MODUL IX

AKTIVITAS BAKTERI NITROGEN

SENIN, 3 APRIL 2017
PJ dan Ko-PJ : Ira & Upi

I. Tujuan
1. Melakukan prosedur pengujian aktivitas mikroba dalam proses pengubahan senyawa nitrogen
organik menjadi ammonia (amonifikasi).
2. Melakukan prosedur pengujian aktivitas mikroba dalam biokonversi amonia menjadi nitrit dan
dari nitrit menjadi nitrat (nitrifikasi).
3. Melakukan prosedur pengujian aktivitas bakteri dalam proses denitrifikasi.
4. Melakukan prosedur pengujian aktivitas bakteri fiksasi nitrogen (N2) dari udara oleh bakteri
pemfiksasi nitrogen non-simbiotik.

II. Latar Belakang

Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme yang berperan sangat penting dalam
kesuburan tanah, walaupun bentuknya yang sangat kecil bahkan tidak kasat mata namun
memberikan peranan dan pengaruh besar dalam kesuburan tanah. Di dalam tanah terdapat
berbagai jenis bakteri seperti Azotobacter, Asetobacter, Clostridium, Bacilus, Arthrobacter dan lain-
lain. Masing-masing bakteri tersebut memilki fungsi dan peranan yang berbeda-beda di dalam tanah.
Misalnya dari genus bakteri Clostridium yaitu Clostridium pasteurianum yang memiliki peranan
dalam penambatan nitrogen. Hal ini penting karena nitrogen bebas di udara tidak dapat digunakan
secara langsung oleh tanaman melainkan harus diubah menjadi senyawa lain yaitu ion amonium
(NH4+ ) dan ion nitrat (NO3 - ). Nitrogen adalah unsur yang paling penting dalam pembentukan asam
amino, protein dan asam nukleat pada makhluk hidup.
Dalam siklus nitrogen, terdapat beberapa proses yang melibatkan peran mikroba
dalam keberjalanannya (Gambar 1). Amonifikasi adalah proses pembentukan amonium oleh bakteri
yang hidup di dalam tanah. Selain dari hasil fiksasi nitrogen, amonium juga dapat terbentuk dari
dekomposisi (penguraian) organisme yang sudah mati baik tumbuhan ataupun hewan oleh bakteri.
Selain dekomposisi sampah organik, amonifikasi juga dapat terjadi akibat aktivitas bakteri yang
merubah senyawa nitrat menjadi amonium .

Gambar 1. Proses – Proses dalam Siklus Nitrogen (Bisen et al., 2012)

 Nitrifikasi adalah proses pengubahan amonium menjadi nitrat oleh aktivitas enzim
nitrogenase yang di miliki oleh bakteri nitrifikasi. Proses nitrifikasi berlangsung melalui dua tahap,
yaitu nitritasi dan nitratasi. Nitritasi adalah proses pengubahan amonium menjadi nitrit oleh bakteri
nitritasi seperti Nitrosomonas. Sedangkan nitratasi adalah proses pengubahan nitrit menjadi nitrat
oleh bakteri nitratasi seperti Nitrobacter.
Denitrifikasi adalah proses transformasi ion nitrat (atau nitrit) menjadi bentuk gas
nitrogen. Keterbatasan gas oksigen mendorong proses respirasi yang menggunakan ion nitrat
atau nitrit sebagai reseptor elektron pengganti oksigen, sehingga terbentuk gas nitrogen yang
dilepas ke atmosfer. Proses ini sering terjadi pada hutan rawa dengan kondisi tanah yang
tergenang. Bakteri denitrifikasi yang umum dijumpai berasal dari kelompok Pseudomonas.
Genus Clostridium diketahui melakukan proses denitrifikasi dan menghasilkan karbon dioksida
dan gas nitrogen selama melakukan dekomposisi bahan organik. Pada kondisi dan skala tertentu, hal
ini dapat berbahaya karena akan terus mengurangi jumlah ion nitrat yang dapat diserap oleh
tanaman.
Fiksasi nitrogen adalah proses pengikatan gas nitrogen (N2) dari lingkungan yang kemudian
dikonversi menjadi ammonia. Bakteri yang dapat melakukan fiksasi nitrogen disebut bakteri
diazotrof. Secara umum terdapat dua kelompok bakteri diazotrof. Bakteri diazotrof simbiotik adalah
bakteri pemfiksasi nitrogen yang berasosiasi dengan tanaman, seperti jenis Rhizobium yang
membentuk nodul akar pada tanaman Leguminosae. Sementara itu, bakteri diazoktrof non-simbotik
(free-living bacteria) adalah bakteri pemfiksasi nitrogen yang hidup bebas di tanah tanpa
berasosiasi langsung dengan tanaman, seperti kelompok Azotobacter, Clostridium, Beijerinckia
dan Cyanobacteria.

III. Alat dan Bahan

Alat Bahan
1. Plat Tetes 1. Kaldu Pepton 4%
2. Tabung reaksi 2. Kultur Bacillus cereus
3. Labu Erlenmeyer 3. Kultur Proteus vulgaris
4. Kaca Objek
4. Kultur Pseudomonas aeruginosa
5. Kaca Penutup
6. Mikroskop Cahaya 5. Sampel Tanah Subur dan Tandus (kedalaman
7. Timbangan Analitik 5cm/dekat perakaran dan permukaan)
8. Oose 6. Reagen Nessler
9. Tabung Durham 7. Reagen Trommsdorff
10. Shaker 8. Reagen Difenilamin
11. Cawan Petri 9. Asam Sulfat Encer
12. Falcon
10. Kaldu Ammonium Sulfat
11. Kaldu Nitrit
12. Kaldu Nitrat
13. Kaldu Mannitol N-free
14. Plat Mannitol N-free
15. Larutan Metilen Biru
16. Safranin
IV. Langkah Kerja
A. Uji Kualitatif Aktivitas Bakteri Amonifikasi

Dua erlenmeyer berisi 10 ml kaldu pepton 4%

- diinokulasikan bakteri Bacillus cereus (Kel. 1-3), Proteus Vulgaris (Kel. 4-6), dan Pseudomonas
aeruginosa (Kel. 7-9) kedalam masing-masing satu tabung reaksi sebagai kontrol positif (kontrol
negatif ada di asisten)
- diinokulasikan 0,1 gram tanah subur(Kel.Genap) atau tanah tandus(Kel. Ganjil) ke dalam masing-
masing satu tabung reaksi dan tutup dengan kapas lemak
- diinkubasikan tabung reaksi selama 7 hari dalam temperatur ruang dengan shaker
- dilakukan uji kandungan pada hari ke-2, 5, dan 7 dengan prosedur:
a. Teteskan reagen Nessler pada 5 lubang plat tetes
b. Ambil satu oose kultur dari masing-masing tabung dan baurkan pada reagen hingga
terjadi perubahan warna
c. Tentukan penilaian kandungan ammonium sesuai tabel dibawah
- diamati perbedaan hasil penilaian pada masing-masing tabung reaksi.

Hasil Pengamatan

Warna Nilai Penilaian

Tidak ada perubahan 0 Tidak ada kandungan ammonium
Kuning muda 1 Sedikit
Kuning tua 2 Sedang
Coklat 3 Banyak

B. Uji Kualitatif Aktivitas Bakteri Nitrifikasi

Nitrifikasi Tahap I

Satu labu Erlenmeyer isi 100 ml larutan ammonium sulfat

- dimasukkan 1 gram sampel tanah subur atau 1 gram sampel tanah tandus
- ditutup labu Erlenmeyer dengan kapas lemak dan inkubasi selama dua minggu dengan
bantuan shaker
- dilakukan pengujian kandungan ammonium setiap satu minggu sesuai dengan prosedur
berikut:
a. Teteskan reagen Nessler pada 2 lubang plat tetes
b. Ambil satu oose kultur dari masing-masing labu erlenmeyer dan baurkan pada
reagen hingga terjadi perubahan warna
c. Tentukan penilaian kandungan ammonium sesuai tabel dibawah
- dilakukan pengujian kandungan nitrit setiap satu minggu sesuai dengan prosedur berikut:
a. Teteskan 3 tetes reagen Trommsdorff dan 1 tetes asam sulfat encer (H2SO4 : H2O = 1 : 3)
pada 2 lubang plat tetes
b. Ambil satu oose kultur dari masing-masing labu erlenmeyer dan baurkan pada
reagen hingga terjadi perubahan warna
c. Warna reagen yang berubah menjadi biru tua menandakan adanya kandungan
nitrit (positif), sementara warna reagen yang tidak berubah menandakan belum
terbentuknya nitrit (negatif) dan dicatat hasil pengujian dan bandingkan perubahannya
setiap minggu
Hasil Pengamatan
 Warna Nilai Penilaian
Tidak ada perubahan 0 Tidak ada kandungan ammonium
Kuning muda 1 Sedikit
Kuning tua 2 Sedang
Coklat 3 Banyak

Nitrifikasi Tahap II
Satu labu Erlenmeyer berisi 100 ml larutan nitrit

- dimasukkan 1 gram sampel tanah tandus atau 1 gram sampel tanah subur
- ditutup labu Erlenmeyer dengan kapas lemak dan inkubasi selama dua minggu dengan
bantuan shaker
- dilakukan pengujian kandungan nitrit setiap satu minggu sesuai dengan prosedur berikut:
a. Teteskan 3 tetes reagen Trommsdorff dan 1 tetes asam sulfat encer pada 2 lubang plat
tetes
b. Ambil satu oose kultur dari masing-masing labu erlenmeyer dan baurkan pada
reagen hingga terjadi perubahan warna
c. Warna reagen yang berubah menjadi biru tua menandakan adanya kandungan
nitrit (positif), sementara warna reagen yang tidak berubah menandakan belum
terbentuknya nitrit (negatif)
- dilakukan pengujian kandungan nitrat setiap satu minggu sesuai dengan prosedur berikut:
a. Teteskan satu tetes reagen diphenylamine dan dua asam sulfat pekat pada 2 lubang
plat tetes
b. Ambil satu oose kultur dari masing-masing labu erlenmeyer dan baurkan pada
reagen hingga terjadi perubahan warna
c. Warna reagen yang berubah menjadi biru tua menandakan adanya kandungan
nitrit (positif), sementara warna reagen yang tidak berubah menandakan belum
terbentuknya nitrit (negatif)
- dicatat hasil pengujian dan bandingkan perubahannya setiap minggu
Hasil Pengamatan

C. Uji Kualitatif Aktivitas Bakteri Denitrifikasi

Tiga tabung durham berisi 10 ml kaldu nitrat

- diinokulasikan kultur cair Pseudomonas aeruginosa dan Proteus vulgaris pada dua tabung
reaksi yang berbeda (tabung jangan diguncang selama pengerjaan).
- dimasukkan 0,1 gram sampel tanah subur atau tanah tandus pada tabung durham yang
tersisa
- diinkubasi tabung durham selama dua minggu dengan bantuan shaker
- diamati gelembung gas nitrogen yang terbentuk dan terperangkap dalam tabung durham
setiap satu minggu, dan bandingkan perubahan ukuran gasnya

Hasil Pengamatan
 D. Isolasi Bakteri Pemfiksasi Nitrogen Non-Simbiotik
Satu Falcon berisi 10 ml kaldu mannitol N-free

- dimasukkan 0,2 gram sampel tanah subur lalu aduk suspensi hingga homogen
- ditutup isolat dengan kapas lemak dan inkubasi selama 7×24 jam hingga terbentuk
lapisan pada permukaan medium (biofilm)
- ditransfer lapisan tersebut dengan metode four-way-streak pada plat mannitol N-free
- diinkubasi plat mannitol N-free hingga hari ke-7
- dilakukan prosedur pewarnaan sederhana untuk menentukan jenis gram bakteri yang
diisolasi:
a. Buat apusan kering dari kultur bakteri
b. Teteskan pewarna dasar larutan Metilen Biru/Safranin, biarkan pewarna selama 1 menit
c. Cuci kelebihan pewarna/ bilas dengan air mengalir secara hati-hati
- diamati secara mikroskopis bagaimana bentuk, dan susunan sel bakteri yang diisolasi
Hasil Pengamatan

V. Literatur
- Peran Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, dan Proteus vulgaris dalam siklus nutrisi
- Jenis tanah yang banyak mengandung bakteri ammonifikasi, nitrifikasi, denitrifikasi, dan
pemfiksasi nitrogen
- Ciri-ciri Rhizobium dan Azotobacter

VI. Hasil Pengamatan

Tabel 1. Data Pengujian Amonifikasi
Warna
Jenis Tanah (Kelompok)
Hari Ke 2 Hari Ke 5 Hari Ke 7
Tanah Subur (...)
Tanah Tandus (...)
Bacillus cereus
Pseudomonas aeruginosa
Proteus vulgaris
Kontrol Negatif
 Tabel 2. Data Pengujian Nitrifikasi
Kelompok : Tanah Alkali Tanah Asam
Minggu Ke- Minggu Ke-
1 2 1 2
Uji amonia dengan Tanah
Medium reagen Nessler
Kontrol
Kaldu
Amonium Uji nitrit dengan reagen Tanah
Sullfat Trommsdorf+As.Sulfat
Kontrol
Uji nitrit dengan reagen Tanah
Trommsdorf+As.Sulfat
Medium Kontrol
Kaldu
Nitrit Uji nitrat dengan Tanah
difenilamin+As.Sulfat
Kontrol

Tabel 3. Data Pengujian Denitrifikasi

Isolat Minggu ke 1 Minggu ke 2
Pseudomonas aeruginosa
Proteus vulgaris
Tanah Subur
Tanah Tandus

Tanggal Praktikum : Senin, 7 September 2015

Tanggal Pengamatan : Senin, 7 September 2015
Kultur / Sampel : Air Kolam Intel
Preparat : Basah
Medium : Nutrient Agar
Reagen : Lactophenol Cotton blue
Perbesaran : 1000 x
Koloni : Kuning, Bulat, Halus
Keterangan : Cocci. Gram Negatif

MSDS yang Harus Di Baca

Pepton Reagen Diphenylamine
Ammonium Sulfat Asam Sulfat
Nitrit Crystal Violet
Nitrat Safranin
Reagen Nessler Alkohol 96%
Reagen Trommsdorff Methylene Blue
 Timeline Pengamatan
Waktu Amonifikasi Nitrifikasi Denitrifikasi Bakteri Pemfiksasi
Nitrogen Non Simbiotik
Hari ke 2: 4 April -17 Uji Reagen: - - -
Hari ke 5:7 April-17 Nessler
Hari ke 7: 10 April-17 Uji Reagen: Uji Reagen: Pengamatan ada Pengamatan ada tidak
Nessler Nessler, tidaknya nya lapisan tipis dan
Trommsdorf, gelembung inokulasi lapisan tipis
Difenilamin
Hari ke 14: 17 April-17 - Uji Reagen: Pengamatan ada Pewarnaan isolat dan
Nessler, tidaknya Pengamatan dengan
Trommsdorf, gelembung gas Mikroskop
Difenilamin

AMONIFIKASI
A B C A: Bacillus cereus/ Proteus Vulgaris/Pseudomonas aeruginosa
+Reagen Nessler
B: Tanah+Reagen Nessler
D E F C: Kontrol Negatif (Hanya Kaldu Pepton) +Reagen Nessler
NITRIFIKASI TAHAP I
D: Tanah(Kaldu Amonium Sulfat) +Reagen Nessler
E: Tanah(Kaldu Amonium Sulfat )+Reagen Trommsdorf +As.Sulfat
PLAT TETES
F: Kontrol Negatif (Hanya Kaldu Amonium Sulfat)+Reagen Nessler

NITRIFIKASI TAHAP I
A B C A: Kontrol Negatif (Hanya Kaldu Amonium Sulfat)+ Reagen
Trommsdorf +As.Sulfat
NITRIFIKASI TAHAP II
D E F B: Tanah (Kaldu Nitrit) +Reagen Trommsdorf +As.Sulfat
C: Tanah (Kaldu Nitrit) + Reagen Difenilamin+As.Sulfat
D: Kontrol Negatif (Hanya Kaldu Nitrit)+Reagen
Trommsdorf+As.Sulfat
E: Kontrol Negatif (Hanya Kaldu Nitrit)+ Reagen
Difenilamin+As.Sulfat