MODUL VI: VARIASI FENOTIP DAN GENOTIP MIKROBA

(13 Maret 2017)

PJ: Aji dan Joan
Ko-PJ: Astrid dan Aufa

I. TUJUAN
1. Mengetahui variasi fenotip mikroba pada berbagai suhu inkubasi
2. Mengetahui lama pendedahan mutagen fisik yang efektif menyebabkan perubahan
fenotip permanen pada mikroba
3. Mengetahui keberadaan mutan mikroba yang resisten terhadap antibiotik

II. TEORI DASAR

Beberapa protein dan molekul RNA dibutuhkan sel dalam jumlah yang sama dalam
keseluruhan masa pertumbuhan sel. Senyawa semacam ini dikenal sebagai senyawa
konstituitif. Walaupun demikian beberapa diantaranya hanya dibutuhkan dalam keadaan-
keadaan tertentu contohnya adalah laktase yang hanya dibutuhkan bakteri ketika laktosa
tersedia dalam medium. Dalam meregulasi ekspresi protein, sel melakukan dua macam
pendekatan, yaitu pendekatan aktivitas dan pendekatan jumlah. Dalam melakukan
pengendaliaan sintesis protein terdapat dua pendekatan utama, yaitu pendekatan regulator
positif dan regulator negatif. Regulator positif contohnya adalah aktivator. Protein
aktivator akan berikatan dengan activator-binding site pada DNA dan menstimulasi
ekspresi gen. Kontrol negatif dilakukan oleh repressor yang mencegah ekspresi dengan
menghambat pelekatan RNA polymerase pada DNA.
Variasi yang terjadi pada bakteri dapat bersifat sementara maupun permanen. Pada
umumnya variasi yang terjadi akibat faktor-faktor lingkungan dan tidak melibatkan
restrukturasi DNA bersifat sementara. Variasi ini dapat merubah karakteristik bakteri baik
secara morfologi maupun fisiolofi dan akan hilang segera setelah faktor lingkungan yang
memengaruhinya hilang. Sebagai contoh Escherichia coli pada fasa stasioner dalam
kultivasi batch akan berbentuk kokoid (coccoidal). Peristiwa semcam ini dikenal sebagai
involusi. Reinoklasi E. coli tersebut kedaam medium segar akan mengembalikan struktur
bentuk bakterinya menjadi batang.
 Variasi bakteri yang melibatkan alterasi pada DNA umumnya bersifat permanen.
Variasi ini umumya terjadi akibat adanya mutasi. Variasi semacam ini umumnya terjadi
secara spontan akibat kesalahan replikasi DNA atau karena pengaruh agen fisika atau
kimia. Sistem transfer DNA pada bebrerapa bakteri juga dapat berperan meliputi
konjugasi, transduksi, dan transformasi.

III. CARA KERJA

1. Variasi Fenotip
1. Lakukan inokulasi Serratia marcescens dengan metode four-way streak pada 1
plat NA dalam cawan Petri
2. Inkubasikan selama 24 jam
- Kelompok ganjil pada suhu 25oC
- Kelompok genap pada suhu 37oC
3. Catat warna koloni yang tumbuh
4. Pilih koloni tunggal dari masing-masing suhu inkubasi dan lakukan inokulasi
kembali pada 2 buah NA miring pada tabung reaksi
5. Kembali inkubasikan satu kultur pada suhu 25oC dan satu lagi pada 37oC
selama 24 jam
6. Amati warna koloni yang tumbuh
 2. Isolasi Mutan dan Ilustrasi Variasi Genetik
1. Buat serial dilution hingga 10-7 dari kultur cair Serratia marcescens
2. Lakukan inokulasi ke 1 buah cawan Petri dengan 0,1 ml kultur Serratia
marcescens dengan metode spread pada pengenceran 10-6 dan 10-7
3. Bagi menjadi 2 bagian (kontrol dan perlakuan)
4. Dedahkan setengah (bagian perlakuan) dari plat tersebut (cawan Petri dibuka
setengah) di bawah sinar UV selama waktu tertentu
Kelompok Pengenceran Lama pendedahan
1-2 10-6 sel/mL 0 menit
3-4 10-7 sel/mL
5-6 10-6 sel/mL 1 menit
-7
7-8 10 sel/mL
9-10 10-6 sel/mL 2,5 menit
11-12 10-7 sel/mL
13-14 10-6 sel/mL 5 menit
15-16 10-7 sel/mL
5. Inkubasikan semua plat pada 25oC selama 24 jam
6. Pilih koloni yang tidak berwarna merah
7. Transfer koloni tersebut ke 1 buah NA miring dalam tabung reaksi
8. Inkubasikan pada suhu 25oC selama 24 jam
9. Amati hasilnya

3. Seleksi Mutan Bakteri Resisten Antibiotik

1. Tuangkan medium NA yang masih cair pada tabung reaksi kedalam cawan petri steril
dalam posisi dimiringkan
2. Biarkan sampai beku
3. Beri tanda positif (+) pada bagian yang tipis dan negatif (-) pada bagian yang tebal
4. Teteskan 0,1 mL streptomycin 0,1 mg/ml ke dalam NA yang masih cair pada tabung
reaksi lain
5. Tuangkan agar tersebut ke atas NA miring yang sudah beku dalam cawan petri pada
posisi datar
 6. Tunggu sampai beku
7. Inokulasikan 0,1 ml kultur cair Staphylococcus aureus umur 24 jam dengan metode
spread
8. Inkubasikan pada suhu 37oC selama 48 jam
9. Amati hasilnya

Pembuatan mutan dan kontrol

1. Cawan petri yang mengandung streptomisin (bukan gradient plat) dibagi menjadi dua
bagian, yaitu bagian mutan dan kontrol.
2. Inokulasikan koloni yang tumbuh pada daerah tanda positif (+) dari gradient agar ke
bagian mutan pada cawan petri dengan metode gesek.
3. Inokulasikan kultur Staphylococcus aureus murni pada bagian kontrol pada cawan
Petri yang sama dengan metode gesek
4. Inkubasikan kembali pada suhu 37oC dan 24 jam
5. Amati pertumbuhan Staphylococcus aureus

IV. LITERATUR
1. Dogma sentral biologi molekuler (replikasi, transkripsi, dan translasi)
2. Pengertian mutasi, jenis, serta penyebabnya
3. Pengaruh suhu terhadap ekspresi gen bakteri dan contohnya
4. Prinsip mutagenesis dari sinar UV
5. Prinsip kerja streptomisin menghambat pertumbuhan bakteri
6. Lima mekanisme resistensi bakteri beserta contoh bakteri dan antibiotiknya dari
masing-masing mekanisme
V. HASIL PENGAMATAN
1. Hasil pengamatan variasi fenotip Serratia marcescens (data kompil 1 dan 2, 3 dan
4, dst.)
a. Variasi fenotip Serratia marcescens
Tanggal inokulasi:
Tanggal pengamatan:
Media:
Suhu inkubasi awal Keterangan
25oC
37oC
*tabel diisi dengan warna koloni (merah/merah-putih/putih)
b. Subkultur variasi fenotip Serratia marcescens
Tanggal inokulasi:
Tanggal pengamatan:
Media:
Suhu inkubasi awal Suhu inkubasi subkultur Keterangan

o
25oC
25 C
37oC

o
25oC
37 C
37oC
*tabel diisi dengan warna koloni (merah/merah-putih/putih)
 2. Hasil pengamatan isolasi mutan dan ilustrasi variasi genetik Serratia
marcescens (data kompil semua kelompok)
a. Isolasi variasi genetik S. marcescens
Tanggal inokulasi:
Tanggal pengamatan:
Media:
Keterangan*
Pengenceran Kultur Lama pendedahan sinar UV (menit)
Ganjil Genap
0
1
10-6
2,5
5
0
1
10-7
2.5
5
*) diisi dengan positif (+) jika terdapat koloni berwarna putih; negatif (-)
jika terdapat koloni berwarna selain putih pada bagian cawan petri yang
didedahkan; dan (±) bila ada keduanya. Perlakuan yang tidak dikerjakan diblok
dengan warna abu-abu, perlakuan yang dikerjakan kelompok diblok dengan
warna kuning (stabilo)
b. Subkultur mutan Serratia marcescens
Tanggal inokulasi:
Tanggal pengamatan:
Media:
Kelompok I II dst.
Warna koloni
3. Hasil pengamatan seleksi mutan bakteri resisten antibiotik (data kelompok masing-
masing)
Tanggal inokulasi:
Tanngal pengamatan:
Media:
Bagian Cawan Petri Keterangan*
+
-
*diisi dengan (+) apabila ada koloni yang tumbuh dan (-) bila tidak ada

Kultur Keterangan*
S. aureus bagian +
S. aureus kontrol
*diisi dengan (+) apabila ada koloni yang tumbuh dan (-) bila tidak ada
Jangan lupa menyertakan gambar pengamatan kelompok masing-masing di bawah setiap
tabel dengan format yang sama dengan praktikum sebelumnya. Jangan lupa memberi
inset dan ditandai

VI. MSDS
1. Sifat fisika dan kimia, potensi bahaya, handling, penanganan apabila terjadi
kecelakaan dari streptomisin
2. Patogenitas / toksisitas dan kontrol pemaparan bakteri S. aureus Pathogen Safety
Data Sheets

JANGAN LUPA barang yang harus dibawa tiap kelompok:

 1 buah Bunsen  Korek
 1 buah Batang L  1 buah kawat ose
 Tisu  1 buah botol selai
PENGAMATAN I (Selasa, 14 Maret 2017)
- Variasi fenotip: pengamatan warna koloni hasil four way streak cawan petri, subkultur ke 2
NA miring yang diinkubasi pada suhu 25oC dan 37oC
- Variasi genotip: pengamatan warna koloni hasil spread cawan petri, subkultur ke 1 NA
miring yang diinkubasi pada suhu 25oC

PENGAMATAN II (Rabu, 15 Maret 2017)

- Variasi fenotip: pengamatan warna koloni hasil subkultur 2 NA miring yang diinkubasi
pada suhu 25oC dan 37oC
- Variasi genotip: pengamatan warna koloni hasil subkultur 1 NA miring yang diinkubasi
pada suhu 25oC
- Mutan resisten streptomisin: pengamatan daerah yang ditumbuhi koloni pada gradient
agar, pembuatan kontrol pada cawan Petri yang berisi NA+streptomisin

PENGAMATAN III (Kamis, 16 Maret 2017)

Mutan resisten streptomisin: pengamatan kontrol pada cawan Petri yang berisi NA+streptomisin