerlukan antisepsi.
secara perlahan Jarum spuit Alat suntik atau spuit berfungsi
sebagai pompa piston sederhana
● Usap dengan kapas pada bekas untuk menyuntikkan atau
penusukan menghisap cairan atau gas

Tabung EDTA Mengaktivasi enzim nuklease

● Kemudian pindahkan darah ke
dengan mengikat ion magnesium
tabung EDTA
dan kalsium yang dibutuhkan
sebagai kofaktor enzim DNAse

2. Isolasi DNA Mikropipet mikropipet mempunyai fungsi

seperti pipet biasa, yaitu untuk
● Pipet 900 uL Buffer lysis lau memindahkan cairan atau
tambahkan 300 uL darah larutan. Hanya saja beda akurasi
antara mikropipet dengan pipet
EDTA
biasa
● Pasang tip biru pada Buffer Lysis Fungsi larutan buffer adalah
mikropipet untuk menjaga struktur DNA
selama proses lisis dan
● Pipet 900 uL Buffer lysis, pemurnian.
masukkan ke dalam tabung Darah EDTA Darah EDTA ini yang akan
eppendorf diisolasi DNA nya.

● Pipet 300 uL darah EDTA, Tabung FungsiTube Eppendorf adalah

sebagai tempat cairan/larutan
masukkan ke dalam tabung eppendorf yang akan dimasukkan ke dalam
eppendorf vortex

Inkubator Berfungsi sebagai mengontrol

● Inkubasi selama 10 menit
kondisi lingkungan seperti suhu
● Setiap 3 menit sekali tabung maupun kelembapan

dibolak-balik 2-3 kali Sentrifuge Untuk memutar sampel pada

kecepatan tinggi, memaksa
● Sentrifuge 13000-16000 xg partikel yang lebih berat
selama 20 detik terkumpul ke dasar
tabung centrifuge
● Tutup sentrifuge dengan rapat Vortex Fungsi utamanya adalah untuk
dan atur kecepatan dan menyeragamkan cairan dalam
waktunya. volume kecil

Nuckleid acid Untuk melisis sel darah putih

● Buang supernatant dan sisakan
lysis sampai terlihat mengental
peletnya (10-20 uL)
RNAse Fungsinya adalah
● Lalu vortex selama 10-15 Menyingkirkan kontaminasi
detik RNA

● Tambahkan nuckleid acid Protein presipitasi digunakan dalam pemrosesan

hilir produk biologi untuk
lysis 300 uL lalu jentik-jentik
memusatkan protein
5-6 kali dan memurnikannya dari
berbagai kontaminan
● Inkubasi selama 1 jam pada
suhu 37oC, setiap 15 menit
sekali dihomogenkan.

● Bila masi ada gumpalan

tambahkan RNAse 1,5 uL.
Inkubasi 2 menit suhu kamar.

● Tambahkan protein presipitasi

100 uL. Alu vortex selama 20
detik (sampai tidak ada
gumpalan)

● Sentrifuge 13000-16000 xg
selama 3 menit

● Pipet supernatant, masukkan

ke dalam tabung eppendorf
 1,5 mL

● Tambahkan isopropanol 500

uL

● Sentrifuge 13000-16000 xg
selama 1 menit

● Buang supernatant

● Lalu tambahkan 500 uL etanol

70%. Homogenkan, hindari
pelet masuk ke dalam pipet

● Balikkan tabung eppendorf

diatas tissue 15 menit. Pelet
dikeringkan di suhu ruang 10-
15 menit

● Tambahkan DNA dehidrasi

100 uL, lalu inkubasi pada
suhu ruang selama 1 jam

● Inkubasi semalaman pada

suhu 4oC. Simpan DNA pada
suhu 2-8 oC.

E. Kesimpulan
1. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa
genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA
dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian
ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA/RNA total.
Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari
jaringan.
2. Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan
membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama
yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap
selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel.Setelah
dilakukan inkubasi, sitoplasma sel yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu
disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya supernatan yang
terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut
bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini
bertujuan untuk mem-bersihkan nukleus sel dari zatzat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu
presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein, se-hingga untai-untai DNA tidak lagi
menggulung (coiling), yang menyebabkan DNA menjadi terlihat.