Rangkuman Praktikum Biokimia

1. Percobaan Lipid
A. Isolasi Lipid
Digunakan kuning telur
Pelarut digunakan : campuran etanol : eter  Pada endapan ada senyawa nonlipid,
sedangkan filtrat lipid.

Lalu pada residu ditambahkan eter agar lipid larut. Setelah itu fungsi penambahan
aseton merubah kepolaran, sehingga lipid polar mengendapkan lesitin.

Kemudian terjadi reaksi penyabunan saat penambahan KOH dalam alkohol pada
filtrat. Hanya trigliserida yang dapat bereaksi. Sehingga tersisa kolesterol. Pada
saat ditambahkan air, kolesterol mengendap karena kolesterol non polar.

Reaksi Penyabunan

B. Tes Kualitatif Lipid

1. Uji Kelarutan
Prinsip : perbedaan kepolaran
Kalo terpisah berarti minyak tidak larut.

2. Uji Emulsi
Fosfolipid memiliki bagian nonpolar dan polar. Memiliki kemampuan sebagai
emulsifier.Lesitin Merupakan emulsifier karena membuat minyak dan air lama
terpisah.

Emulsifier Lecithin
3. Penyabunan

PRAKTIKUM BIOKIMIA 1
 Penambahan Asam  mengubah menjadi asam lemak. bebas Garamnya lebih
polar sedangkan asam lemaknya nonpolar. Penambahan eter untuk
memisahkan campuran polar dan nonpolar.

4. Uji Gliserol
Muncul bau acrolein (senyawa karsinogenik) terbentuk di minyak jelantah
yang dipakai berulang.

5. Uji Fosfat dan Fosfolipid

Asam askorbat berfungsi sebagai pereduksi. Kalo terbentuk ammonium
fosfomolibdat cairan akan berwarna biru.

6. Tes Lieberman dan Salkoswki  Untuk uji sterol

Bedanya : pada salkoswski tidak ditambahkan asam asetat anhidrida dan
H2SO4

C. Uji Kuantitatif
1. Penentuan Angka asam  menentukan banyaknya asam lemak bebas dalam
sampel minyak. Untuk menentukan kualitas minyak. Jika angka asam tinggi
kualitas minyak buruk.
Angka asam  mg KOH yang digunakan untuk menetralkan asam lemak
bebas dalam sampel minyak

Makin banyak NaOH yang digunakan untuk titrasi maka asam lemaknya
banyak. Indikator PP (merah muda)

2. Penenetuan Angka Penyabunan  mg KOH yang digunakan untuk

menyabunkan/menetralkan asam lemak bebas maupun terikat(triasilgliserol).
Digunakan indicator PP (Merah muda). Pemanasan dilakukan agar terjadi
reaksi hidrolisis.

Angka penyabunan digunakan untuk membandingkan berat molekul rata-rata

suatu minyak.
Angka penyabunan menunjukkan berat molekul lemak dan minyak secara
kasar. Minyak yang disusun oleh asam lemak berantai karbon yang pendek
berarti mempunyai berat molekul yang relatif kecil, akan mempunyai angka
penyabunan yang besar dan sebaliknya bila minyak mempunyai berat molekul
yang besar, maka angka penyabunan relatif kecil.

PRAKTIKUM BIOKIMIA 2
 3. Penentuan Angka Iodium untuk memperkirakan banyaknya ikatan rangkap
pada lemak atau minyak. Prinsip reaksinya : Adisi. Jika ikatan rangkapnya
banyak makai odium yang diserap makin banyak.

Penyemprotan dinding Erlenmeyer dengan air panas kenapa didihkan supaya

bebas NH3. Dititrasi dengan Na Tio-sulfat sampai warna kuning (reaksinya
redoks). Kanji menyerap iodium, sehingga yang dititrasi kanji sisa.

Angka iodium dapat menentukan ketahanan minyak terhadap oksidasi. Makin

tinggi angka iodium maka semakin banyak ikatan rangkap.

4. Penentuan Angka peroksida minyak yang belum sepenuhnya teroksidasi

membentuk hidroperoksida. Digunakan pelarut n Heksana (non polar).
Terjadi 2 lapisan : lapisan bawah dibaca dengan spektrofotometer.

Makin tinggi nilai peroksida menunjukan minyak sudah teroksidasi cukup

banyak.

5. Penentuan bilangan TBA  Hasil oksidasi lipid ditentukan sebagai lipid yang
sudah mengalami pemutusan rantai hingga menghasilkan aldehid.

Ciri bilangan TBA yang tinggi , bau minyak sangat tidak enak karena
mengandung aldehid.

2. Percobaan Enzim
Bahan 2 enzim : Polifenol Oksidase (diisolasi dari kentang) dan Enzim alfa Amilase
(dari saliva)
1. Isolasi Enzim PFO (Polifenol Oksidase)
Penyebab reaksi pencoklatan dalam buah, sayur dan umbi-umbian.
Nama lain : fenol oksidase, enolase, tyrosinase,dopa oksidase, dan katekhol
oksidase

PFO mengkatalisis 2 macam reaksi :

a. Hidroksilasi senyawa monofenol menjadi difenol pada posisi ortho, oleh
enzim kresolase
b. Oksidasi ortho difenol menjadi quinon dengan enzim kathekolase.

Untuk isolasi enzim dari jaringan hidup harus dilakukan pada suhu dingin, karena
terdapat enzim lain pada jaringan hidup yaitu protease yang berfungsi menghidrolisis
protein. Enzim PFO akan terhidrolisis oleh protease. Karena protease tidak aktif pada
suhu dingin.

Enzim PFO larut dalam pelarut buffer atau air.

2. Penentuan Aktivitas PFO

Aktivitas enzim dihentikan dengan pemanasan pada air mendidih.

Aktivitas PFO = selisih antara absorbansi sampel & control

Aktivitas = absorbansi sampel – absorbansi (K1+K2)

PRAKTIKUM BIOKIMIA 3
 Aktivitas Unit = kesetaraan dengan kenaikan 0,01 A/menit

3. Penentuan kadar Protein Enzim kasar (Metode Lowry)

Tujuan : untuk menentukan aktivitas spesifik enzim kasar.
Kadar protein ditentukan dengan menggunakan BSA pada berbagai konsentrasi
sebagai standar protein.

Unit Aktivitas
Aktivitas Spesifik=
mg Protein

4. Pengaruh pH terhadap aktivitas Enzim PFO

enzim merupakan molekul protein globular yang sangat dipengaruhi pH. Apabila
ph enzim diluar optimum akan mempengaruhi konfrontasi dan pusat aktif enzim.

5. Pengaruh Konsentrasi substrat terhadap Aktivitas PFO

Substratnya adalah katekhol  dioksidasi menjadi senyawa quinon. Peningkatan
konsentrasi substrat menyebabkan peningkatan kecepatan reaksi, karena pada saat
itu pusat enzim belum jenuh.

Kurva yang dihasilkan menunjukan penambahan substrat mengahsilkan kondisi

steady state.

6. Pengaruh suhu Terhadap PFO

Setiap peningkatan temperature mula-mula akan meningkatkan kecepatan reaksi
enzim.

Peningkatan temperature yang semakin tinggi mengakibatkan enzim mengalami

kerusakan karena pergerakan yang tinggi sehingga pusat aktif enzim rusak dan
terdenaturasi.

7. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas PFO

Semakin lama waktu inkubasi maka kecepatan reaksi akan lebih tinggi. Semakin
lama waktu inkubasi ada kesempatan bagi molekul substrat bertemu dengan sisi
aktif enzim.

Pada reaksi oksidasi senyawa kathekol menjadi quinon sudah menghasilkan warna
coklat. Tidak perlu ditambahkan agen pereaksi.

8. Uji enzim alfa amilasi pada saliva

Di uji dengan iodium karena substratnya larutan tepung. Reaksi hidrolisis pati.
Yang birunya paling cepat hilang  aktivitas enzim paling optimum.

9. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim saliva

Tentukan titik/pH akromatik (pH saat warna biru paling cepat hilang) 
menunjukan pH optimum

10. Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim saliva

Pereaksi iodium  melihat adanya larutan pati
Pereaksi benedict melihat adanya gula pereduksi karena pati yang terhidrolisis

PRAKTIKUM BIOKIMIA 4
3. Percobaan Karbohidrat
1. Isolasi Karbohidrat
Tujuan penambahan etanol untuk menarik air pada pati yang mengendap.

Berat pati yang sudah kering

Randemen= x 100 %
Berat singkong
2. Tes Kualitatif
a. Uji Molisch membedakan Karbohidrat dan non Karbohidrat
Terbentuk warna ungu cincin. (H2SO4 dimasukan melalui dinding tabung)
b. Tes Seliwanoff Membedakan ketosa dan aldosa
Perubahan warna merah (cepat)  ketosa
Perubahan warna merah (lambat)  aldose
c. Tes Bial membedakan pentose dan heksosa
Digunakan pereaksi bial.
Perubahan warna Hijau biru  pentose
Perubahan warna Coklat  heksosa

d. Tes Barfoed uji gula pereduksi dengan tembaga sulfat pada suasana asam
Yang diuji monosakarida atau disakarida.
Perubahan warna endapan merah bata  Cu2O (Jika ada gula pereduksi)

Hati-hati pada sukrosa (disakarida) mudah terhidrolisis pada suasana asam,

kadang menghasilkan hasil positif pada uji barfoed.
e. Tes Benedict  tes gula pereduksi Cu 2+ pada suasana basa
Perubahan warna menjadi merah bata (jika gula pereduksi)
f. Tes asam Musat membedakan galaktosa dan monosakarida lain
HNO3 pekat berperan sebagai oksidator.
Asam musat yang tidak larut (endapan)  Galaktosa
Asam karboksilat yang larut  Monosakarida lain

3. Tes Kuantitatif
a. Hidrolisis tepung dan penentuan secara Follin Wu
Pada dasarnya penentuan uji gula pereduksi.

Tabung hidrolisat  hasil hidrolisis pati oleh HCl pada suasana asam

Warna biru akibat reaksi gula pereduksi dengan pereaksi Follin wu. Makin
tinggi kadar gula pereduksi makin pekat warna biru.

PRAKTIKUM BIOKIMIA 5
 Makin Panjang waktu hidrolisisnya makin banyak kadar gula pereduksi yang
dihasilkan.

Natrium karbonat berfungsi untuk menetralkan HCl sehingga reaksi hidrolisis

terhenti.

4. Percobaan Ekstraksi DNA

a. Ekstraksi DNA
Tris EDTA mengikat Ion Mg 2+  karena Mg 2+ dapat menghidrolisis DNA
dengan enzim DNAse

Fungsi deterjen cair  memisahkan DNA dengan protein, memutuskan ikatan

ionic antara protein histon dengan DNA.

Enzim protease kristal  DNA pada sel eukariot umumnya tidak berdiri
sendiri terikat dengan protein histon, sehingga enzim protease dapat
menghidrolisis protein.

Pipet Pasteur ujungnya runcing sehingga memudahkan pemiindahan gumpalan

tali DNA.

b. Analisis Sampel DNA

Menggunakan spektrofotometri pada daerah UV. 2 puncak maksimum,
menunjukan bahwa DNA pada sel eukariot terdapat protein histon. Maka
dilakukan perbandingan nilai absorbansi.
Lambda maks DNA = 258 nm
Lambda maks Protein = 280 nm

Kemurnian DNA yang baik pada nilai 1,8 – 2,0. Semakin kecil nilai
perbandingan maka semakin kecil kemurnian DNA.

5. Percobaan Saliva
1. Uji Saliva
a. Pengumpulan saliva
Penambahan asam asetat  sampai tidak terbentuk endapan yang artinya tidak
terbentuk glikoprotein lagi.
b. Tes Mucin
Mucin adalah Glikoprotein.
- Uji Milon  membuktikan adanya protein. Pereaksi Milon adalah larutan
merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Untuk mendeteksi protein
yang mengandung asam amino dengan rantai samping gugus fenolik.
- Uji Molisch  membuktikan adanya karbohidrat dengan pereaksi Molish

Larutan merah  adanya protein

Cincin ungu membuktikan adanya karbohirat

2. Tes Beberapa ion Anorganik

PRAKTIKUM BIOKIMIA 6
 a. Ion klorida (Cl-)  bereaksi dengan Ag + pada AgNO3 terbentuk endapan
AgCl
b. Ion Fosfat (PO4 3-)  terbentuk warna biru
c. Ion Sulfat (SO4 2-)  terbentuk endapan putih karena Ba 2+ membentuk
endapan Barium Sulfat
d. Ion Kalsium (Ca 2+)  Jika terjadi kekeruhan berarti terbentuk endapan
kalium oksalat

6. Percobaan Protein
 Protein berikatan dengan ikatan peptide.
 Titik isoelektrik pH protein di kelarutan rendah dan muatanya 0
 Prinsip isolasi protein  pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan
 Pemanasan susu dilakukan untuk mengumpulkan protein dan
mempercepat koagulasi
 Penambahan Asam asetat glasial  memberikan suasana asam dan
menurunkan kelarutan protein
 Fungsi etanol menarik air pada endapan
 Campuran etel : etanol  memisahkan komponen lipid dan non lipid
 Eter  melarutkan sisa lipid
 Protein memiliki sifat zwitter ion

 Protein mudah mengendap saat pH mendekati isoelektrik hal ini terjadi

karena gaya tolak menolak elektrostatik yang menyebabkan kelarutanya
kecil
 Kasein memiliki sifat kepolaran yang sama dengan air
 Penambahan NaOH Memberikan suasana basa dan terbentuk Na-
Kasein yang memiliki kelarutan besar
 Penambahan Asam asetat  suasana asam pH rendah sehingga mencapai
titik isoelektrik kasein sehingga mengendap
 Endapan paling banyak menunjukan titik isoelektrik

1. Pengendapan protein Pengendapan karena penggumpalan parsial akibat

berkurangnya kelarutan protein karena pengembangan molekul protein akibat
unfolding heliks protein.
Pengendapan  belum tentu terdenaturasi
Diuji dengan biuret  menghasilkan warna biru, maka protein mengendap tapi tidak
terdenaturasi

 Ion Positif yang mengendapkan protein : Ag+, Ca 2+ , Zn 2+, Hg 2+ , Pb2+ ,

Cu2+, Fe2+
 Ion negative : Salisilat, Trikloroasetat, Pikrat, Tanat, Sulfosalisilat

PRAKTIKUM BIOKIMIA 7
  Pelarut Organik : Digunakan untuk mengurangi konstanta dielektrik air
sehingga kelarutan protein berkurang
 Pengendapan garam : efek salting in dan salting out
a) Salting in  penambahan garam tidak jenuh sehingga protein
bermuatan dan larut dalam garam
b) Salting out  proses persaingan antara garam dan protein untuk
mengikat air
 Penambahan ammonium sulfat  menarik molekul air oleh ion garam

2. Denaturasi Protein terjadinya perubahan konformasi protein menjadi tak beraturan

sehingga protein yang larut menjadi tidak larut. Protein yang terdenaturasi 
mengendap
 Faktor : pH ekstrim, Temperatur Tinggi, ion Logam berat

3. Penentuan kadar protein

a. Metode Kyeldahl Menentukan jumlah nitrogen (N) total dalam sampel.
Prinsipnya mengubah protein menjadi ammonia dengan cara destruksi.(Destruksi
Basah)
 Jumlah mol ammonia= mol protein
 Selenium katalisator yang menaikan titik didih asam sulfat sehingga proses
destruksi menjadi lebih baik
 Reaksi destruksi basah :

 Indikator BCE-M  mengetahui asam borat dalam keadaan berlebih

 Dititrasi dengan HCl 0,1 N  hijau ke merah
 Perhitungan :
%N = (100/g sampel x 1000) x ml HCl x14,008
%Protein = %N x factor N (5,18 – 6,38)
Faktor N  factor koreksi
 Semakin banyak sampel lain yang mengandung N maka factor N lebih kecil,
dan sebaliknya.

b. Metode biuret reaksi antara protein dengan pereaksi biuret, yaitu CuSO4 dalam
alkali kuat
Warna biru – ungu  pengukuran pada Panjang gel. 540 nm
Batas deteksi = 0,2 – 2,0 mg

c. Metode Lowry  pembentukan senyawa kompleks yang direaksikan dengan

pereaksi tertentu. Prinsipnya yaitu dengan mempertajam warna yang dihasilkan di
metode biuret.
Batas deteksi = 0-200 ug

Reaksi yang terlibat adalah kompleks Cu(II) protein direduksi menjadi Cu(I),
kemudian ion Cu+ mereduksi reagen Folin Ciocalteu, kompleks fosfomolibdat
fosfotungstat menghasilkan hetero polimolibdenum blue akibat reaksi oksidasi

PRAKTIKUM BIOKIMIA 8
 gugus aromatic gugus tirosin dan triptofan terkatalis Cu  menghasilkan warna
biru.

Pengukuran nilai A pada Panjang gel. 700 nm

Dengan larutan standar BSA (bovin serum albumin).

d. Metode Bradford penentuan berdasarkan perubahan warna commasie brilliant

blue G250 yang direaksikan dengan protein pada suasana asam
Batas deteksi = 0-20 ug protein
Pengukuran nilai A pada Panjang gelombang 595 nm

Untuk metode lowry, Bradford, biuret bergantung pada bentuk sampel, harus
sampel yang larut dalam air. Sedangkan yang tidak larut gunakan kyeldahl

7. Percobaan Uji Urin

Penentuan sifat fisik urin
a. Penentuan volume urin
 Vol. urin normal : 600 – 2500 ml/ hari
 Penentuan kejernihan warna : kuning pucat  pigmen urochrome , urobilin &
hematrofin
 Penentuan berat jenis urin : 1,003 – 1,03 g/ml menggunakan urinometer
 Penentuan pH urin : 4,7 – 8
 Penambahan toluene dan formaldehid  zat pengawet yang menghindarkan
urine dari bakteri
 Suhu urine 27 – 32O C

b. Penentuan komponen urin

1. Penentuan garam ammonium muncul bau amoniak
NaOH  Pemberi suasana basa
Uap Amonia merubah lakmus merah menjadi biru

2. Pemeriksaan sulfat anorganik dan eterial

 Sulfat anorganic  Sulfat ion bebas SO42-
Penambahan HCl dan BaCl2  kelarutan meningkat dan terbentuk
endapan putih yang mengandung SO42- anorganik
 Sulfat eterial  Sulfat yang terikat dengan senyawa endogen
Pemanasan untuk memutuskan ikatan sulfat eterial baru terbentuk
Barium sulfat

3. Penentuan adanya ion Ca2+

Penambahan pereaksi Sukowich  mengendapkan kalsium dalam bentuk
kalsium oksalat (endapan putih)

4. Penentuan asam urat (Tes Mureksid)

Hasil katabolisme basa purin  asam urat
Penambahan HNO3 dan NH3  jika ada asam urat maka terbentuk
endapan mureksid (ammonium furfurat) berwarna ungu

PRAKTIKUM BIOKIMIA 9
 5. Penentuan Kreatinin
Penambahan nitroprusida menghasilkan warna merah ruby pada suasana
basa, dan lama kelamaan berubah menjadi kuning. Jika diasamkan dengan
HOAc glasial hijau dan kemudian menjadi biru prusian (positif)

Uji Kreatinin  menentukan fungsi ginjal

Kadar Kreatinin yang dikeluarkan dalam urine manusia biasanya tetap.

Jika berubah maka urine tidak normal.

c. Penentuan beberapa senyawa pada urine tidak normal

1. Penentuan glukosa berlebih penderita diabetes
Tes benedict uji gula pereduksi pada karbohidrat
Terbentuk endapan merah bata
2. Penentuan benda-benda keton pemecahan lemak secara besar-besaran
melalui beta oksidasi (Energi alternatif).
 Pada penderita diabetes yang tidak terkontrol kadar gula darah akan
tinggi dalam darah namun tidak masuk dalam sel. Sehingga tidak
dapat menghasilkan energi dari glukosa.
 Asetil koenzim a yang tidak semua ikut bereaksi dalam siklus krebs
sehingga akan diubah menjadi benda keton  menyebabkan keton
asidosis
 Amonium sulfat jenuh menjenuhkan urin
 Jika terbentuk warna ungu pada hasil akhir maka (+)

3. Bilirubin hasil penguraian sel darah merah khususnya degradasi

hemoglogin. Jika pada keadaan tidak normal akan terdeteksi dalam urin

Endapan + pereaksi Fuschet  warna hijau yang membuktikan adanya

bilirubin

4. Penentuan adanya darah  luka akibat gesekan batu ginjal pada saluran
urin
Digunakan tes benzidine dalam HOAc glasial + H2O2 3%  menghasilkan
warna biru (+)

8. Percobaan Vitamin
A. Penentuan kadar asam askorbat
 Prinsip  reaksi redoks, larutan asam askorbat akan mengalami oksidasi
sedangkan DCIP tereduksi.

 Pelarut asam metafosfat dalam HOAc  sebagai pelarut dan mencegah asam
askorbat teroksidasi

 Titik akhir titrasi : merah muda stabil selama 20 s

B. Penentuan kadar Vit C pada buah

1
PRAKTIKUM BIOKIMIA
0
  Jika digunakan sampel buah berwarna sebelum titrasi diberikan pre treatment
terlebih dahulu dengan memberikan karbon aktif menyerap warna

 Tidak perlu digunakan indicator lain karena 2,6 DCIP berfungsi juga sebagai
indicator juga.

 Peran asam metafosfat pelarut yang mengestrak asam askorbat dalam buah
yang mengandung senyawa endogen

Perhitungan :

(Y −a ) ml
Kadar vit C dalam sampel= x 1 mg /ml
( X −a ) ml

Catatan :
Y = volume titran pada titrasi sampel
X = volume titran pada titrasi standar
a = volume titran untuk blanko

9. Percobaan Darah
Darah terdiri dari komponen padat : sel darah merah , sel darah putih, maupun
platelet, trombosit. Sedangkan komponen cair : plasma darah.

Anti koagulan  mencegah darah diluar tubuh membeku karena terbentuk

fibrinogen

Untuk mendapatkan serum darah, lakukan sentrifugasi tanpa penambahan anti

koagulan. Fibrinogen akan berubah menjadi benang fibrin dan ikut mengendap
dengan padatan darah yg lain.

1. Penentuan kadar Hb dengan metode Sahli

Nama alat : Hemometer sahli
Penentuan kadar Hb : g/100 ml darah atau g/dL darah
Kisaran Pria : 14-16 g/dL dan Kisaran Perempuan : 12-14 g/dL

2. Tes Benzidin membuktikan adanya darah dengan reaksi redoks

1
PRAKTIKUM BIOKIMIA
1
 Warna biru menunjukan adanya darah

3. Penentuan beberapa senyawa dalam darah

 Filtrat
a. Tes gula pereduksi  dengan benedict
Menghasilkan warna merah bata
b. Ion Cl-  dengan larutan HNO3 encer + AgNO3 terbentuk endapan
putih
c. Ion fosfat PO42-  HNO3 encer + asam askorbat terbentuk warna
biru karena adanya ammonium fosfomolibdat

Sumber : Video bu Yani dan catetan nyong

1
PRAKTIKUM BIOKIMIA
2