Anda di halaman 1dari 28

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PENUNTUN PRAKTIKUM

ANALISIS MIKROBIOLOGI

FARMASI

Tim Penyusun:
Dr. Marline Nainggolan, M.S., Apt.
Popi Patilaya, S.Si., M.Sc., Apt.
Imam Bagus Sumantri, S.Si., M.Si., Apt.
Dra. Erly Sitompul. M.Si., Apt.
Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt.

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI)


FARMASI
PROGRAM STUDI S1-REGULER-INTERNASIONAL
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UITARA
MEDAN 2019

1|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

BIODATA PRAKTIKAN

Pas
Foto
3x4
Terbaru
(tidak boleh foto
Berpakaian seragam
Sekolah)

Nama Lengkap : ................................................................

NIM : ................................................................

Hari Praktikum : ................................................................

Gelombang : ................................................................

Kelompok : ................................................................

Asal Sekolah : ................................................................

Tanda tangan :

2|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN I
UJI ANGKA LEMPENG TOTAL BAKTERI PRODUK HERBAL

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) Melakukan pemeriksaan cemaran mikroba pada produk herbal berdasarkan
angka lempeng total;
b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI.

Alat
Cawan petri, mat pipet, Erlenmeyer, gelas ukur, jarum ose, pipet mikro, neraca
analitik, tabung reaksi, stomaker, dan colony counter.

Bahan
Plate Count Agar (PCA), Peptone Dilution Fluid (PDF), air suling, dan produk
herbal yang beredar di Kota Medan.

Prosedur
Timbang 1 gram sampel dan pindahkan secara aseptic ke dalam tabung steril,
tambahkan 10 mL air suling steril. Homogenkan sehingga diperoleh suspensi
dengan pengenceran 10-1 dan saring dengan kertas saring steril. Ambil 1 mL filtrat
dan encerkan secara bertingkat dengan PDF hingga diperoleh suspensi
pengenceran 10-2 dan 10-3. Tuang 0,1 mL dari masing-masing pengenceran ke
dalam 15 – 20 mL media PCA pada cawan petri, homogenkan (buat duplo). Buat
uji blanko untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer. Setelah media
memadat, inkubasi seluruh cawan pada suhu 35 – 37oC selama 24 – 48 jam dengan
posisi dibalik. Amati dan hitung jumlah koloni yang tumbuh.

Interpretasi
1. Pilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni
antara 30 -300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung, lalu
dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka
lempeng total dalam tiap mL contoh.

3|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau 300.
Hitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap mL
contoh.
3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan
menunjukkan jumlah koloni 30 – 300, maka hitung jumlah koloni dari masing
– masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor
pengencerannya. Apabila hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi
diperoleh jumlah koloni rata-rata lebih besar dari dua kali jumlah koloni rata-
rata dari pengenceran dibawahnya, maka angka lempeng total dipilih dari
tingkat pengenceran yang lebih rendah (missal pada pengenceran 10 -2 jumlah
koloni rata-rata 140, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 32, maka
dipilih jumlah koloni 140 x 102).
4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah
koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah koloni rata-rata pada pengenceran di
bawahnya, maka angka lempeng total dihitung dari rata-rata jumlah koloni
kedua tingkat pengenceran tersebut. Misal, pada pengenceran 10-2 jumlah
koloni rata-rata 293, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 41, maka
angka lempeng total adalah:
293 + 41
𝑥 103 = 167 𝑥 102
2
5. Bila tidak ada satupun koloni tumbuh dalam cawan, maka angka lempeng total
dinyatakan sebagai < dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.
6. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipilih cawan
dari tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi menjadi beberapa
sector (2,4 atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sector, angka lempeng
total adalah jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sector, kemudian dihitung
rata-rata dari kedua cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.
7. Jika jumlah koloni rata-rata dari ¼ bagian cawan lebih dari 200, maka angka
lempeng total dinyatakan lebih besar dari 200 x 8 dikalikan dengan faktor
pengenceran.
8. Perhitungan dan pencatatan hasil angka lempeng total hanya ditulis dalam dua
angka. Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari lima dan

4|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

dibulatkan ke atas bila lebih dari lima. Sebagai contoh 523 x 103 dibulatkan
menjadi 52 x 104, sedangkan 83,6 x 103 dibulatkan menjadi 84 x 103.
9. Jika dijumpai koloni “spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian
cawan, maka diitung koloni yang tumbuh di luar daerah “spreader”. Jika 75%
dari seluruh cawan mempunyai koloni “spreader” dengan keadaan di atas,
maka dicatat sebagai “Spr”. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan
diperbaiki cara kerjanya (pengujian ulang).
10. Jika dijumpai “spreader” tiper rantai, maka tiap satu deret koloni yang terpisah
dihitung sebagai satu koloni, dan bila dalam kelompok “spreader” terdiri dari
beberapa rantai dihitung sebagai satu koloni.

5|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN II
UJI ANGKA KAPANG DAN KHAMIR SIMPLISIA

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) Melakukan pemeriksaan angka kapang dan khamir pada simplisia;
b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI

Alat
Cawan petri, mat pipet, erlenmeyer, gelas ukur, jarum ose, pipet mikro, neraca
analitik, tabung reaksi, stomaker, dan colony counter.

Bahan
Potato Dextrose Agar (PDA), Peptone Dilution Fluid (PDF), Air suling agar (ASA),
dan simplisia tumbuhan.

Prosedur
Timbang 1 gr sampel dan pindahkan secara aseptik dalam tabung steril. Tambahkan
10 mL PDF, sehingga diperoleh suspensi dengan pengenceran 10-1, saring dengan
kertas saring steril. Encerkan filtrat hingga diperoleh larutan pengenceran 10-2, 10-
3
. Ambil 0,5 mL dari masing-masing pengenceran, dituangkan pada permukaan
PDA, sebarkan hingga merata dan dibuat duplo. Inkubasi seluruh cawan pada suhu
20 - 25oC. Amati pertumbuhan kapang/khamir pada hari ke-3 sampai hari ke-5.
Koloni khamir (ragi) memiliki bentuk bulat kecil, putih, hampir menyerupai
bakteri. Hitung jumlah koloni yang tumbuh.

Perhitungan
Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni
antara 10-150. Jumlah koloni dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan dengan
faktor pengencerannya. Bila pada cawan petri dari dua tingkat pengenceran yang
berurutan menunjukkan jumlah antara 10-150, maka dihitung jumlah koloni dan
dikalikan dengan faktor pengenceran, kemudian diambil angka rata-ratanya. Hasil
dinyatakan sebagai angka kapang dan khamir dalam tiap gram sampel.

6|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan diatas, maka
diikuti petunjuk berikut:
i. Bila hanya salah satu diantar kedua cawan petri dari pengenceran yang sama
menunjukkan jumlah antara 10-150 koloni, dihitung jumlah koloni dari kedua
cawan dan dikalikan dengan faktor pengenceran.
ii. Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni pada
pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah.
iii. Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan jumlah
antara 10-150 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran.
iv. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena
faktor inhibitor, maka Angka Kapang dan Khamir dilaporkan sebagai kurang
dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.

Persyaratan
Angka Kapan dan Khamir jamur bentuk serbuk tidak lebih dari 104 koloni per gram
bahan uji.

7|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN III
UJI ANGKA STAPHYLOCOCCUS AUREUS DALAM SARI BUAH

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analisis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk :
a) Melakukan pemeriksaan angka Staphylococcus aureus pada simplisia
b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI.

Alat
Pipet ukur mulut besar, batang gelas bengkok, alat hitung koloni.

Bahan
Brain heart influsion broth (BHIB), Brain Parker agar-emulsion yolk (BPA-EY),
buffered pepton water (BFW), plasma kelinci, 5% emulsi kuning telur (EY) dalam
larutan Nacl (1:1).

Prosedur :
Prosedur Penyiapan Sampel
Ambil 10 ml sampel dan masukkan ke dalam erlenmeyer steril. Tambahkan 90 ml
BPW, kocok hingga diperoleh suspensi homogen dengan pengerceran 10-1, Siapkan
2 tabung yang masing-masing telah diisi dengan 9 ml BPW.Ambil 1 ml
pengenceran 10-1 ke dalam tabung yang berisi 9 ml BPW hingge diperoleh suspensi
dengan pengenceran 10-2, kocok sampsi homogen. Buat pengenceran berikutnya
hingga 10-3, Dari sampel langsung dan dari setiap pengenceran dipipet 0,25 ke
cawan petri berisi 15-20 ml media BPA-EY yang telah memadat dan dibuat duplo.
Segera sebar ratakan suspensi dengan menggunakan batang gelas bengkok. Biarkan
beberapa saat sampai inokulum terserap dalam media. Untuk mengetahui sterilitas
pengencer dan media membuat uji blangko. Masukkan 0,25 ml pengencer pada satu
cawan berisi media BPA-EY yang telnh me.uadat, lalu disebar ratakan dengan
batang gelas bengkok. Cawan yang lain hanys dipenuhi media BPA-EY. Inkubasi
semua cawan petri pada suhu 35-37oC "selama 24-48 jam. Setelah 24 jam, pilih
cawan dengan jumlah antara 20-200 koloni berwarna hitam mengkilat dengan
garis-garis berwarna disekelilingnya. Posisi koloni pilih tarda dan inkubasi tambah
selai. yang tumbuh selama periode inkubasi dengan ciri-ciri seperti diatas. Bila dari
pengenceran terendah diperingkat jumlah koloni spesifik <20, maka dapat
digunakan untuk uji konfirmasi. Sedangkan bila dari pengenceran.
Tertinggi diperoleh jumlah koloni spesifik >200 , maka dapat digunakan untuk uji
konfirmasi.
Konfirmasi
pilih 10 koloni yang mengandung sebagai Staphylocoocus aureus, masing-masing
diinokulasikan ke dalam tabung berisi BHIB. Inkubasi pada suhu 35oC-37oC"
selama 20-24 jam. Pipet 0,1 ml biakan BHIB ke dalam tabung reaksi steril,
tambahkan 0,3 ml plasma kelinci, inkubasi pada suhu 35o-37oC" selama 4-6 jam.
8|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Amati adanya koagulasi plasma. Jika teriadi kongulasi maka dinyatakan


Staphylococcus aureus positif.
Perhitungan
Hitung Jumlah sampel yang diperhitungkan berdasarkan persentase koloni uji yang
dikonfirmasikan sebagai Staphylocoorus aureus, dikalikan 4 dan faktor
pengenceran. Misalnya penghitungan koloni dinyatakan dengan pada pengenceran
10-2 adalah 56. Dari koloni yang dikonfirmasi , 9 koloni dinyatakan sebagai
Staphylococcus aureus. Maka jumlah Staphylococous aureus per ml contoh
dihiyung menggunakan rumus:
JB- jumlah koloni x rasio konfirmasi x faktor koreksi x faktor pengenceran
JB = 56x (910) x (1 / 0,25) x 100
= 56 x 9 x 4 x 10
= 20160 koloni = 2x 104 koloni
Pernyataan
Minimum sari buah tidak diperbolehkan mengandung bakterl staphylococcus
aureus atau dengan kata lain angka Staphylccoccus aureus adalah 0 koloni per ml.

9|Penuntun Praktikum Analisis Mikrobiologi II


LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN IV
UJI PSEUDOMONAS AERUGINOSA
DALAM SEDIAAN PENCUCI MATA

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis
Farmasi dan Makanan Fakuktas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) melakukan pemeriksaan Pseudomaras aerugirosa dalam sediaan pencuci mata,
b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI .
Alat
Lampu ultraviolet, suhu udara 41oC, batang kaca bengkok, dan tabung reaksi

Bahan
Cetrimide agar (CETA), Pseudomonas agar P (PAP), nutrien agar (NA), tryptic soy
broth (TSB). Letheen broth (LB) atau fluid casein digest soy lecithin polysorba te
(FCDSLP), kloroform, dan BB-N’N '- tetrametil-p-fenilen-diamin dihidroklorida
0,5%.
Prosedur
Homogenisasi Sampel
Ambil secara aseptik 10 ml sampel dan masukkan ke dalam wadah steril yang
sesuai. Tambahkan 9 mi LB, kocok homogen hingga diperoleh suspensi dengan
pengenceran 10-1.
Pengkayaan
Dari suspensi pengenceran 10-1 dipipet 10 ml kecalam 90 ml TSB, 1 ml ke dalarm
10 ml TSB dan 0,1 ml ke dalam 10 ml TSB dan kernudian semuanya diinkubasi
pada suhu 35oC-37oC "se3lama 48 jam.

Isolasi
Ambil 1 sangkelit biakan pengkayaan yang menunjukkan pertumbuhan positif ,
goreskan atau seharkan pada permukaan media lempeng CETA. inkubasi pada suhu
35-37°C selama 48-72 jam. Amati adanya pertumbuhan koloni spesifik berwarna
kehijauan. Selanjutnya buat suspensi pekat dalam 0,5 ml TSB, inokulasikan pada
media lempeng PAP , PAF dan NA miring. Inkubasi semua media pada suhu 35oC-
37oC selama 24 jam untuk NA miring, 72 jam untuk PAP dan PAF. Lakukan juga
uji terhadap biakan kontrol positif Pseudomonas aeruginosa

Konfirmasi
Uji Pigmen
a) Biakan PAP yang berwarna kuning kehijauan akan berfluorosensi kekuningan
di bawah sinar ultra violet. Ambil lebih kurang 1 gram biakan berpigmen,
masukkan ke dalam tabung reaksi, tambahkan 2 ml air suling, kocok kuat.

10 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Kemudian tambahkan 2 ml kloroform dan kocok lagi. Pigmen fluoresin larut


dalam air dan tidak larut dalam kloroform.
b) Biakan PAP yang berwarna hijau kebiruan akan berfluoresensi kebiruan di
bawah sinar ultra violet. Ambil lebih kurang 1 gram biakan berpigmen,
masukkan ke dalam tabung reaksi, tambahkan 2 ml air suling, kocok kuat.
Kemudian tambahkan 2 ml kloroform dan kocok lagi. Pigmen piosianin larut
dalam air dan kloroform.

Uji Oksidase
Ambil 1 sangkelit biakan dari tabung NA miring, kemudian totolkan pada kertas
sitokrom atau kertas saring yang telah diimpregnasi (dijenuhkan) dengan N, N-
N’N’ tetrametil-p-fenilendianin dihidroklorida 0,5%. Pembentukan warna merah
muda yang beruban menjadi ungu membuktikan uji oksidase positif.

Uji Mengukur Suhu 41oC


Ambil 1 sengkelit biakan dari NA miring, diinokulasikan pada media TSB dan
inkubasi pada suhu 41oC selana 24-48 jam. Jike terjadi kekeruhan menunjukkan
pertumbuhan positif.

Uji Milcroskopik
Buat pewarnaan gram dari biakan NA miring dan ditangkap dengan mikroskop.

Tabel 1. Ciri-ciri Pseudomonas aeruginosa


Hasil Pengamatan Media
Koloni CETA PAF PAP
Fluorosensi UV Kehijauan Hijau Hijau Kebiruan
Uji Pigmen Kehijauan Kekuningan Kebiruan
-- Kekuningan Larut dalam air
Larut dalam air, dan kloroform
Tidak larut
dalam
Uji Oksidase kloroform
Uji Pertumbuhan suhu Positif
41oC Positif
Pewarnaan Gram Gram negatif , berbentuk batang pendek

Pernyataan Hasil
Jika dari ketiga biakan TSB diperoleh hasil seperti tersebut diatas , maka dinyatakan
pseudomonas aeruginosa positif dalam tiap 1,0; 0,1; dan 0,01ml sampel.

Persyaratan
Sediaan pencuci mata tidak boleh mengandung pseudomonas aeruginosa (negatif
per 0,01 ml).

11 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN V
UJI SALMONELLA DALAM BUBUR BAYI

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis
farmasi dan Makanan fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) Melakukan identifikasi Salmonella dalam bubur bayi;
b) Membandingkan hasil pemeriksaan dengan standar WHO dan Depkes RI.
Alat

Bahan
Lactose broth (LB), tetrathionate brilliant green broth (TBGB), selenite cysteine
broth (SCB), brilliant green agar (BGA), bismuth sulfite agar (BSA), triple sugar
iron agar (TSIA), lisin iron agar (LIA) , nutrient agar (NA), pepton dilution fluid
(PDF), larutan natrium klorida 0,805%, salmonella antisera polivalen 0, produk
bubur bayi.

Prosedur
Pra-pengkayaan
Timbang 25 g sampel ke dalam kantong stomaker steril, tambahkan 225 ml PDF.
Homogenkan menggunakan stomaker selama 30 detik kemudian ambil 10 ml dan
masukkan ke dalam 90 ml LB. Inkubasi pada suhu 35°-37° selama 18-24 jam.

Pengkayaan
Ambil 10 ml biakan pra-pengkayaan, masukkkan masing-masing ke dalam 100 ml
media TBGB dan 100 ml SCB. Inkubasi pada 43°C selama 24 jam.

Isolasi
Inokulasi 1 sengkelit dari setiap biakan TBGB dan SCB pada permukaan BGA dan
BSA. Inkubasi pada suhu 35°-37° C selama 24-48 jam. Amati koloni yang tumbuh.
Biakan diduga mengandung Salmonella jika:
Pada BGA: koloni dari tidak berwarna, merah muda hingga merah, dari translusen
hingga keruh (opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah.
Pada BSA: koloni berwarna cokelat abu-abu sampai hitam dan kadang-kadang
dengan kilap logam. Warna media di sekitar koloni mula-mula
coklat, jika masa inkubasi ditambah warna koloni menjadi hitam.

Identifikasi
Pilih dua atau lebih koloni spesifik pada BGA dan BSA. Inokulasi pada media NA,
TSIA, dan LIA dengan cara tusukan dan goresan. Inkubasi pada 35°-37°C selama
24 jam. Biakan diduga mengandung Salmonella jika:

12 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Pada TSIA: terlihat warna merah pada permukaan miring, warna kuning pada
biakan di dasar tabung dengan atau tanpa pembentukan hidrogen
sulfida (hitam).
Pada LIA: terlihat warna ungu lebih tua, diseluruh biakan.

Uji Serologi
Ambil 1 sengkelit biakan dari biakan NA miring dan suspensikan dengan 1 tetes
laruatan NaCl 0,85% pada kaca objek. Jika terjadi aglutinasi spontan, suspense
tersebut tidak dapat digunakan untuk uji serologi. Jika tidak, teteskan antisera
Salamonella polivalen O pada suspensi. Kemudian homogenkan dengan cara
menggoyang kaca objek atau mengunakan sengkelit. Amati selama 1 menit jika
terjadi aglutinasi menunjukkan bahwa Salmonella positif.

13 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN VI
ANALISIS ANGKA PALING MUNGKIN PRODUK MINUMAN

Tujuan Instruksional
Setelah mengkuti proyek ini, mahasiswa Program Studi Diploma IIl Analis Farmasi
dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) Melakikan pengujian angka paling mungkin pada produk minuman;
b) Menghitung angka paling mungkin pada produk minuman;
c) Menginterpretasi angka paling mungkin pada produk minuman.

Alat
Stomaker, pipet ukur mulut lebar, tabung reaksi dilengkapi tabung Durham.

Bahan
Peptone Dilution Fluid (PDF), MacConkey Broth (MCB). Brilliant Green Lactose
Bile 2% Broth (BGB), produk minuman.

Prosedur
Timbang 25 ml cuplikan sampel danpindah secara aseptic ke dalam kantong
stomaker plastik steril. Tambahkan 225 ml Pepton Dilution Fuid (PDF) dan kocok
hingga diperoleh suspensi homogen dengan pengenceran 10-1. Buat pengenceran
bertingkat dalam tabung reaksi berisi 9 ml PDF hingga diperoleh suspensi dengan
pengenceran 10-2 dan 10-3.

Uji Presumtif
Siapkan 3 tabung reaksi berisi 9 ml MCB yeng dilengkapi tabung Durham untuk
setiap pengenceran. Ke dalam tabung dari masing-masing seri masukkan 1 ml
suspensi pengenceran. Inkubasi semua tabung pada suhu 37°C selama 24-48 jam.
Setelah inkubasi, catat dan amati ada tidaknya gas dalam tabung Durham pada tiap
tabung reaksi. Kemudian lanjutkan inkubasi hingga 48 jam dan catat tabung-tabung
yang menghasilkan gas.

Uji Konfirmasi
Pindahkan 1 sengkelit biakan dari tabung yang menunjukkan uji presumtif positif
ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml BGLB yang telah dilengkapi dengan tabung
Durham. Inkubasi seluruh tabung pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Amati ada
tidaknya gas pada tabung Durham.

Interpretasi
Catat jumlah tabung yang menghasilkan gas dari uji konfirmasi dan rujuk ke Tabel
MPN. Angka yang diperoleh pada Tabel MPN menyatakan jumlah bakteri koliform
dalam tiap gram atau tiap ml contoh yang diuji.

14 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Tablel MPN (Cara 3 Tabung)


Indeks MPN dan batas kepercayaan 95% bila digunakan 3 tabung

Jumlah Tabung MPN per g/ml Batas Kepercayaan 95%


Positif
1:10 1:100 1:1000 Terendah Tertinggi
0 0 0 <3 -- --
0 0 1 3 <0,5 9
0 1 0 3 <0,5 13
1 0 0 4 <0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
Jumlah Tabung MPN per g/ml Batas Kepercayaan 95%
Positif
1:10 1:100 1:1000 Terendah Tertinggi
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
3 3 3 >2400 -- --

Catatan:
Bila seri pengenceran yang digunakan melebihi dari yang tertera pada Tabel MPN,
maka hasil yang diperoleh dari Tabel dikalikan factor 10, 100, 1000, dan seterusnya.
Misal: Bila yang dipilih adalah dari pengenceran 10-2, 10-3,10-4 maka hasilnya
dikalikan dengan 10. Bila yang dipilih adalah pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5
maka hasil dikalikan 100.

15 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN VII
IDENTIFIKASI BAKTERI PADA KEMASAN MINUMAN

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) Melakukan identifikasi bakteri menggunakan pengecetan Gram;
b) Mendeskripsikan morfologi bakteri pencemar pada kemasan minuman kaleng;

Alat
Gelas objek, jarum ose, Bunsen, botol air suling, pinset, dan mikroskop.

Bahan
Produk minuman kaleng, nutrient broth, alkohol, gentian violet, lugol, safranin, air
suling, dan minyek imersi.

Prosedur
1. Bilassecara aseptic kemasan kaleng bagian atas dengan air suling steril dan
tampung Erlenmeyer steril, Ambil 1 ml cupliken dan dipindahkan secara aseptik
ke dalam tabung berisi nutrient broth. Inkubasi pada 35-37°C selama 24-48 jam.
2. Cuci gelas objek dengan alkohol 70% lalu difiksasi. Letakkan satu tetes air
suling pada gelas objek. Suspensikan satu ose sampel, ratakan dan fiksasi.
3. Tambahkan satu tetes gentian violet lalu tambahkan satu tetes larutan lugol
ratakan dan fiksasi. Cuci gelas objek dengan alkohol 70% sampai tetesan
terakhir tidak berwarna, keringkan.
4. Tambahkan satu tetes safranin, biarkan 15-30 detik, cuci larutan safranin
dengan air suling steril, keringkan. Tetesi dengan minyak imerei (imersi oil).
5. Lihat pada mikroskop dengan pembesaran 100 kali, amati warna dan bentuk
dari bakteri. Warna ungu / violet menunjukkan bakteri Gram positif, dan warna
merah jambu (pink) menunjukkan bakteri Gram negatif.

16 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN VIII
UJI STERILITAS
Tujuan Instruksional
Seteah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analisis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki ketrampilan untuk :
A) Melakukan pengujian sterilitas sediaan farmasi dan alat kesehatan
B) Melakukan pengujian fertilitas media pertumbuhan
C) Menginterpretasi hasil uji sterilitas dan fertilitas

Alat
Tabung reaksi, pipet kamagome atau alat suntik, mat pipet, dan neraca analitik
Bahan
Fluid Thioglycollate Medium (FT), Tryptic Soy Broth (TSB), Etanol 70%, Larutan
Benzalkonium Klorida 0,2%, Biakan bakteri Bacillus subtilis dan Clostridium
sporagenes , Sediaan Farmasi steril
Prosedur
Uji Fertilitas Media
Siapkan 4 tabung berisi 15 mL FTM dan 2 Tabung berisi 15 mL TSB. Inokulasi
masing-masing 0,1 mL suspensi Bacilus subtilis ATCC 6633 (1000 Spora hidup
per ml) ke dalam 2 tabung FTM dan 0,1 mL suspensi Clostridium sporagenes NIHJ
(1000 sel hidup per mL) ke dalam 2 tabung FTM lainnya. Inokulasi 0,1 mL suspensi
Candida albicans NIHJ (1000 sel hidup per ml) masing-masing ke dalam 2 tabung
TSB. Pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas. Tabung berisi FTM
diinkubasi pada suhu 35o-37oC dan tabung berisi TSB pada suhu 20-25oC selama
tidak kurang dari 7 hari.
Uji Sterilitas Media
Inkubasi 2 tabung berisi masing-masing media 15 mL FTM dan 15 mL TSB dari
bets yang sama pada suhu dan waktu yang sama dengan media yang digunakan
untuk uji sterilitas.
Cara Penetapan
Pengujian dilakukan dalam Laminar Airflow Cabinet yang sebelumnya telah
disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan benzalkonium klorida 0,2% steril
dan telah dijalankan selama 30-60 menit. Ambil secara aseptic 2 bagian cuplikan
seberat 200-500 mg dari bagian paling dalam sampel atau keseluruhan sampel bila
ukurannya kecil. Masukkan masing-masing cuplikan ke dalam 100 mL FTM dan
100 mL TSB. Inkubasi media FTM pada suhu 35-37oC dan media TSB 20-25oC
selama tidak kurang dari 14 hari.
Pengamatan dan Penafsiran Hasil Uji
Tahap Pertama
17 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Pada interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi, amati secara
makroskopis adanya pertumbuhan jasad renik di dalam semua tabung. Bila tida
terdapat pertumbuhan, makan dikatakan bahwa sampel memenuhi syarat fertilitas.
Bila terdapat pertumbuhan dan dapat dibuktikan dari pemantauan bahwa fasilitas
pengujian, bahan yang digunakan, prosedur pengujian dan control negatif atau
teknik aseptic digunakan tidak valid, makan hasil pengujian dinyatakan tidak abash
dan tahap pertama harus diulang. Bila terdapat pertumbuhan dan terbukti pengujian
tahap pertama abash, dilakukan tahap kedua.
Tahap Kedua
Jumkah sampel uji minimum dua kali jumlah sampel pada pengujian tahap pertama.
BIla tidak terdapat pertumbuhan jasad renik, maka dinyatakan sammpel memenuhi
syarat sterilitas. Bila terdapat pertumbuhan maka dinyatakan sampel tidak
memenuhi syarat sterilitas kecuali dapat dibuktikan bahwa tahap kedua tidak abash,
dalam hal ini pengujian tahap kedua dapat diulang dengan sampel dan cara yang
sama.

PERCOBAAN IX
UJI EFEKTIVITAS PENGAWET
Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analisis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memilik keterampilan untuk :
A) Melakukan pengujian efektivitas pengawet
B) Menentukan efektivitas pengawet terhadap bakteri uji

Alat
Vortex mixer, Cawan Petri, Alat penghitung Koloni, dan Neraca Analitik
18 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Bahan
Tryptic Soy Agar (TSA), Potato Dextrose Agar (PDA), Lactose Broth (LB), Biakan
bakteri Staphylococcus aureus
Prosedur
Timbang 1 gram atau ambil 1 mL sampel, masukkan ke dalam wadah steril.
Tambahkan 00,1 ml suspensi inokulum bakteri Staphylococcus aureus dan
encerkan dengan LB hingga diperoleh pengenceran 10-1-10-6, ambil 1 mL dari
setiap pengenceran dan pindahkan secara aseptic ke dalam petri (masing-masing
duplo), tambahkan 15 ml media, homogenkan. Biarkan media memadat, kemudian
inkubasi cawan pada suhu 35-37oC selama 2 hari. Hitung jumlah koloni bakteri
pada hari ke 7, 14,21 dan 28.
Suatu pengawet dinyatakan efektif jika :
A) Pada hari ke-14 jumlah koloni bakteri tidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal
B) Selama 14 hari pertama jumlah koloni ragi atau kapang sama dengan atau
kurang dari jumlah awal
C) Jumlah mikroba uji selama waktu tersisa dari 28 hari tetap atau kurang dari
bilangan yang disebut pada a) dan b)

19 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN X

UJI KOEFISIEN FENOL


Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analisis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki ketrampilan untuk :
a) Melakukan pengujian mutu desinfektan berdasarkan koefisien fenol
b) Menentukan koefisien fenol produk desinfektan
c) Menganalisis dan interpretasi efektivitas produk desinfektan

Alat
Tabung reaksi ukuran (20 x 150) mm dan (25 x 250)mm, sengkelit platina
diameter mata 4 mm
Bahan
Nutrien Broth, Nutrient Agar, Fenol Baku, Produk desinfektan, dan Biakan
Bakteri Salmonela typhi
Prosedur
Penyiapan Media
Buat media Nutrient Broth dengan melarutkan 10 gram Bacto Pepton, 5 gram
Beef Extract, 5 gram NaCl dalam 1 liter air suling, campur homogeny dan atur pH
6,8. Masukkan 10 mL media dalam tiap tabung dan sterilkan dalam autoklaf pada
121oC selama 15 menit.
Penyiapan Bakteri Uji
Biakan bakteri Salmonella typhi ATCC 6539 yang telah diinkubasi 48 jam pada
suhu 35-37oC dalam media NB, inkubasi pada suhu 35-37oC selama 24 jam.
Bakteri uji yang digunakan untuk uji koefisien fenol adalah biakan berusia 24 jam
dan telah mengalami peremajaan selama 3 kali dalam 3 hari berturut-turut, batas
maksimum peremajaan adalah 30 kali.
Penyiapan Larutan Fenol Baku
Timbang 50 gram Kristal fenol dalam gelas piala, larutkan dengan air suling
hingga 1 liter (Larutan A). Kadar fenol dari larutan dibakukkan dengan 0,1 N
KBr-KBrO3 dengan cara berikut : Pipet 25 mL larutan A ditambah air suling
hingga 500 mL, campur homogen (Larutan B). Pipet 15 mL laruta B ke dalam
Erlenmeyer bertutup, tambah 30 mL baku KBr-KBrO3 dan 5 mL HCL 0,1 N.
Segera tutup, kemudian kocok teratur selama 30 menit dan diamkan selama 15
menit. Buka sedikit tutup Erlenmeyer, tambahkan dengan cepat 5 mL larutan 20%
KI, usahakan tidak ada uap Br yang keluar, dan segera tutup rapat. Kocok dengan
hati-hati. Buka sedikit penutup Erlenmeyer, bilas bagian leher dengan sedikit air
sulit (larutan C), titrasi dengan 0,1 N Na2S2O3 (1 ml 0,1 N KBr-KBrO3 =
0,001569 gram fenol )

20 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

100
Kadar Fenol (%) = 30 – Vol .titer Na2S2O3 x 0,001569 x 1333 x 1000

30 : Volume larutan 0,1 N KBr-KBrO3 yang ditambahkan


0,001569 : Gram fenol ekivalen terhadap 1 mL 0,1 N Kbr-KBrO3
1333 : Faktor pengenceran
1000 : Volume larutan sediaan fenol baku
Larutan baku ini harus disimpan rapat dalam tempat yang sejuk dan terhindar dari
cahaya. Setelah diperoleh kadar fenol yang sebenarnya maka dibuat larutan fenol
baku 5% sebagai berikut :
Penyiapan Larutan Fenol Baku 5%
Timbang seksama 5 gram Kristal fenol baku sesuai kadarnya dalam 100 mL air
suling steril, kocok homogeny. Buat pengenceran 1 :80, 1 : 90, dan 1 :100 dalam
tabung steril ukuran (25 x 150)mm yang masing-masing berisi 5 ml air suling steril
Penyiapan Larutan Desinfektan Uji
Buat larutan desinfektan yang diencerkan sesuai dengan yang tertera pada etiket
kemasan atau buat sedemikian rupa sehingga berada pada kisaran pengenceran
dengan daya bunuh terhadap bakteri uji dalam waktu kontak 5 – 15 menit.
Pengenceran dibuat dalam tabung reaksi ukuran (25x150)mm dengan volume
masing-masing 5 Ml. Untuk larutan desinfektan uji dibuat 7 tingkat pengenceran.
Inokulasi
Siapkan rak tabung reaksi sesuai ukuran tabung dengan kapasitas 40 dalam 4
deretan. Deretan pertama untuk tabung fenol baku dan desinfektan. Deret ke-2,3,4
untuk tabung media NB untuk waktu kontak 5,10, dan 15 menit. Masukkan semua
tabung dan biakan bakteri uji ke dalam tangas air suhu 20oC dan biarkan selama 5
menit. Masukkan 0,5 mL suspensi bakteri uji ke dalam tiap tabung pengenceran
fenol baku dan desinfektan, kocok hingga homogeny. Waktu memasukkan bakteri
uji pada tabung pengenceran pertama dicatat sebagai 0 menit. Interval waktu
inokulasi antar tabung adalah 30 detik, sehingga untuk 10 tabung dapat diselesaikan
selama 4,5 menit, setiap kali inokulasi usahakan ujung pipet mendekati permukaan
cairan dan tidak menyentuh dinding tabung. Setelah 5 menit diinokulasi, segera
kocok tabung pertama, tabung dipegang dalam posisi miring ±60º di dekat nyala
api, tangan kanan memegang sengkelit platina. Pindahkan secara aseptik 1 sengkelit
suspensi ke dalam media NB deret ke 2 satu persatu dengan selang waktu 30 detik
sampai tabung ke 10. Setelah 10 menit dinokulasi, kocok tabung pengenceran
pertama, pindahkan 1 sengkelit suspensi dalam media NB deret ke 3 sama seperti
di atas. Setelah 15 menit diinokulasi kocok tabung pengenceran pertama, pindahkan
21 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

1 sengkelit suspensi ke dalam media NB deret ke 4. Kocok semua tabung yang telah
diinokulasi kemudian inkubasi pada suhu 35-37 ºC selama 43 jam dan amati
ada/tidaknya pertumbuhan bakteri pada setiap tabung. Jika ada pertumbuhan yang
masih meragukan maka dapat dilakukan konfirmasi dengan uji serologi.

Perhitungan
Koefisien fenol adalah hasil bagi dari faktor pengenceran tertinggi desinfektan
dengan faktor pengenceran tertinggi baku fenol yang masing-masing dapat
membunuh bakteri uji dalam masa kontak 10 menit tetapi tidak dalam masa kontak
5 menit (Lihat Tabel 1 dan 2),

Tabel 1. Contoh Hasil Pengamatan Baku Fenol


Pengenceran Lama Kontak
Fenol Baku 5 menit 10 menit 15 menit
1:80 0 0 0
1:90 + 0 0
1:100 + + +

Tabel 2. Contoh Hasil Pengamatan Desinfektan


Pengenceran Lama Kontak
Desinfektan 5 menit 10 menit 15 menit
1:100 0 0 0
1:150 0 0 0
1:200 0 0 0
1:250 + 0 0
1:300 + + 0
1:350 + + +
1:400 + + +

Koefisien Fenol desinfektan = 250/90 = 2,77.


Pengujian dianggap memuaskan jika baku fenol memberikan hasil seperti pada
Tabel 3.
Tabel 3. Tabel Hasil Uji Baku Penol Yang Memenuhi Syarat
Lama Kontak
Pengenceran
5 menit 10 menit 15 menit
1:80 +/0 0 0
1:90 +/0 +/0 0
1:100 + + +/0

22 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

Bila dari dua pengenceran pertama dari baku fenol yang diuji tidak ada satupun
tabung pengenceran yang memberikan hasil positif dalam masa kontak 5 menit dan
memberikan hasil pertumbuhan negatif dalam masa kontak 10 menit, maka
diperkirakan bahwa pengenceran yang diharapkan berada di antara pengenceran
kedua (1:90) dan pengenceran ketiga (1:100). Lihat Tabel 4 dan 5.

Tabel 4. Contoh Hasil Perkiraan Uji Baku Fenol


Lama Kontak
Pengenceran
5 menit 10 menit 15 menit
1:80 0 0 0
1:90 0 0 0
1:100 + + 0

Tabel 5. Contoh Hasil Perkiraan Uji Desinfektan


Lama Kontak
Pengenceran
5 menit 10 menit 15 menit
1:300 0 0 0
1:350 0 0 0
1:400 + + 0

Jadi angka perkiraan untuk baku fenol antara 0 - 100, untuk desinfektan antara 50-
400. Koefisien fenol = 375/95 = 3,96.

Persyaratan
1. Jika koefisien fenol yang diperoleh dikalikan dengan faktor 20 menghasilkan
angka yang lebih kecil dari angka pengenceran yang tertera pada etiket, maka
desinfektan itu tidak memenuhi syarat.
2. Jika koefisien fenol yang diperoleh dikalikan dengan faktor 20 menghasilkan
angka yang sesuai dengan angka pengenceran yang tertera pada etiket, maka
desinfektan tersebut memenuhi syarat.

23 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN XI
UJI KEPEKAAN ESCHERICHIA COLI TERHADAP AMOKSILIN

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) Melakukan pengujian kepekaan mikroba terhadap antibiotik amoksilin
menggunakan metode Kirby-Bauer;
b) Menentukan zona hambat antibiotik amoksilin terhadap pertumbuhan mikroba;
c) Menginterpretasi kepekaan mikroba terhadap antibiotilk amoksilin.

Alat
Cawan petri, pencadang logam/gelas, pinset, labu tentukur, pipet volumetrik, dan
pipet mikro.

Bahan
Sediaan antibiotik uji dan amoksilin baku, Mueller-Hinton agar (MHA), air suling,
natrium klorida 0,99%, asan klorida 0,I N, biakan bakteri Escherichia coli.

Prosedur
Penyiapan Larutan Amoksilin
Timbang sediaan uji setara dengan 100 mg amoksilin, larutkan dalam HCI 0,1 N
dan cukupkan hingga 100 ml (konsentrasi 1.000 g/ml). Ambil secara aseptik 0,2
ml larutan tersebut dan encerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk memperoleh
konsentrasi 20 μg/ml.

Penyiapan Inokulum E. Coli


Ambil sengkelit koloni E. coli dari biakan agar yang telah dinkubasi selama 24 jam.
Pindahkan ke dalam tabung berisi larutan NaCl 0,9%, kocok hingga terdispersi
secara merata. Encerkan secara bertahap hingga diperoleh inokulum yang
menghasilkan transmitan 25% pada panjang gelombang 580 nm.

Pengujian Kepekaan Antibiotik


Siapkan 2 cawan petri steril. Campurkan 0,1 ml inokulum bakteri dengan 15 ml
MHA dalam masing-masing cawan petri, homogenkan, kemudian biarkan sampai

24 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

media memadat. Tanam 4 cincin pencadang logam/gelas pada masing masing


cawan. Kemudian masukkan larutan antibiotik uji pada cawan petri, salah satu
cincin pencadang diisi dengan larutan blanko. Inkubasi pada suhu 36-37°C selama
18-24 jam. Setelah inkubasi, ukur diameter zona hambat di sekitar cincin pencadang
menggunakan jangka sorong.

25 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

PERCOBAAN XII
UJI POTENSI ANTIBIOTIK

Tujuan Instruksional
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Diploma III Analis
Farmasi dan Makanan Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:
a) Melakukan pengujian potensi antibiotik dengan metode lempeng silinder;
b) Menghitung potensi antibiotik terhadap mikroba;
c) Mengevaluasi mutu produk antibiotik berdasarkan monografi uji potensi
Farmakope Indonesia Edisi IV.

Alat
Cawan petri, pencadang logam/gelas, pinset, labu tentukur, pipet volumetrik, dan
pipet mikro

Bahan
Antibiotik uji dan baku (kloramfenikol dan tetrasiklin), nutrient agar, air suling,
natríurn klorida 0,9%, asam klorida 0,1 N, mikroba uji (Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus)

Prosedur
Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Kloramfenikol
Timbang teliti 1 g kloramfenikol baku, larutkan dalam air suling dan cukupkan
hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Encerkan dengan air suling
(perbandingan 1:1,25) untuk memperoleh konsentrasi kloramfenikol 1,6; 2,0; 2,5;
3,125; dan 3,906 /ml.
Sİ (1,6 μg/mL) : ambil 1,600 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.
S2 (2,0 μg/ml) : ambil 2,000 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.
S3 (2,5 μg/ml) : ambil 2,500 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.
S4 (3,125 μg/ml) : ambil 3,125 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.

26 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

S5 (3,906 μg/ml) : ambil 3,906 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.

Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Tetrasiklin


Timbang teliti 1 g tetrasiklin, larutkan dalam asam klorida 0,1 N dan cukupkan
hingga 100 ml (konsentrasi 10 μg /ml). Encerkan dengan air suling untuk
memperoleh konsentrasi 0,1536; 0,192; 0,24; 0,30; dan 0,375 μg/ml.

S1 (0,1536 μg/ml) : ambil 0,135 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.
S2 (0.192 μg/ml) : ambil 0,192 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.
S3 (0,24 μg/ml) : ambil 0,240 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.
S4 (0,30 μg/m) : ambil 0,300 ml LIB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.
S5 (0,375 μg/ml) : ambil 0,375 ml LB, encerkan dengan air suling hingga 10
ml.

Penyiapan Larutan Kloramfenikol Uji


Timbang sediaan setara dengan 1 g kloramfenikol, larutkan dalam air suling dan
cukupkan hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Ambil secara
aseptik 2,5 ml larutan dan encerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk
memperoleh konsentrasi kloramfenikol 2,5 μg/ml.

Penyiapan Larutan Tetrasiklin Uji


Timbang sediaan setara dengan 1 g tetrasiklin, larutkan dalam asam klorida 0,1 N
dan cukupkan hingga 100 ml (konsentrasi 10 μg/m1). Ambil secara aseptik 0,24 ml
dan encerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk memperoleh konsentrasi
tetrasiklin 0,24 μg/ml.

Penyiapan Inokulum E. coli dan S. aureus


Ambil sengkelit koloni E. coli dan S. aureus dari biakan agar yang telah diinkubasi
selama 24 jam. Pindahkan ke dalam tabung berisi larutan NaCl 0.9%, kocok hingga

27 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I
LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

terdispersi secara merata. Encerkan secara bertahap hingga diperoleh inokulum


yang menghasilkan transmitan 25% pada panjang gelombang 580 nm.

Pengujian Potensi Antibiotik


Siapkan 5 cawan petri, ambil 0.1 ml biakan bakteri dan campur dengan 15 ml media
dalam masing-masing cawan, biarkan memadat. Tanamkan 7 pencadang
logam/gelas pada 4 cawan, masukkan 0,1 ml LIB kloramfenikol secara berselang-
seling dengan S3, 1 pencadang diisi dengan 0,1 ml air suling sebagai kontrol.
Tanamkan 7 pencadang logam/gelas pada 1 cawan sisa, isi dengan larutan
kloramfenikol uji (U3) dan LIB kloramfenikol (S3). Inkubasi pada 37ºC selama 24-
48 jam. Setelah inkubasi ukur diameter zona hambat. Prosedur yang sama dilakukan
terhadap tetrasiklin (Depkes, 1995).

28 | P e n u n t u n P r a k t i k u m A n a l i s i s M i k r o b i o l o g i I I

Anda mungkin juga menyukai