Bidang Unggulan : Kesehatan, Penyakit Tropis,, Gizi dan Obat

Kode/Nama Rumpun Ilmu* : 351 / Kesehatan Masyarakat

USULAN
PENELITIAN UNGGULAN UNIVERSITAS GADJAH MADA
TAHUN ANGGARAN 2017

NOVEL NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TEST UNTUK

DIAGNOSTIK DINI DAN PEMETAAN TUBERCULOSIS:
PENGEMBANGAN DAN APLIKASI DI LAPANGAN UNTUK DETEKSI
ZOONOSIS DAN MDR-TB MENGGUNAKAN
PENDEKATAN ONE HEALTH

TIM PENGUSUL
Prof. Dr. Wayan Tunas Artama, NIDN: 0018085308
Dr. Abu Tholib Aman, Ph.D., Sp,Mk. NIDN: 0017086405
Dr. Drh. Hery Wijayanto, MP, NIDN: 0028066302
Drh. Dyah Ayu Widiasih, Ph.D., NIDN: 0020036901

UNIVERSITAS GADJAH MADA

Juni 2016
1
 DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN.......................................................................... 1

DAFTAR ISI ................................................................................................. 2

RINGKASAN /ABSTRAK............................................................................ 6

BAB I. PENDAHULUAN............................................................................. 7

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA.................................................................. 10

BAB III. METODE PENELITIAN................................................................ 14

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………… 21

LAMPIRAN………………………………………………………………… 23

2
 IDENTITAS DAN URAIAN UMUM

1. Judul Penelitian : Novel Nucleic Acid Amplification Test untuk Diagnostik Dini dan Pemetaan
Tuberculosis: Pengembangan dan Aplikasi di Lapangan untuk Deteksi
Zoonosis dan MDR-TB menggunakan Pendekatan One Health
2. Tim Peneliti
Alokasi
Bidang
No Nama Jabatan Instansi Asal Waktu
Keahlian (jam/minggu)
WAYAN TUNAS Universitas Gadjah
1 ARTAMA Ketua Pengusul - Mada 10.00
Dr ABU THOLIB Universitas Gadjah
2 M.Sc Anggota Pengusul - Mada 10.00
Universitas Gadjah
3 HERY WIJAYANTO Anggota Pengusul - Mada 10.00
DYAH AYU Universitas Gadjah
4 WIDIASIH Anggota Pengusul Kesmavet Mada 10.00

3. Objek Penelitian (jenis material yang akan diteliti dan segi penelitian):
Hewan, Satwa liar, dan Manusia
4. Masa Pelaksanaan
Mulai tahun: 2017
Berakhir tahun: 2019
5. Usulan Biaya DRPM Ditjen Penguatan Risbang
- Tahun ke-1: Rp200,000,000
- Tahun ke-2: Rp200,000,000
- Tahun ke-3: Rp200,000,000
6. Lokasi Penelitian (lab/studio/lapangan)
Daerah Istimewa Yogyakarta, Jawa Tengah, dan Bali
7. Instansi lain yang terlibat (jika ada, dan uraikan apa kontribusinya)
Dinas Kesehatan, Dinas Peternakan, Dinas Kehutanan, dan Dinas Pariwisata
8. Temuan yang ditargetkan (produk atau masukan untuk kebijakan)
Tuberkulosis pada Hewan, Satwa Liar, dan Manusia
9. Kontribusi mendasar pada suatu bidang ilmu (uraikan tidak lebih dari 50 kata, tekankan pada gagasan
fundamental dan orisinal yang mendukung pengembangan iptek)
Diagnosa Penyakit Tuberkulosis dan Multi Drug Resistant Tuberkulosis
10 Jurnal ilmiah yang menjadi sasaran (tuliskan nama terbitan berkala ilmiah internasional bereputasi, nasional
. terakreditasi, atau nasional tidak terakreditasi dan tahun rencana publikasi)
Jurnal Penyakit Tropis, Jurnal ABJTB
11 Rencana luaran HKI, buku, purwarupa atau luaran lainnya yang ditargetkan, tahun rencana perolehan atau
. penyelesaiannya

3
- Publikasi Ilmiah Jurnal Internasional, tahun ke-1 Target: draft
- Publikasi Ilmiah Jurnal Internasional, tahun ke-2 Target: accepted/published
- Publikasi Ilmiah Jurnal Internasional, tahun ke-3 Target: accepted/published
- Publikasi Ilmiah Jurnal Nasional Terakreditasi, tahun ke-1 Target: reviewed
- Publikasi Ilmiah Jurnal Nasional Terakreditasi, tahun ke-2 Target: accepted/published
- Publikasi Ilmiah Jurnal Nasional Terakreditasi, tahun ke-3 Target: accepted/published
- Pemakalah dalam pertemuan ilmiah Nasional, tahun ke-1 Target: draft
- Pemakalah dalam pertemuan ilmiah Nasional, tahun ke-2 Target: terdaftar
- Pemakalah dalam pertemuan ilmiah Nasional, tahun ke-3 Target: sudah dilaksanakan
- Pemakalah dalam pertemuan ilmiah Internasional, tahun ke-1 Target: draft
- Pemakalah dalam pertemuan ilmiah Internasional, tahun ke-2 Target: terdaftar
- Pemakalah dalam pertemuan ilmiah Internasional, tahun ke-3 Target: sudah dilaksanakan
- Keynote Speaker dalam pertemuan ilmiah Internasional, tahun ke-1 Target: draft
- Keynote Speaker dalam pertemuan ilmiah Internasional, tahun ke-2 Target: terdaftar
- Keynote Speaker dalam pertemuan ilmiah Internasional, tahun ke-3 Target: sudah dilaksanakan
- Keynote Speaker dalam pertemuan ilmiah Nasional, tahun ke-1 Target: draft
- Keynote Speaker dalam pertemuan ilmiah Nasional, tahun ke-2 Target: terdaftar
- Keynote Speaker dalam pertemuan ilmiah Nasional, tahun ke-3 Target: terdaftar
- Visiting Lecturer Internasional, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Visiting Lecturer Internasional, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Visiting Lecturer Internasional, tahun ke-3 Target: sudah dilaksanakan
- Paten, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Paten, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Paten, tahun ke-3 Target: draft
- Paten Sederhana, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Paten Sederhana, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Paten Sederhana, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Hak Cipta, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Hak Cipta, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Hak Cipta, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Merk Dagang, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Merk Dagang, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Merk Dagang, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Rahasia Dagang, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Rahasia Dagang, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Rahasia Dagang, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Desain Produk Industri, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Desain Produk Industri, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Desain Produk Industri, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Indikasi Geografis, tahun ke-1 Target: draft
- Indikasi Geografis, tahun ke-2 Target: draft
- Indikasi Geografis, tahun ke-3 Target: terdaftar/granted
- Perlindungan Varietas Tanaman, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Perlindungan Varietas Tanaman, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Perlindungan Varietas Tanaman, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Perlindungan Topografi Sirkuit , tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Perlindungan Topografi Sirkuit , tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Perlindungan Topografi Sirkuit , tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Teknologi Tepat Guna, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Teknologi Tepat Guna, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Teknologi Tepat Guna, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Model/Purwarupa/Desain/Karya Seni/Rekayasa Sosial, tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Model/Purwarupa/Desain/Karya Seni/Rekayasa Sosial, tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Model/Purwarupa/Desain/Karya Seni/Rekayasa Sosial, tahun ke-3 Target: belum/tidak ada
- Buku Ajar (ISBN), tahun ke-1 Target: belum/tidak ada
- Buku Ajar (ISBN), tahun ke-2 Target: belum/tidak ada
- Buku Ajar (ISBN), tahun ke-3 Target: draft
- Tingkat Kesiapan Teknologi (TKT), tahun ke-1 Target: Skala 7
- Tingkat Kesiapan Teknologi (TKT), tahun ke-2 Target: Skala 7
- Tingkat Kesiapan Teknologi (TKT), tahun ke-3 Target: Skala 7

4
 Novel Nucleic Acid Amplification Test untuk Diagnostik Dini dan Pemetaan
Tuberculosis: Pengembangan dan Aplikasi di Lapangan untuk Deteksi Zoonosis dan
MDR-TB menggunakan Pendekatan One Health

Wayan T. Artama, Abu Tholib Aman, Hery Wijayanto, Dyah Ayu Widiasih

Abstrak

Tuberkulosis (TB) merupakan salah satu penyakit zoonosis yang masih

merupakan masalah utama kesehatan secara global. World Health Organization (WHO)
memperkirakan sepertiga dari populasi dunia yang saat ini berjumlah 7 milyar telah
terinfeksi mycobacterium sp. Penyakit ini merupakan gangguan kesehatan yang sulit di
kendalikan dan masih merupakan penyebab kematian tertinggi dan bahkan merupakan
penyakit opportunistik pada penderita AIDS. Menurut WHO pada tahun 2013
diperkirakan 9 juta orang menderita tuberkulosis dan 1,5 juta meninggal (termasuk
360.000 kematian yang menghidap HIV positif). Kasus kematian TB juga terjadi pada
anak-anak dan dilaporkan terdapat 530.000 kasus TB pada anak yang berusia di bawah
15 tahun dengan kasus kematian sekitar 80.000 per tahunnya. Oleh karena itu suatu
novel DNA amplication test sangat di butuhkan untuk deteksi dini dan mempercepat
dalam mengidentifikasi multi drug resisten dari penderita tuberkulosis.

Novel Nucleic Acid Amplification Test adalah suatu perangkat diagnosis yang berbasis
amplifkasi DNA, di kembangkan untuk mendeteksi tuberkulosis kompleks dari sumber
hewan, satwa liar dan primata serta human TB. Dari penelitian ini diharapkan didapat
suatu perangkat diteksi dini berbasis molekuler yang dapat di gunakan untuk penentuan
prevalensi, pemetaan dan diagnosis dini untuk pengendalian tuberkulosis di Indonesia.

Kata kunci: Tuberkulosis, polymerase chain reaction, molecular diagnostic, nucleic

acid amplification test.

5
 BAB I. PENDAHULUAN

Latar Belakang

Indonesia merupakan negara tropis dengan jumlah penduduk lebih dari 250 juta jiwa
dan merupakan negara berkembang yang memiliki angka kejadian dan kematian akibat
Tuberculosis sangat tinggi, yaitu 535.000 kasus dan merupakan negara dengan jumlah
penderita terbesar ke 4 di dunia, dengan angka kematian mencapai 140.000 orang per
tahunnya. Rendahnya kesadaran hidup bersih dan sehat ditambah dengan biosekuriti
yang kurang memadai di daerah-daerah tertular mengakibatkan masih tingginya
kejadian tuberculosis (TB) di Indonesia. Sampai dengan tahun 2016, baru 53% penderita
yang dapat terdeteksi, artinya hampir separuh belum dapat terdeteksi dan bahkan
belum mendapatkan terapi yang di programkan pemerintah atau belum tersentuh
pengobatan. Sejauh ini Kementerian Kesehatan masih menfokuskan penanganan dan
penanggulangan TB pada manusia dengan angka kesembuhan yang cukup tinggi sekitar
85%. Gagalnya dalam terapi dapat berakibat terjadinya multi drug resistant (MDR),
demikian pula transmisi TB dari hewan ke manusia dan sebaliknya sejauh ini belum
mendapat perhatian dari pihak berwenang. Dalam hal transmisi, tuberkulosis sebagai
salah satu penyakit anthropozoonosis, sangat mungkin terjadi, baik dari hewan ke
manusia maupun sebaliknya, terutama dari satwa primata sebagai satwa yang paling
dekat secara sosial dengan manusia. Interaksi antar manusia dengan satwa liar/ primata
banyak dijumpai dalam kehidupan sehari-hari, baik dilingkungan pemukiman dalam
bentuk pertunjukan topeng monyet dan monyet peliharaan, maupun di lokasi-lokasi
wisata dan kebun binatang. Keberadaan satwa baik di kebun binatang maupun di pitting
farm yang berinteraksi langsung dengan pengunjung masih sulit untuk dicegah oleh
pihak manajemen pengelola wisata menyebabkan terjadinya transmisi TB dari satwa ke
manusia. Dari sisi penanggulangan penyakit terhadap manusianya, Kementerian
Kesehatan dengan dibantu beberapa pendanaan dalam dan luar negeri telah melakukan
antisipasi dengan baik, akan tetapi, kurang/tidak ditanganinya satwa liar/ primata
dengan regulasi yang baik maka dapat menjadi reservoar penularn TB ke manusia.
Satwa di pitting farm biasanya di lepas dan berinteraksi dengan pengunjung yang
menderita TB sehingga menyebakan rantai penularan dari hewan ke manusia atau
sebaliknya. Pengelola wisata yang menonjolkan primata dan satwa liar sebagai daya
tariknya dan mengabaikan kesehatan satwanya akan menyebabkan tingkat kejadian TB
makin tinggi karena satwa sebagai sumber penularan TB luput dari perhatian. Untuk

6
membantu para pelaksana pemerintahan di daerah-daerah yang memiliki lokasi wisata
dengan daya tarik satwa liar/primata maka dalam mengantisipasi dan mendeteksi
kejadian TB secara pasti, perlu dilakukan pengembangan kit diagnostik serta pemetaan
kasus penyakit TB pada satwa liar/primata di Indonesia. Mycobacterium complex yang
paling banyak sebagai penyebab TB pada manusia, primata dan ternak adalah M.
tuberculosa, M. bovis, M. caprae dan M. africanum. Sampai saat ini belum diketahuai
secara pasti spesies mycobacterium yang mana yang paling banyak menyebabkan TB.
Kajian molekuler pada gen 16S rRNA dan gen P PE71 dan multipleks PCR pada
penelitian ini diharapkan dapat mengungkap spesies mycobacterium yang paling banyak
menyebabkan kasus TB. Menurut Han et al. (2009) gen 16S rRNA dapat untuk
klasifikasi Mycobacterium sp. dan menurut McEvoy et al. (2009) gen PPE71 dan PPE38
merupakan fragmen DNA yang variasinya tinggi sehingga dapat untuk membedakan M.
tuberculosa dengan mycobacterium lainnya yang sulit dibedadakan melalui gen 16S
rRNA.
Tuberkulosis pada orang masih merupakan masalah kesehatan dunia dan Indonesia
berada di urutan ke 4 dunia dari 22 negara yang masih memiliki insedensi TB.
Tuberkulosis dianggap sebagai suatu beban bagi pemerintah, dengan perkiraan 450.000
kasus baru per tahunnya. Prevalensi TB di Indonesia adalah 235 per 100.000 penduduk
yang berarti total kasus TB di Indonesia dapat mencapai 800.000- 900.000 kasus. Data
tersebut memperlihatkan tingginya kasus TB, sehingga perlu dilakukan berbagai upaya-
upaya pengendalian melalui deteksi molekuler TB, problem MDR dan masalah
efektivitas vaksinasi TB. Oleh karena itu suatu pendekatan One Health yang
mengedepankan transdisiplin dan kolaborasi multisektoral melalui pendekatan
kesehatan ekosistem, kesehatan hewan dan kesehatan manusianya sehingga tidak terjadi
spill over TB dari satwa liar atau ternak ke manusia. Pengobatan masih menjadi pilihan
utama dalam pemberantasan TB, namun karena timbulnya resistensi obat maka
pemberantasan TB masih menjadi kendala. Meningkatnya kejadian resistensi terhadap
TB mendorong dilakukannya usaha lain seperti deteksi resistensi obat dan vaksinasi.
Satu satunya vaksin TB sampai saat ini adalah Bacillus Calmette Guerin (BCG), suatu
vaksin attenuated bacteria yang berasal dari M.bovis yang telah digunakan sejak tahun
1920. Vaksin BCG telah di ketahui memberikan perlindungan terhadap TB pada anak
anak akan tetapi efektivitas perlindungan pada TB paru paru orang dewasa masih relatif
rendah dan sangat variatif. Pengembangan vaksin untuk mencegah tubrkulosis masih
terus di kembangkan dengan menggunakan protein yang berasal dari M .tuberculosis

7
(Dietrich et al., 2014). Kompleks antigen 85 dari M. tuberculosis merupakan suatu
antigen yang menginduksi kuat imunsistem dan merupakan factor virulensi utama dari
M. tuberculosis dan di perkirakan dapat di gunakan sebagai kandidat vaksin. Antgen 85
merupakan protein kandidat vaksin yang penting dan pada hewan telah memberikan
kekebalan yang protektif terhadap paparan M. tuberculosis (Zarif et al., 2013). Kloning
dan ekspresi gen penyandi antigen 85 memiliki arti strategis untuk imun intervension,
pengembangan diagnostik dini dan kandidat vaksin TB. Memahami biokharakteristik
dan genotyping dari MOTT (Mycobacterium Other Than Tuberculosis), regio resistensi
obat, conserved specific region of gyrB, gyr A, rpo B dan gen virulensi (erp ,fadD28,
(mmpL7) Rv0986-8 virulence operon, Rv0901. Mycobacterium tuberculosis complex
dari beberapa isolat klinis di Indonesia dapat di gunakan sebagai basis pengembangan
molekular diagnostik, target obat dan imunomodulator.
Dengan melibatkan beberapa pemangku kepentingan kesehatan seperti tenaga
kesehatan, ahli satwa liar, primatologis dan berkoordinasi dengan Pemda dan Dinas
Kesehatan Daerah, Dinas Pariwisata maka dapat dilakukan pemetaan TB mengunakan
data dari hasil diagnosa dini yang dikembangkan dalam penelitian ini sehingga dapat
digunakan sebagai dasar pelaksanaan kebijakan terkait penanganan TB. Diharapkan
hasil yang diperoleh nantinya akan dapat dijadikan model penanganan TB oleh
Pemerintah secara nasional.
Tabel 11.1 Rencana Target Capaian Tahunan
No Jenis Luaran
Indikator Capaian
TS1) TS+1 TS+2 TS+n
2) Internasional
1 Publikasi ilmiah
Nasional Terakreditasi
Pemakalah dalam temu Internasional
2
ilmiah3) Nasional
3 Inivited speaker dalam temu Internasional
ilmiah4) Nasional
4 Visiting Lecturer5) Internasional
Paten
Paten sederhana
Hak Cipta
Merek dagang
5 Hak Kekayaan Intelektual Rahasia dagang
(HKI)6) Desain Produk Industri
Indikasi Geografis
Perlindungan Varietas Tanaman
Perlindungan Topografi Sirkuit
Terpadu
6 Teknologi Tepat Guna7)
7 Model/Purwarupa/Desain/Karya seni/ Rekayasa Sosial8)
8 Buku Ajar (ISBN)9)
9 Tingkat Kesiapan Teknologi (TKT)10)

8
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

Tuberkulosis atau TB adalah suatu penyakit infeksi menular pada saluran pernafasan
yang disebabkan oleh infeksi kompleks Mycobacterium tuberculosis. Penyakit ini
merupakan salah satu penyakit tertua yang diketahui menyerang manusia. Tuberkulosis
biasanya menyerang paru (disebut sebagai TB Paru), walaupun pada sepertiga kasus,
organ- organ lain ikut terlibat. Penyakit tuberkulosis dapat menyerang siapa saja (tua,
muda, laki-laki, perempuan, miskin, atau kaya) dan dimana saja. Setiap tahunnya,
Indonesia bertambah dengan seperempat juta kasus TB baru dan sekitar 140.000
kematian terjadi setiap tahunnya disebabkan oleh TB. Bahkan, Indonesia adalah negara
keempat terbesar dengan masalah TB di dunia. Survei prevalensi TB yang dilakukan di
enam propinsi pada tahun 1983-1993 menunjukkan bahwa prevalensi TB di Indonesia
berkisar antara 0,2–0,65%. Sedangkan menurut laporan Penanggulangan TB Global
yang dikeluarkan oleh WHO pada tahun 2004, angka insidensi TB pada tahun 2002
mencapai 555.000 kasus (256 kasus/100.000 penduduk), dan 46% diantaranya
diperkirakan merupakan kasus baru.

Penyebab penyakit ini adalah bakteri kompleks Mycobacterium tuberculosis.

Mycobacteria termasuk dalam famili Mycobacteriaceae dan termasuk dalam ordo
Actinomycetales. Kompleks Mycobacterium tuberculosis meliputi M. tuberculosis, M.
bovis, M. africanum, M. microti, dan M. canettii. Dari beberapa kompleks tersebut, M.
tuberculosis merupakan jenis yang terpenting dan paling sering dijumpai. M.
tuberculosis berbentuk batang, dan bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai
Batang Tahan Asam (BTA), berukuran panjang 5µ dan lebar 3µ, tidak membentuk
spora, dan termasuk bakteri aerob.

Epidemiologi tuberkulosis

Diperkirakan sebanyak 1,1 juta dari 9 juta orang yang menderita TB pada tahun 2013
adalah pasien dengan HIV positif dan 75 % dari kasus ini dilaporkan terjadi di Afrika,
dan 480.000 orang dilaporkan merupakan MDR-TB serta kematian karena MDR-TB
sekitar 170.000 orang (WHO, 2014). Sebagai gambaran dari kejadian tuberkulosis
sebagian besar terjadi di Asia Tenggara dan Asia Barat (56%), 25 % di Afrika, India dan
China dialporkan 24 % dan 11%. Data WHO tahun 2013 menunjukkan bahwa Indonesia
termasuk negara dengan penderita TB yang ke empat setelah India, China, Nigeria,

9
sedang prevalensi TB dengan HIV secara nasional dilaporkan sekitar 0,16% dan MDR-
TB mencapai 2,2 %. Mengingat beban TB begitu tinggi untuk kesehatan nasional maka
MDR-TB yang rata rata di laporkan sebanyak 12.200 kasus muncul setiap tahunnya.
Angka tuberkulosis yang demikian tinggi sebenarnya dapat dicegah jika masyarakat
dapat mengakses layanan kesehatan dan diagnosis dini dari TB sehingga regiment
pengobatan dapat berjalan sesuai dengan program yang di canangkan pemerintah. Pada
tahun 1995 WHO telah merekomendasikan terapi TB dengan strategi Directly Observed
Treatment Shortcourse (DOTS) sebagai strategi pengobatan TB secara internasional
(Rouillon, 2010).

Cara Penularan Penyakit TB

Penyakit TB biasanya menular melalui udara yang tercemar dengan bakteri

Mycobacterium sp yang dilepaskan pada saat penderita TB batuk, dan pada anak-anak
sumber infeksi umumnya berasal dari penderita TB dewasa. Bakteri ini bila sering
masuk dan terkumpul di dalam paru akan berkembang biak menjadi banyak terutama
pada orang dengan imunsistem yang tersupresi serta daya tahan tubuh yang rendah,
sehingga dapat menyebar melalui pembuluh darah atau kelenjar getah bening. Oleh
sebab itulah M. tuberculosis dapat menginfeksi hampir seluruh organ tubuh seperti:
paru, otak, ginjal, saluran pencernaan, tulang, kelenjar getah bening, dan lain-lain.
Meskipun demikian, organ tubuh yang paling sering terkena adalah paru-paru. Satwa
primata memiliki filogeni atau tingkat kekerabatan yang lebih dekat dengan manusia
dibanding hewan lain, oleh karenanya dalam klasifikasi ilmiah atau taksonomi,
keduanya dikelompokkan bersama dalam satu ordo, yaitu Primata. Di samping
menjadikan mereka sebagai hewan yang memiliki posisi penting dan istimewa,
kedekatan kekerabatan antara satwa primata dan manusia sekaligus juga seperti
fenomena pisau bermata dua. Di satu sisi kemiripan keduanya dalam berbagai fungsi
biologis menjadikan mereka sebagai model yang sesuai untuk penelitian bidang
kesehatan manusia, sedang di sisi lain, karena miripnya berbagai fungsi biologis organ
mereka dengan organ manusia maka banyak pula penyakit yang dapat saling ditularkan.
Dari daftar penyakit zoonotik (penyakit yang dapat ditularkan dari hewan ke manusia,
atau sebaliknya), satwa primata menduduki peringkat tertinggi sebagai hewan yang
dapat terinfeksi agen penyebab penyakit yang juga menginfeksi manusia. Tuberkulosis
yang disebabkan oleh infeksi bakteri Mycobacterium sp pada satwa primata merupakan
penyakit anthropozoonosis yang sangat ditakuti.
10
Tuberculosis pada manusia dan primata/satwa liar

Primata sangat rentan terhadap infeksi Mycobacterium melalui aeronasal dan

menyebabkan penyakit dengan gejala klinis yang sangat mirip dengan manusia (human-
like disease), menyebabkan timbulnya respon spesifik limfosit T dan proliferasi
limfosit. Primata susceptible dengan infeksi Mycobacterium avium, M. bovis, M.
tuberculosis, M. africanum, M. gardonae (Murray, 2000).

Diagnosa berbasis Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik amplifikasi atau

perbanyakan DNA dengan ukuran tertentu secara in vitro. Teknik ini dapat dilakukan
karena di temukannya Taq DNA polymerase yang sangat stabil bila melalui mekanisme
perubahan suhu. Polymerase Chain Reaction terdiri dari beberapa tahap yaitu
predenaturasi DNA, denaturasi DNA, penempelan primer (annealing) pada DNA
template, elongasi (extention) dan post elongasi (Sulandari dan Zein, 2003). Metode
PCR memungkinkan deteksi pada jumlah sampel biologis yang terbatas asalkan terdapat
materi genetik di dalamnya.

11
ROAD MAP PENELITIAN -----------------TAHUN ke 1_______________
Identifikasi molekuler M. tuberculosa Profil imunologi dari
kompleks M. tuberculosis
 Isolat Mycobacterium sp.  subklas IgM, IgG
 Identifikasi karackter biologi M. tb  IgA dan Interleukin
 Fungsi Makrofag

Gene Cloning dan ekpresi protein

Molekuler Patogenesis
rekombinan
M.tuberculosis
 Amplifikasi Gen penyandi protein
 Deteksi antigen /
Antigen 85 kompleks
patogen
 Amplifikasi Gen yang bertanggung
 Molecular Apoptosis
jawab pada MDR-Tb (rpoB, gyrA,
 Molecular profiling
gyrB
 Gen penyandi CFP
-----------------------TAHUN ke 2------------------------------------
 Kloning dan Ekspresi gen Penyandi Ag 85 kompleks
 Patogenitas Molekuler M. tuberculosis kompleks
 Ekspresi dan Overexpresi Protein CFP- Rekombinan
 Analisis rpoB, gyr A, gyrB
_____________________________TAHUN ke3____________________

 Pengembangan diagnosis dini TB berbasis DNA

 Penentuan prevalensi TB pada manusia, primata dan satwa liar
 Data base TB di Indonesia
 Pemetaan tuberculosis berbasis GIS
 Pencegahan dan penanganan TB melalui pendekatan One Health
 Gambaran populasi penderita MDR-TB

12
 BAB III. METODE PENELITIAN

Penelitian dilakukan di DIY, Jawa Tengah dan Bali (ketiga daerah dipilih karena
merupakan tujuan wisata utama dan tingginya interaksi antara manusia dan satwa
liar/primata). Kloning serta deteksi TB berbasis DNA di lakukan di Pusat Studi
Bioteknologi, Yogyakarta baik dari hewan maupun manusia.

Populasi, Sampel, Besar Sampel dan Teknik Pengambilan Sampel

Populasi penelitian
Populasi penelitian adalah seluruh penduduk di Jawa Tengah, Daerah Istimewa
Yogyakarta (DIY ) dan Bali yang di sampling secara proporsional dari jumlah penduduk
di wilayah penelitian. Jumlah desa dan kelurahan di wilayah DIY di sampling pada
tahun II, sedang pada tahun III di Provinsi Bali dan Jawa Tengah.

Sampel penelitian
a. Besar sampel
Pedoman WHO untuk masalah kesehatan yang kejadiannya sering (15 % - 85 %),
besar sampel pada penelitian survei adalah 210 sampel tiap kabupaten/kota. Besar
sampel ini dihitung dengan rumus:

Sampel minimal dihitung dengan asumsi proporsi toksoplasmosis adalah 15% atau p
adalah 0,15, q adalah (1-0,5), z untuk α = 5% adalah 1,96 dan d adalah 0,05, maka besar
sampel didapatkan sebesar 196. Untuk memudahkan pengambilan sampel dijadikan 210
sampel yang dibagi untuk 30 klaster atau 7 sampel untuk tiap klaster (Iwan, 1998).

b. Tehnik sampling (Stratified random sampling)

1) Pemilihan klaster (sampling tahap pertama)
Pemilihan klaster mengunakan cara probability proportionate to size atau
probabilitas klaster untuk terpilih harus sesuai dengan besarnya klaster. Wilayah
sampling yang ditetapkan sebagai klaster pada penelitian ini adalah desa untuk
kabupaten dan kelurahan untuk kota. Langkah-langkah pemilihan klaster adalah :
(1) Dibuat kerangka sampel, yaitu daftar yang memuat nama desa/kelurahan berserta
jumlah penduduk masing-masing.

13
(2) Susunan desa/kelurahan dalam daftar kerangka sampel diacak letak urutannya
dengan bantuan program CSURVEY
(3) Penduduk di desa/kelurahan paling atas pada daftar kerangka sampel yang telah
diacak tersebut, diberi nomor urut 1 sampai dengan nomor yang sesuai jumlah
penduduk di desa/kelurahan tersebut.
(4) Nomor urut selanjutnya (nomor urut setelah nomor terakhir yang dipakai untuk
penduduk di kelurahan/desa pertama), sampai dengan nomor urut x (komulatif
jumlah penduduk desa/kelurahan pertama dan kedua dalam daftar kerangka
sampel), diberikan untuk nomor urut penduduk di desa/kelurahan kedua.
(5) Dengan cara yang sama, maka nomor urut penduduk terakhir kelurahan/desa ketiga
adalah komulatif jumlah penduduk desa/kelurahan pertama, kedua dan ketiga.
Pemberian nomor urut dilakukan sampai desa/kelurahan terakhir dalam daftar kerangka
sampel, sehingga nomor urut terakhir penduduk di kabupaten/kota tersebut adalah
nomor urut yang sesuai dengan jumlah penduduk di kabupaten/kota tersebut.

2. Isolasi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan dengan memakai reagent DNAzol extraction (Invitrogen)
sebanyak 1000µl yang dihomogenisasikan dengan 100µl sampel. Campuran tersebut
kemudian disentrifus dengan kecepatan 10.000g selama 10 menit. Bagian supernatant
dipindahkan ke microtube yang baru dan ditambahkan ethanol absolut sebanyak 500µl
untuk mempresipitasi DNA. Asam Nukleat hasil ekstraksi kemudian di-resuspensi
dalam 20µl bufer TE dan disimpan dalam suhu -20oC.
Dekontaminasi menggunakan metode N-acetyl-L-cysteine (NALC)–sodium hydroxide
(NaOH) yang dilakukan pada spesimen paru dan spesimen selain paru seperti urin,
nanah, abses, dan specimen aspirasi. Cairan tubuh steril, CSF dan biopsi tidak
diperlakukan prosedur dekontaminasi dan digunakan langsung untuk protokol ekstraksi.
Lysozyme buffer (300 µl; 300 mg lisozim, 0,1% trition X-100, 10 mM Tris, 1 mM
EDTA, pH 8,0) ditambahkan ke pelet yang telah didekontaminasi dan diinkubasi pada
37°C dalam waterbath selama semalam. DNA diekstraksi dari Lysate menggunakan
QIA amp DNA Mini kit (Qiagen) sesuai dengan instruksi manual procedure.

14
3. Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction dilakukan sesuai dengan standar prosedur dengan
mempertimbangkan temperatur annealing, extension sesuai dengan DNA target sedang
waktu predenaturasi selama 5 menit pada awal siklus sedang waktu denaturasi dari
siklus adalah 1 menit. Profil PCR dilakukan sesuai dengan guideline dari PCR kit. Hasil
molekular diagnosis di lakukan untuk konfirmasi dari uji serologis dari sampel yang
positif.
Polymerase Chain Reaction dilakukan dengan menggunakan IS6110 primer sequence.
50 µl campuran amplifikasi terdiri dari 1xTaq buffer, 4,5 mM MgCl 2, 200 µm dNTP,
0,5 µl Q-solusi, 50 pmol dari ISF, primer ISR, 10 pmol dari INSF dan INSR primer, 20
pmol dari HBGF, HBGR primer dan 1U Hotstar Taq polymerase. Tabel di bawah
menunjukkan sekuen primer dan kondisi siklus PCR. Produk PCR divisualisasikan di
atas 3% gel agarose diwarnai dengan ethidium bromide (Deshmukh, et al., 2013)

4. Nucleic Acid Amplification Test (PCR based)

Ekstraksi DNA dan amplifikasi dilakukan dengan menggunakan Gen eiTM Amplification
Reagent yang ditetapkan untuk MTB (oleh Genei, Bangalore, India) sesuai instruksi
pabrik dengan modifikasi minimal. Sampel didekontaminasi dengan NALC-NaOH
sebagai pengganti penggunaan modifikasi metode Petroff, dan pelet dari semua
spesimen dari pasien tunggal dikumpulkan sehingga untuk mendapatkan pelet tunggal
yang mana akan digunakan untuk NAAT. Sebanyak 3 µl dari sampel DNA ditambahkan
ke 9 µl dari premix amplifikasi pertama. Tes ini didasarkan pada prinsip dari nested

15
PCR yang perbanyakan berulang penyisipan IS6110. Pada langkah pertama, wilayah
IS dari urutan DNA MTB kompleks, 220 bp, diperbanyak oleh primer eksternal tertentu.
Urutan primer eksternal adalah sebagai berikut:
695 to 724 (50-CGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGAC- 30) dan
885 to 914 (50-CATCGTGGAAGCGACCCGCCAGCCCAGGAT-30)
Profil reaksi amplifikasi pertama terdiri dari siklus tahap awal denaturasi pada 22ºC
selama 10 menit dan 94ºC selama 5 menit, diikuti dengan 20 siklus pada 94ºC selama 30
detik (denaturasi), 68ºC selama 1 menit (annealing) dan 72ºC selama 1 menit (ekstensi),
dan siklus ekstensi terakhir 70ºC selama 7 menit. Tabung PCR diangkat dari thermal
cycler ketika sampel suhu sudah mencapai 4ºC dan kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik sebelum pembukaan untuk menghindari
kontaminasi aerosol. Setelah siklus PCR pertama selesai, 15 µl dari amplification
master-mix kedua ditambahkan ke setiap tabung dan NAAT kedua dilakukan. Inner
primer digunakan untuk lebih memperbanyak produk amplifikasi 123 bp. Urutan inner
primer adalah sebagai berikut:
Primer IS1 [50-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-30] dan
Primer IS2 [50-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-30]
Parameter siklus terdiri dari siklus awal pada 94ºC selama 5 menit, pada 94ºC selama
30 detik (denaturasi), 68ºC selama 30 detik (annealing) dan 72ºC selama 30 detik
(ekstensi), sebanyak 30 siklus dan siklus ekstensi terakhir pada 72ºC selama 7 menit.
Paket ini juga mencakup pengendalian internal DNA. Produk yang diperbanyak
dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel. Sebuah band dari 340 bp merupakan
produk amplifikasi pengendalian internal DNA. Produk amplifikasi dengan ukuran 123
bp merupakan indikasi adanya M.tuberculosis. Hasil itu dianggap sebagai positif jika
ada sebuah band baik di 123 bp dan 340 bp atau band hanya pada 123 bp. Jika kehadiran
hanya satu band di 340 bp dianggap negatif. Ekstraksi DNA itu harus diulang jika tidak
ada band sama sekali karena menunjukkan bahwa sampel mengandung inhibitor atau
ekstraksi DNA yang tidak berhasil. Pengolahan ulang sampel tersebut dilakukan dengan
mengulangi prosedur ekstraksi dengan 100 µl DNA (Tiwari et al., 2015).

16
NUCLEIC ACID AMPLIFICATION OF THE rpoB REGION OF Mycobacterium
tuberculosis
Semua sampel di periksa dengan smear, kultur dan PCR. Gold standard kultur
digunakan Lowenstein-Jensen media, sedang target gen resisten diamplifikasi
menggunakan PCR primers rpoB rpoB-F (5'-TCGGCGAGCCCATCACGTCG-3') dan
rpoB-R (5'-GCGTACACCGA-CAGCGAGCC-3') dengan target amplicon PCR 541 bp.
Sputum sampel terlebih dahulu di dekontaminasi menggunakan Petroff alkali (WHO),
dan selanjunya pelet dilarutkan dalam 1 ml. Dari suspensi tersebut di ambil 200 ul untuk
di kultur (Duplo) dan di inkubasi di CO2 inkubator selama 2-8 minngu. Setelah 8
minggu maka koloni tampak tumbuh. Pelet bakteri dapat di tumbuhkan pada kultur.
serta di PCR. Ekstraksi DNA dilakukan menggunakan metode boiling method. Nucleic
acid Amplifikasi DNA di lakukan sebanyak 35 siklus dengan profil amplifikasi: pre-
denaturasi (98 ºC, 5 min), denaturasi (96 ºC, 1 min), annealing (62 º C, 1 min),
extension (72 ºC, 1 min) dan post extension (72 ºC, 10 min). Produk amplifikasi di
elektroforesis dan hasil dapat di baca. Analisis dari test dapat di plot pada tabel 2x2 dan
di lakukan perhitungan nilai sensitivitas, specifitas, positive predictive value, negative
predictive value dan ketepatan nilai PCR dengan menggunakan kultur sebagai standar
baku.

3. DNA Sequencing
DNA rekombinan dipurifikasi dengan menggunakan Qiagen column dan
selanjutnya sequen DNA ditentukan menggunakan metode dideoksi.

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan salah satu metode
pengujian untuk menegakkan diagnosis bila menggunakan protein rekombinan spesifik
tuberculosis secara imunologis.

Prinsip
Tahap reaksi imunologis yaitu reaksi antara antigen dengan antibodi (Ab) yang
dilabel ensim (Ab-E=konjugat) sehingga terbentuk kompleks Ag-Ab, atau sebaliknya.
Kompleks Ag-Ab-E yang terbentuk kemudian dipisahkan dari Ag dan Ab yang bebas.
Selanjutnya tahap reaksi enzimatis yaitu kompleks Ag-Ab-E ini kemudian
diinkubasikan dengan substrat khromogenik yang mula-mula tidak berwarna, tetapi

17
kemudian berwarna apabila dihidrolisis oleh enzim. Intensitas warna yang terbentuk
diukur dengan spektrofotometer. Pada metode ini diperlukan pemisahan antara konjugat
yang bebas dengan yang terikat dengan jalan pencucian beberapa kali untuk
menghilangkan reaksi non spesifik.

Komponen ELISA
Fase padat dibutuhkan untuk memungkinkan perbedaan diantara yang terikat
dengan yang bebas. Beberapa pilihan senyawa yang dapat digunakan sebagai fase padat
misalnya polyprophyline atau polysterol. Plastik sebagai bahan microplate telah banyak
dikembangkan oleh beberapa industri, sehingga permukaannya mempunyai kemampuan
untuk mengabsorbsi antigen maupun antibodi dengan lebih baik. Antigen atau antibodi
dapat secara pasif terabsorbsi pada permukaan mikroplate. Keragaman dapat terjadi
karena perbedaan pH, kekuatan ion, komposisi bufer. Protein teradsorbsi pada fase
padat dengan kecepatan dan tingkatan yang ditentukan oleh koefisien difusi molekul
yang mengabsorbsinya, perbandingan antara luas permukaan yang akan dilapisi dengan
volume larutan pelapis, konsentrasi senyawa pengabsorbsi, suhu, dan lama reaksi
adsorbsi.
Tidak semua antigen terikat pada fase padat, sehingga diperlukan pereaksi
pemblok untuk mengisi tempat-tempat fase padat yang tidak diikat oleh antigen dengan
tujuan mencegah pengikatan non spesifik. Bahan yang sering dipakai sebagai pemblok
pada uji serologis dengan metode ELISA adalah bovine serum albumin (BSA).

Larutan penyangga dan larutan pencuci

Pemilihan bufer berpengaruh terhadap hasil pengujian. Larutan pencuci
mengandung deterjen yang berfungsi mengurangi reaksi pengikatan non spesifik.
Larutan pencuci diperlukan untuk menghilangkan semua materi dari luar dan yang
molekul yang tidak terikat pada matrik padat. Hal ini dapat menimbulkan masalah
penting karena kebanyakan plastik bermuatan negatif pada permukaannya, yang
mengakibatkan terbentuknya ion difus sehingga ikatan matriks dengan protein tidak
terganggu. Tergantung kepada sifat plastik dan bahan yang harus dihilangkan, mungkin
diperlukan pencucian yang berulang dan lama untuk menghilangkan ikatan non spesifik
(3-4 x pencucian).
Komponen bufer pencuci harus cukup kuat, namun tidak menyebabkan
denaturasi imunoreaktan dan juga tidak merusak ikatan antara matrik padat dengan

18
antigen atau antibodi. Bufer pencuci yang paling umum adalah phosphate buffered
saline ditambah deterjen non-ion, biasanya Triton X-100 pada konsentrasi 0,05%.

Konjugat
Konjugat terdiri dari antibodi anti spesies yang dilabel enzim. Antibodi yang
dipakai Anti human IgG dan Anti human IgM yang dilabel enzim alkaline phosphatase
dan Rabbit anti goat IgG serta anti bovine IgG alkaline phosphatase conjugated.

Substrat
Substrat yang digunakan substrat khromogenik yang mula-mula tidak berwarna,
tetapi kemudian berwarna jika dihidrolisis oleh enzim. Substrat harus memenuhi syarat
stabil, mudah larut sebelum dan sesudah dihidrolisis, tidak berwarna sebelum
dihidrolisis, berwarna setelah dihidrolisis dan dapat diukur pada panjang gelombang
yang sesuai. Pada kondisi optimum akan dihasilkan absorbansi maksimum dengan
pemakaian jumlah minimal pereaksi. Masing-masing molekul enzim memiliki satu atau
lebih sisi aktif tempat substrat terikat untuk membentuk kompleks enzim substrat, yang
menghasilkan produk reaksi dan membentuk kembali enzim bebas. Satu molekul enzim
mempunyai kemampuan untuk memecah beberapa molekul substrat. Konsentrasi
substrat seharusnya berlabihan sehingga banyaknya enzim yang ada merupakan faktor
pembatas reaksi.

Pembacaan hasil
Hidrolisis substrat oleh enzim berlangsung sampai terjadi suatu kesetimbangan.
Untuk menghentikan reaksi hidrolisis tersebut ditambahkan larutan penyetop yaitu
H2SO4 5%, sehingga penambahan larutan ini harus tepat pada waktunya. Pembacaan
hasil pengujian yaitu dengan mengamati substrat yang mengalami hidrolisis digunakan
ELISA spektrometer.

19
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim,2006.http://aapredbook.aappublications.org/cgi/content/full/2006/1/3.136#Clini
cal_Manifestations

Artama, W.T., Yulia Sari, Subekti D.T., dan Soenarwan H.P., 2006, Kloning dan
Identifikasi cDNA Penyandi Protein roptri 2, J.Indonesian Biotech.,

20
Format Ringkasan Anggaran Biaya Penelitian Fundamental yang Diajukan Setiap
Tahun

Biaya yang Diusulkan (Rp)

No Jenis Pengeluaran Tahun Tahun Tahun
ke-1 ke-2 ke-3
1 Honorarium untuk pelaksana,
petugas laboratorium,
pengumpul data, pengolah data, Rp. Rp. Rp.
penganalisis data, honor 60,000,000 60,000,000 60,000,000
operator, dan honor pembuatan
sistem
2 Pembelian bahan habis pakai
untuk ATK, fotocopy, surat
menyurat, penyusunan laporan, Rp. Rp. Rp.
cetak, penjilidan laporan, 60,000,000 60,000,000 60,000,000
publikasi, pulsa, internet, bahan
laboratorium, langganan jurnal
3 Perjalanan untuk biaya
survey/sampling data,
Rp. Rp. Rp.
seminar/workshop DN-LN,
40,000,000 40,000,000 40,000,000
biatya akomodasi-konsumsi,
perdiem/lumpsum, transport
4 Sewa untuk
peralatan/mesin/ruang
Rp. Rp. Rp.
laboratorium, kendaraan, kebun
40,000,000 40,000,000 40,000,000
percobaan, peralatan penunjang
penelitian lainnya

LAMPIRAN 1. JUSTIFIKASI ANGGARAN PENELITIAN

21
Rekapitulasi biaya yang diusulkan
No Uraian Jumlah (Rp)
1 Honor 61,520,000
2 Peralatan Penunjang 40,000,000
(Sewa Peralatan)
3 Bahan Habis Pakai 69,680,000
4 Perjalanan 28,860,000
Jumlah 200,060,000

1.    Honor

Honor/Jam Waktu Honor per Tahun

(Rp) (jam/minggu) (Rp)
Th I Th II Th III
Honor     Minggu
Ketua 50,000 16,800,000 28 16,800,0 16,800,0 16,800,0
00 00 00
Anggota 1 30,000 9,240,000 28 9,240,00 9,240,00 9,240,00
0 0 0
Anggota 2 30,000 9,240,000 28 9,240,00 9,240,00 9,240,00
0 0 0
Anggota 3 30,000 9,240,000 28 9,240,0 9,240,0 9,240,0
00 00 00
Asisten Peneliti 25,000 7,000,000 28 7,000,0 7,000,0 7,000,0
00 00 00
Administrasi 25,000 7,000,000 28 7,000,0 7,000,0 7,000,0
00 00 00
Petugas Lapangan I 750,000 10 750,0 750,0 750,0
15,000 00 00 00
Petugas Lapangan II 750,000 10 750,0 750,0 750,0
15,000 00 00 00
Petugas Lapangan III 750,000 10 750,0 750,0 750,0
15,000 00 00 00
Petugas Lapangan IV 750,000 10 750,0 750,0 750,0
15,000 00 00 00
SUB TOTAL (Rp) 61,520,0 61,520,0 61,520,0
00 00 00
2.    Peralatan penunjang (Sewa Peralatan)

Justifikasi Harga Peralatan

Pemakaian Penunjang (Rp)
Harga satuan
Th I Th II Th III
Material   Kuantitas (Rp.)
Sewa Thermocycler Amplifikasi DNA 1 paket 1,000, 15,000 15,000 15,000
000 ,000 ,000 ,000
Sewa Elektroforesis Analisis DNA 1 paket 1,000, 15,000 15,000 15,000
000 ,000 ,000 ,000
Pembuatan peta 5,000,0 10,000, 10,000, 10,000,
Analisis GIS penyakit 1 paket 00 000 000 000
SUB TOTAL (Rp) 40,000, 40,000, 40,000,
000 000 000
3.    Bahan Habis Pakai, Laporan, dan Publikasi

Justifikasi Harga Biaya per Tahun (Rp)

Th I Th II Th III
Material Pemakaian Kuantitas Satuan (Rp)
Ni-NTA (Invitrogen) Isolasi DNA 1 kit 7,000,0 7,000,0 7,000,0 7,000,0
00 00 00 00

Primer Amplifikasi DNA 4 pasang 700,0 2,800,0 2,800,0 2,800,0

00 00 00 00
Agarosa SeaKem Analisis DNA 100 gram 425,0 42,500,0 42,500,0 42,500,0
00 00 00 00
Yellow tip Pipeting 2 box 250,0 500,0 500,0 500,0
00 00 00 00
White tip Pipeting 2 box 500,0 1,000, 1,000, 1,000,
00 000 000 000
Blue tip Pipeting 2 box 250,0 500,0 500,0 500,0
00 00 00 00
Buffer TBE Pelarut 3 liter 1,100, 3,300,0 3,300,0 3,300,0
000 00 00 00
Eppendorf 1,5ml Penyimpanan serum 2 box 590,0 1,180, 1,180, 1,180,
00 000 000 000
eppendorf 0,2ml Penyimpanan serum 5 box 600,0 3,000,0 3,000,0 3,000,0
00 00 00 00
Gloves Perlindungan tangan 10 box 40, 400,0 400,0 400,0
000 00 00 00
PCR kit konfirmasi diagnosis 1 kit 3,300,0 3,300,0 3,300,0
00 3,300,000 00 00
Laporan bendel laporan 5 eks 200,0 1,000, 1,000, 1,000,

22
 00 000 000 000
5,000,0 5,000,0 5,000,0 5,000,0
Publikasi Jurnal terakreditasi 1 jurnal 00 00 00 00
Surat-menyurat, 1,500, 1,500, 1,500, 1,500,
Administrasi telepon, fax, Fotokopi 1 paket 000 000 000 000
SUB TOTAL (Rp) 69,680,000 69,680,000 69,680,000
4.    Perjalanan
Harga Th I Th II Th III
Kuant Satuan Biaya per
Material Justifikasi itas (Rp) Tahun (Rp)
sewa kendaraan DIY Komunikasi dan 1 ok 700,000 700,000 700,000 700,000
koordinasi
sewa kendaraan DIY Survei dan sampling 2  keg 700,000 1,400,000 1,400,000 1,400,000
Lumpsum DIY Survei dan sampling 10 keg 150,000 1,500,000 1,200,000 1,200,000
sewa kendaraan Jateng Komunikasi dan 1 ok 700,000 700,000 700,000 700,000
koordinasi
sewa kendaraan Jateng Survei dan sampling 2  keg 700,000 1,400,000 1,400,000 1,400,000

Lumpsum Jateng Survei dan sampling 8 keg 370,000 2,960,000 2,960,000 2,960,000
Tiket Bali PP Survei dan sampling 8 keg 1,750,000 14,000,000 14,000,000 14,000,000

sewa kendaraan Bali Survei dan sampling 2 keg 700,000 1,400,000 1,400,000 1,400,000

Lumpsum Bali Survei dan sampling 10 ok  480,000  4,800,000  4,800,000  4,800,000

SUB TOTAL (Rp)
28,860,000 28,860,000 28,860,000
TOTAL
200,060,000 200,060,000 200,060,000

LAMPIRAN 2. SARANA DAN PRASARANA

23
 Sarana dan fasilitas laboratorium yang diperlukan lengkap dan menunjang
seratus persen kegiatan penelitian ini:
1. Laboratorium:
Laboratorium Biokimia Bioteknologi UGM dan Lab Mikrobiologi FK, UGM
2. Peralatan Utama yang dimiliki:
1. Centrifuge
2. Refrigerator
3. Bio Freezer
4. Elektroforesis apparatus
5. Power Supply
6. Termocycler
7. Spektrofotometer
8. Shaking incubator
9. Gene pulser
10. Software GIS
3. Sarana Penunjang:
1. Waterbath
2. Photo mikroskope
3. UV transiluminator
4. Laminar air flow

24
LAMPIRAN 3. SUSUNAN ORGANISASI, TUGAS DAN PEMBAGIAN WAKTU
KETUA DAN ANGGOTA TIM PENELITI, SERTA
MAHASISWA PASCASARJANA

No. Nama Jabatan Dalam Tim Tugas Penelitian

NIP/NRP Alokasi Waktu, (Diuraikan dengan
Jam/Minggu rinci)
1. Prof. Dr. Drh. Wayan T. Ketua Tim Peneliti Kloning dan Over
Artama Expresi cDNA
195308181979031002 10 jam/minggu
Penyandi Protein Ag
85 dan CFP.
2. Dr. dr. Abu Tholib Aman, Anggota Peneliti Surveillance dan
SpM. Analisis Sampel
196110201988111001 10 jam/minggu
3. Dr. Drh.Hery Wijayanto Anggota Peneliti Pengambilan sampel
196306281990031001 10 jam/minggu
satwa liar dan primata,
Pemetaan TB,
4 Dr. Drh. Dyah Ayu Widiasih Peneliti Analasis GIS,
196903201997032001 10 jam/minggu
Sekuensing DNA dan
Purifikasi Protein
5. Drh. Aria Ika Septana, MVPH Asisten peneliti Mengatur managemen
10 jam/minggu
penelitian dan
survelance
6. Drh. Medinia Purwaningrum, Admin penelitian Managemen
M.Sc administrasi logistik
10 jam/minggu
dan keuangan
penelitian,
Surveilance,

25
LAMPIRAN 4. BIODATA DAN PERNYATAAN KESEDIAAN IKUT SERTA
PENELITIAN DARI KETUA, ANGGOTA DAN MAHASISWA
PASCASARJANA
KETUA PENELITIAN
I. IDENTITAS DIRI
1.1. Nama Lengkap (dengan Prof. Dr. Drh. Wayan T. Artama
gelar) L/P
1.2. Jabatan Fungsional Guru Besar
1.3. NIP 195308181979031002
1.4. Tempat dan Tanggal Lahir Yogyakarta, 18 Agustus 1953
1.5. Alamat Rumah Bakungan, Wedomartani, Ngemplak, Sleman
Yogyakarta
1.6. Nomor Telepon/Fax 0274-560862
1.7. Nomor HP 0816686274
1.8. Alamat Kantor FKH UGM, Jl. Fauna 2, Karangmalang, Yk
1.9. Nomor Telepon/Fax 0274-560862/0274-560861
1.10. Alamat e-mail artama@ugm.ac.id
1.11. Lulusan yg telah dihasilkan S-1= 40 orang; S-2= 43 orang; S-3= 18
orang
1.12 Mata Kuliah yg diampu 1. Biokimia
2. One Health/Ecohealth,
3. Bioteknologi

II. RIWAYAT PENDIDIKAN

2.1. Program: S1 S3
2.2. Nama PT FKH-UGM Free Universitat Berlin
Germany
2.3. Bidang Ilmu Kedokteran Hewan Kedokteran Hewan
2.4. Tahun Masuk 1973 1984
2.5. Tahun Lulus 1979 1989
2.6. Judul Skripsi/ Peran kulit Maja pada Jantung Characterization VSG
Tesis/Disertasi Epitopes T. congolense using
Monoclonal Antibodi
2.7. Nama Pembim- drh. Susapto Dirdjosudjono, Prof. H.J. Risse
bing/ Promotor M.Sc.

III. PENGALAMAN PENELITIAN (bukan skripsi, tesis, maupun disertasi) sesuai

dengan riset yang disulkan
No Tahun Judul Penelitian Pendanaan
Sumber Jml (Juta

26
 Rp)
1. 2007 Kloning, Ekspresi Gen Penyand Protein KKP3T 194.750.000
Excretory Secretory Antigen (ESAs) Deptan
dan Aplikasi Protein Rekombinan
Untuk Menentukan Prevalensi
Toksoplasmosis pada Sapi, Kambing,
dan Domba di Indonesia
2. 2007 Kloning dan Over Ekspresi Gen Hibah Pasca 54.910.000
Penyandi Protein ESA (Excretory- sarjana
Secretory Antigens) Takizoit (HPTP)
Toxoplasma gondii Isolat Lokal
3 2008 Kloning dan Over Ekspresi Gen Dikti 100.000.000
Penyandi Protein ESA T. gondii
4. 2009 Animal Toxoplasmosis di Indonesia Deptan 180.000.000
5. 2010 Penanggulangan dan Pengembangan Dikti Hikom 300.000.000
Diagnostik Toksoplasmosis berbasis
Protein Rekombinan
6 2014- Penentuan Prevalensi Toxoplasmosis PUPT 450.000.000
2016 berbasis Protein rekombinan dan
Analisis spatial Toksoplasmosis
menggunakan GIS pada Manusia dan
Ruminansia di Indonesia dengan
Pendekatan EcoHealth
7 2014 Eksplorasi Biokarakteristik Bakteri Rusnas 250.000.000
Mycobacteria untuk Pengembangan (anggota)
 Diagnostik dan Vaksin TB
Pemanfaatan pada Pengendalian
Tuberkulosis

IV. PENGALAMAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKAT (bukan skripsi, tesis,

maupun disertasi)
No Tahun Judul Pengabdian Pendanaan
Sumber Jml (Juta Rp)
1. 2011 Toksoplasmosis pada Hewan Fakultas 5.000.000

VI. PENGALAMAN PENULISAN BUKU

27
 No. Tahun Judul Buku Jumlah Penerbit
Halaman
1. 2012 Molekuler Biologi 73 Inpres

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggung jawabkan secara hukum. Dan apabila dikemudian hari ternyata dijumpai
ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima resikonya.

Dengan demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi persyaratan
sebagai salah satu syarat pengajuan hibah penelitian riset unggulan.

Yogyakarta, 6 Juni 2016

Pengusul,

Prof. Dr. drh. Wayan T. Artama

NIP. 195308181979031002

ANGGOTA PENELITI I
1. Nama : Dr. dr. Abu Tholib Aman, SpM.
2. Tempat dan Tanggal lahir : Yogyakarta, 2 Januari 1961
3. Program Studi : Kedokteran
Fakultas : Kedokteran
Perguruan Tinggi : Universitas Gadjah Mada
4. Alamat : Jl. Teknika Utara, Barek Yogyakarta, 55281
No. Telpon/Fax : (0274) 560300
HP : 0815788000042
5. Status Akademik : () Dosen Pembimbing
( ) Mahasiswa S-2/S-3
6. Nama Jabatan Struktural : Lektor Kepala
7. Pendidikan Terakhir : S-3
8. Mata Kuliah yang Diampu : Mikrobiologi
9. Pengalaman Penelitian :

28
 No Judul Riset Tahun
1. Deletion of icaADBC genes in clinical isolates Staphylococcus 2006
epidermidis on phenotypic switching strains
2. recA mediated spontaneous deletions of the icaADBC operon of 2008
clinical Staphylococcus epidermidis isolates: a new mechanism
of phenotypic variations
3. Spontaneous deletion of the icaADBC operon in clinical 2008
Staphylococcus epidermidis isolates; the possible role of lex A
in phenotypic variation
4. Antagonism Properties of Indigenous Probiotic Isolated from 2009
Traditional Fermented Foods Againts Diarrhoeal Pathogens.
International Symposium on Probiotic from Asian Traditional
Fermented Foods for Healthy Gut Function. Regional Center for
Community Nutrition (RCCN)
5. Economic evaluation of a routine rotavirus vaccination 2009
programme in Indonesia
6. Rotavirus surveillance to determine disease burden and 2009
epidemiology in Java, Indonesia August 2001 trough April 2004
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggung jawabkan secara hukum. Dan apabila dikemudian hari ternyata dijumpai
ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima resikonya.

Dengan ini, saya menyatakan bersedia dengan ikut serta dalam Tim Peneliti dengan
tugas dan waktu sesuai diuraikan dalam lampiran 3. Apabila saya tidak memenuhi
kesediaan ini, saya bersedia diberhentikan dari keanggotaan Tim Peneliti.

Yogyakarta, 6 Juni 2016

Anggota,

Dr. dr. Abu Tholib Aman, SpM.

NIP. 196110201988111001

29
ANGGOTA PENELITI II
1. Nama : Dr. Drh. Hery Wijayanto, MP
2. Tempat dan Tanggal lahir : 28 Juni 1963
3. Program Studi : Kedokteran Hewan
Fakultas : Kedokteran Hewan
Perguruan Tinggi : Universitas Gadjah Mada
4. Alamat : Jl. Fauna No. 2 Karangmalang, Yogyakarta.
55281
No. Telpon/Fax : 0274-560862
HP : 085729330767
5. Status Akademik : ( ) Dosen Pembimbing
( ) Mahasiswa S-2/S-3
6. Nama Jabatan Struktural : Lektor kepala
7. Pendidikan Terakhir : S-3
8. Mata Kuliah yang Diampu : Anatomi dan Primatologi
9. Pengalaman Penelitian :
No Judul Riset Tahun
1. Molecular phylogenetic analyses of subspecific relationships 2004
in agile gibbons (Hylobates agilis) using mitochondrial and
TSPY gene sequences.
2. Patterns of C-heterochromatin and telomeric DNA in two 2005
representative groups of small apes, the genera Hylobates and

30
 Symphalangus.
3. Kajian keragaman genetik gen penyandi ATP syntethase sub- 2012
unit 6 (ATP6) mitokondriapada Tarsius sp.
4. Keragamangenetik sekuen gen ATP synthase FO sub-unit 6 2012
(ATP6) monyet hantu (Tarsius) Indonesia
5. The Correlation between Femur and Humerus Length, Carpal 2014
Tarsal, and Sole Circumferences with the Main Body Size of
Sumatran Elephants (Elephas maximus Sumatranus)
6. Behavior Distortion Of Long-Tailed Macaque And Conflict 2015
Occured In Kaliurang, Yogyakarta
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggung jawabkan secara hukum. Dan apabila dikemudian hari ternyata dijumpai
ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima resikonya.

Dengan ini, saya menyatakan bersedia dengan ikut serta dalam Tim Peneliti dengan
tugas dan waktu sesuai diuraikan dalam lampiran 3. Apabila saya tidak memenuhi
kesediaan ini, saya bersedia diberhentikan dari keanggotaan Tim Peneliti.

Yogyakarta, 6 Juni 2016

Anggota,

Dr. Drh. Hery Wijayanto, M. P

NIP. 196306281990031001

31
ANGGOTA PENELITI III
1. Nama : Dr. Drh. Dyah Ayu Widiasih
2. Tempat dan Tanggal lahir : 20 Maret 1969
3. Program Studi : Kedokteran Hewan
Fakultas : Kedokteran Hewan
Perguruan Tinggi : Universitas Gadjah Mada
4. Alamat : Departemen Kesehatan Masyarakat Veteriner,
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas
Gadjah Mada
Jl. Fauna 2, Karang Malang, Yogyakarta
No. Telpon/Fax : 0274-560866
HP : 081578843329
5. Status Akademik : ( ) Dosen Pembimbing
( ) Mahasiswa S-2/S-3
6. Nama Jabatan Struktural : Lektor
7. Pendidikan Terakhir : S-3
8. Mata Kuliah yang Diampu : Ilmu Kesehatan Masyarakat Veteriner (D-3)
Kesejahteraan Hewan (S-1)
Higiene Veteriner (Blok 14, S-1)
Unggas (Blok 21, S-1)
Akuatik dan Satwa Liar (Blok 22, S-1)
Kedokteran Populasi (Blok 23, S-1)
HACCP (Blok 24, S-1)
Kekarantinaan (Blok 24, S-1)
Epidemiologi Penyakit Infeksi (S-2)
Mikrobiologi Makanan (S-3)
9. Pengalaman Penelitian :
No Judul Riset Tahun
1 Kajian Cemaran terduga Shiga toxin-producing Escherichia coli 2008
(STEC) O157 dan nir- STEC O157 pada Susu

32
 2 Kajian Cemaran terduga Shiga toxin-producing Escherichia coli 2009
(STEC) O157 dan Staphylococcus aureus pada Susu di wilayah
Yogyakarta
3 Isolasi dan Uji kepekaan Escherichia coli O157:H7 Isolat Lokal 2010
Asal Feses Sapi Terhadap Berbagai Jenis Antibiotika.
4 Genetic Diversity of Escherichia coli O157:H7 Using Random 2012
Amplified Polymorphic DNA (RAPD).
5 Protein profile analysis of Escherichia coli O157:H7 from human 2013
anmd animals origin.
6 Evaluation of Zoonotic Potency of Escherichia coli O157:H7 2014
through Arbitrarily Primed PCR Methode.

Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggung jawabkan secara hukum. Dan apabila dikemudian hari ternyata dijumpai
ketidak sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima resikonya.

Dengan ini, saya menyatakan bersedia dengan ikut serta dalam Tim Peneliti dengan
tugas dan waktu sesuai diuraikan dalam lampiran 3. Apabila saya tidak memenuhi
kesediaan ini, saya bersedia diberhentikan dari keanggotaan Tim Peneliti.

Yogyakarta, 6 Juni 2016

Anggota,

Dr. Drh. Dyah Ayu Widiasih

NIP. 196903201997032001

33
 Lampiran 5. JADWAL PENELITIAN

Tahun URAIAN JADWAL Bulan Ke-

PENELITIAN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Kpersiapan
Koleksi sampel, solasi DNA
dan amplifikasi DNA
Sampling, seroprevalensi,
Isolasi DNA, Amplifikasi
I
dengan PCR dan Analisis Data
Molecular Cloning
menggunakan PET-Sumo

Identifikasi klon, over ekspresi

Seroprevalensi, Amplifikasi
dengan PCR (nested) dan
II Analisis Data dan analisis risiko
Over Ekspresi Protein untuk
persiapan kit
Peta TB di DIY Jawa Tengah
dan Bali
III Prevalensi dan Pemetaan TB
di lokasi penelitian human.
satwa, primata
Pembuatan Laporan

2. DUKUNGAN TERHADAP PELAKSANAAN PENELITIAN

1.1. Dukungan aktif yang sedang berjalan: Tidak ada
1.2. Dukungan yang sedang dalam tahap pertimbangan: Tidak ada
1.3. Proposal yang sedang direncanakan dalam taraf persiapan: Tidak ada

Lampiran 6. Surat Pernyataan Ketua Peneliti

34
35