Laboratorium Kimia Organik

PERCOBAAN III
KROMATOGRAFI KOLOM DAN LAPIS TIPIS

Campuran senyawa organik sering dipisahkan dengan mengadsorpsi zat-zat dari sevolume kecil
pelarut dengan alumina dan kemudian membilas kolom dengan sederetan zat pelarut dengan
kemampuan melepas zat teradsorpsi dari zat pengadsorpsi. Eluen (cairan pembilas) yang
melewati kolom dikumpulkan dalam beberapa fraksi, masing-masing fraksi diuapkan untuk
memeriksa residu. Berbagai zat vyang berbeda akan keluar dari kolom pada saat yang berbeda
pula.

Urutan lewatnya zat berdasarkan kepolaran (adsorben bersifat polar):

• Alkana
• Alkena
• Diena
• Hidrokarbon aromatik
• Ester
• Keton
• Alkohol
• Diol
• Asam karboksilat

Pelarut yang dipakai unttuk mengetahui diurutkan berdasarkan naiknya daya mengelusiL:
petroleum eter, benzena, eter, metranol.

Dalam suatu penelitian, campuran zat yang tidak diketahui mula-mula dielusi dengan petroleum
eter, kemudian dengan campuran petroleum eter-benzena, dengan perban dingan 4:1 sampai 1:4,
kemudian dengan benzene, campuran benzene-eter, eter, dan campuran eter-metanol.
PEMBUATAN KOLOM

• Timbang sejumlah alumina yang diperlukan (12,5 g)

• Tutuplah kran pada kolom
• Isilah kolom kira-kira setengahnya dengan petroleum eter (td 40-60°C)
• Dengan sebatang gelas doronglah sejumlah glass wool kedalam dasar kolom
• Kemudian melalui corong masukkan pasir yang sudah dibersihkan sehingga terjadi lapisan
pasir setinggi 1 cm diatas glass wool
• Melalui corong masukkan alumina kedalam kolom. Untuk melepaskan alumina yang melekat
pada dinding, ketuk-ketuklan kolom dengan jari perlahan-lahan
• Setelah alumina turun, tambahkan sedikit pasir diatasnya
• Bukalah kran dan biarkan permukaan turun sampai sedikoit diatas lapisan pasir

Alternatif:

Alumina dapat dimasukkan kedalam kolom yang berisi petroleum eter. Alumina diaduk dalam
beaker untuk mensuspensikan alumina dan segera dituangkan dengan bantuan corong kedalam
kolom. Tambahkan lapisan pasir diatasnya.

• Siapkan labu-labu 50 mL sebagai penampung dengan menimbang secara telitidan beri nomor
• Setelah dipakai kolom dikosongkan dengan membalikkan kolom kedalam tabung
• Kemudian bukalah kran dan tiupkan udara secara perlahan yang akan menekan isi kolom
keluar

ASETILASI KOLESTEROL

• Tuangkan 5 mL asam asetata pada 0,5 g kolesterol dalam labu Erlenmeyer kecil
• Goyangkan dan pwerhatikan “sllury” yang mula-mula encer menjadi padat karena terjadi
senyawa C22H45CH3COOH
• Tambahkan 1 mL anhidrat asam cuka dan panaskan campuran diatas penangas air selama 15
menit sampai 1 jam, dan catatlah lama pemanasan yang sebenarnya
• Didinginkan dan tambahkan eter
• Cucilah ekstrak eter dua kali dengan air dan sekali dengan larutan natrium hidroksida 10%
• Keringkan ekstrak eter, saring dan uapkan
• Larutkan residu dengan 3-4 mL benzene
• Pindahkan larutan dengan pipet koplom alumina

Kromatografi lapis tipis

• Buatlah dua noda Ø dua mm dari larutan uji (kolesterol dan hasil asetilasi kolesterol), 1 cm
dari tepi bawah pada plat KLT
• Sediaikan botol untuk mengelusi noda dengan menuangkan 4 mL pelarut kedalam botol dan
goncangkan untuk menjenuhkan udara dengan uap pelarut. Tutup botol.
• Dengan menggunakan pinset masukkan plat5/keeping yang sudah dinodai kedalam botol dan
tutup lagi
• Perhatikan noda
• Gambarkanh kedudukan , bentuk, dan warna noda

Kromatografi kolom

Prosedur sebelumnya ikuti petunjuk dalam pembuatan kolom. Selanjutnya lakukan pemisahan
kolesterol yang telah diasetilasi pada prosedur diatas dengan cara kromatografi kolom, lalu
lanjutkan dengan prosedur berikut.

• Bila permukaan pelarut sampai sedikit diatas permukaan pasir, isilah kolom dengan sebagian
dari 50 mL petroleum eter
• Bila sudah tertampung eluen sebanyak 25 mL, gantilah labu penampung
• Tambahkan batu didih pada labu penampung pertama dan uapkan sampai kering diatas
penangas air. Penguapan dengan aspirator membantu menguapkan sisa-sisa benzena. Bila
fraksi pertama tidak meninggalkan residu, gunakanlah labu yang sama untuk menampung
fraksi berikutnya
• Pada kolo, lanjutkan penambahan 50 mL petroleum eter sampai seluruhnya terpakai
• Kemudian gunakan 50 mL benzena
• Selanjutnya gunakan campuran benzen eter (1:1) sebanyak 75-100 mL
• Penambahan solvent secara otomatis dapat dilakukan dengan suatu bubbler
• Zat-zat dengan Rf sama (diuji dengan KLT) disatukan dan diuapkan
• Penguapan dapat dipercepat dengan menggunakan aspirator (cara yang ideal adalah dengan
rotary evaporator)
• Tentukan berat setiap fraksi
• Hitunglah % kolesterol asetat terhadap seluruh zat yang diperoleh, tentukan titik leleh
• Cucilah labu dengan sedikit benzene
• Bukalah kran edan biarkan larutan mengalir
• Tampunglah dalam labu-labu Erlenmeyer

PROSEDUR
Pembuatan keping lapisan tipis (KLT) dengan metode pencelupan

• Tempatkan 15 g alumina (untuk KLT) dalam satu botol kecil (kira-kira 125 mL).
• Aduklah dengan batang kaca sambil dituangi dengan 75 mL air suling.
• Aduk terus sampai terjadi “slurry” lalu celupkan dea keping kaca miskroskop yang
didempetkan dan angkatlah secara hati-hati, keringkan keping kaca ini dengan dipanaskan
diatas hot plate 70 Watt.
• Ambil dengan pinset setelah kering dan didinginkan

Alternatif:
pengeringan dapat dilakukan dalam oven dengan pemanasan 110°C

Spotting larutan percobaan

Spotting dilakukan dengan mikropipet yang dibuat dengan menarik pipet gelas 5 mm.

Percobaan:

Eluen:

a. Benzena 4 mL
b. Benzena # mL – kloroform 1 mL
 c. Sikloheksana 4 mL
d. Kloroform 4 mL
e. Sikloheksana – etilasetat 4 mL (3,5 mL sikloheksana -1,5 mL etilasetat)

Zat warna:

I. Sudah merah
II. Biru indofenol
III. Zat warna hijau