13645-Article Text-40370-2-10-20161022
13645-Article Text-40370-2-10-20161022
Halaman 124–132
DOI: 10.14692/jfi.12.4.124
ISSN: 0215-7950
ABSTRAK
Teknik polymerase chain reaction (PCR) sangat penting untuk kegiatan deteksi, identifikasi
dan pemantauan organisme pengganggu tumbuhan karantina di wilayah Indonesia. Teknik ini perlu
didukung dengan metode isolasi DNA yang memadai untuk menyiapkan DNA templat. Tujuan
penelitian ialah mengevaluasi beberapa metode isolasi DNA, yaitu secara konvensional, FTA-card dan
modifikasinya, serta kit komersial untuk digunakan dalam teknik deteksi PCR yang optimum terhadap
Colletotrichum acutatum dan Peronosclerospora sorghi berturut-turut sebagai patogen pada buah cabai
dan tanaman jagung. DNA hasil isolasi masing-masing metode tersebut diukur dengan UV-vis nanodrop-
spektrofotometer dan selanjutnya untuk PCR digunakan konsentrasi DNA templat, yaitu 15 ng µL-1 dan
konsentrasi primer, yaitu 0.4; 0.6; 0.8; dan 1.0 µM untuk setiap metode isolasi. Hasil penghitungan
menunjukkan bahwa konsentrasi DNA tertinggi hasil isolasi diperoleh melalui metode konvensional
pada C. acutatum asal buah cabai dan P. sorghi asal daun jagung. Kemurnian DNA yang baik dari hasil
isolasi diperoleh pada C. acutatum asal buah dengan kit komersial (nilai 1.94) dan C. acutatum asal
biakan murni secara konvensional (nilai 1.91). Jumlah DNA total tertinggi secara nyata untuk kedua
patogen diperoleh melalui metode FTA-card yang dimodifikasi untuk C. acutatum asal biakan murni.
PCR menggunakan keempat konsentrasi primer menunjukkan seluruh target berhasil diamplifikasi
walaupun terdapat perbedaan ketebalan pita DNA. Lebih lanjut PCR menggunakan konsentrasi primer
yang optimal pada ketiga metode isolasi menunjukkan bahwa semua contoh DNA menghasilkan pita
DNA amplikon yang tebal dan merata.
Kata kunci: Colletotrichum acutatum, karantina, Peronosclerospora sorghi
ABSTRACT
Polymerase chain reaction (PCR) is an important tool for detection, identification and monitoring
of quarantine pests in Indonesia. DNA isolation method from target organism is an important step
to provide adequate DNA template for performing PCR. Objective of the research was to compare
conventional, commercial kit, FTA-card and its modification methods of DNA isolation to be used
in PCR detection for Colletotrichum acutatum and Peronosclerospora sorghi from chili and maize,
respectively. DNA obtained from various isolation methods were measured using UV-vis nanodrop-
spectrophotometry. DNA amplification was performed using DNA concentration of 15 ng µL-1 from
each isolation method with gradual primer concentrations of 0.4; 0.6; 0.8; and 1.0 mM. The highest
concentration of DNA was achieved with conventional methods for C. acutatum from pure culture and
P. sorghi from maize leaf. Best DNA purity was obtained from isolation method using commercial kit
*Alamat penulis korespondensi: Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor,
Jalan Kamper, Kampus IPB, Darmaga, Bogor 16680
Tel: 0251-8629364, Faks: 0251-862962, Surel: kikinhm@yahoo.com
124
J Fitopatol Indones Syahputra et al
for C. acutatum from infected fruit (1.94) and from conventional method for C. acutatum from pure
culture (1.91). The highest total yield of isolated DNA was achieved by modified FTA-card for C.
acutatum from pure culture. In general DNA amplification using various primer concentration gave
positive results although DNA bands intensity was varied from faint to very bright. Furthermore PCR
optimization using the best primer concentration from previous reaction showed that all DNA templates
resulted in thick and bright DNA bands.
Key words: Colletotrichum acutatum, Peronosclerospora sorghi, quarantine
Metode isolasi DNA untuk mendapatkan Penyiapan Bahan Tanaman dan Isolat
templat DNA yang akan digunakan dalam Patogen
polymerase chain reaction (PCR) telah Penelitian ini menggunakan buah cabai
mengalami perkembangan mulai dari bergejala antraknosa yang disebabkan oleh C.
cara konvensional menggunakan larutan acutatum dan daun jagung bergejala bulai yang
penyangga yang disiapkan sendiri hingga disebabkan oleh P. sorghi. Isolat C. acutatum
cara terkini menggunakan kit komersial. diisolasi dari buah cabai bergejala antraknosa
Penggunaan kit komersial berbasis formulasi dan dibuat biakan murni. Selanjutnya miselium
larutan penyangga saat ini banyak dilakukan C. acutatum diperbanyak pada medium potato
karena lebih efisien dan praktis. Teknik dextrose broth (PDB) digunakan sebagai
PCR mensyaratkan komponen templat DNA material isolasi DNA. Isolasi DNA cendawan
yang digunakan memiliki kemurnian dan P. sorghi menggunakan daun bergejala karena
konsentrasi tinggi sehingga amplifikasi dapat patogen bulai tidak bisa ditumbuhkan pada
berlangsung optimum. Tingkat kemurnian, medium buatan. Sampel tanaman uji diperoleh
konsentrasi, dan kualitas DNA sangat di- dari kebun petani di Kelurahan Situgede, Kota
tentukan oleh metode isolasi DNA. Perbedaan Bogor.
kandungan DNA kontaminan dan adanya
DNA bukan target menyebabkan perbedaan Isolasi DNA Total C. acutatum dan P. sorghi
metode isolasi DNA organisme. Pemilihan Isolasi DNA total secara konvensional dari
metode isolasi DNA yang tepat dan memadai jaringan buah cabai dan daun jagung sakit
berperan penting untuk keberhasilan teknik dilakukan dengan metode Warburton dan
PCR (Tan dan Yiap 2009). Hoisington (2001). Sebanyak 0.1 g jaringan
Deteksi dan identifikasi patogen tumbuhan dipotong-potong kecil dan dikeringbekukan
menggunakan teknik PCR, sudah banyak dengan nitrogen cair, lalu digerus menjadi
dilakukan petugas karantina tumbuhan. tepung menggunakan mortar. Hasil gerusan
Hal ini terkait dengan tindakan pencegahan diresuspensi dengan 400 µL bufer ekstraksi (1
dan pemantauan terhadap pemasukan dan M Tris pH 8, 5 M NaCl, 0.5 M EDTA, 2%
penyebaran organisme pengganggu tumbuhan CTAB, dan 1.25% β-merkaptoetanol) dan
karantina (OPTK) di wilayah Indonesia (BKP diinkubasi pada suhu 65 ºC selama 60 menit
2007). dalam penangas air. Suspensi dihomogenasi
Penelitian ini bertujuan mengevaluasi dengan dibolak-balik setiap 10 menit.
tiga metode isolasi DNA untuk mendeteksi Sebanyak 500 µL kloroform:isoamilalkohol
Colletotrichum acutatum penyebab penyakit (CI) [24:1, v/v] ditambahkan ke dalam
antraknosa pada cabai dan Peronosclerospora suspensi dan disentrifugasi pada kecepatan
sorghi penyebab penyakit bulai pada jagung 3500 rpm selama 20 menit pada suhu 4 °C.
dengan metode PCR. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan
125
J Fitopatol Indones Syahputra et al
126
J Fitopatol Indones Syahputra et al
Jumlah DNA total = a × b × c , dengan terdiri atas: Dream Taq Green PCR master mix
d (Thermo ScientificTM) 2× sebanyak 12.5 µL,
a, konsentrasi DNA (ng µL-1); b, volume primer forward dan reverse pada konsentrasi
suspensi (10 µL); c, luas kertas FTA yang variabel untuk tujuan optimasi 0.4, 0.6, 0.8,
berisi contoh; d, luas satu punch (3.14 mm2).dan 1 mM, masing-masing 1 µL, templat
Jumlah DNA total yang diisolasi DNA sebanyak 15 ng µL-1, dan air bebas
menggunakan metode konvensional dan kit nuklease sebanyak 8.5–9.5 µL. Sebagai
dihitung berdasarkan hasil kali konsentrasi kontrol internal, pasangan primer ribulose
asam nukleat dengan volume larutan hasil biphosphate carboxylase/oxygenase gene
resuspensi asam nukleat dari isolasi DNA (Rubisco L) dengan konsentrasi 0.2 µM
(75 µL). Data pengamatan yang diperoleh masing-masing sebanyak 0.5 µL sebagai
ialah konsentrasi (ng µL-1), kemurnian (nisbah
duplex PCR untuk C. acutatum pada buah,
nilai absorbansi pada A260/280 untuk DNA sedangkan PCR kedua (B) sebagai kontrol
protein), dan jumlah total DNA (mg). negatif untuk kedua patogen. PCR kedua (B)
Data konsentrasi dan jumlah total DNA dilakukan persis seperti tahap pertama, namun
hasil isolasi disusun dalam rancangan acak konsentrasi primer yang digunakan ialah
lengkap dengan faktor perlakuan metode satu konsentrasi terbaik dari hasil PCR tahap
isolasi dengan masing-masing metode isolasi pertama pada masing-masing metode isolasi.
diulang sebanyak 3 kali. Analisis ragam dan Semua amplikon hasil PCR dielektroforesis
uji perbandingan nilai tengah Tukey pada menggunakan agarosa 1.5 %, dalam larutan
α 5% menggunakan peranti lunak Minitab 16. penyangga TAE 1×, pada daya 50 V, 70 mA,
selama 50 menit dengan volume PCR produk
Amplifikasi PCR 7.5 µL untuk tiap kolom. Gel agarosa diwarnai
Reaksi amplifikasi PCR untuk deteksi dengan larutan EtBr 10% selama 30 menit,
C. acutatum dan P. sorghi dilakukan divisualisasi dengan UV transilluminator dan
menggunakan alat thermal cycler AB didokumentasikan.
(Applied BiosystemTM) Veriti dengan total
volume reaksi 25 µL. Pasangan primer yang HASIL
digunakan dalam PCR ini adalah primer
spesifik untuk masing-masing patogen yang Isolasi DNA C. acutatum
dideteksi (Tabel 1). PCR dilakukan sebanyak Keberhasilan isolasi DNA dapat
2 kali. PCR pertama (A), komponen reaksi PCR ditunjukkan oleh konsentrasi dan kemurnian
Tabel 1 Pasangan primer yang digunakan dalam PCR untuk deteksi Colletotrichum acutatum
dan Peronosclerospora sorghi
Primer Urutan nukleotida (5’ 3’) dan siklus PCR Amplikon Sumber
C. acutatum
CaInt2 GGGGAAGCCTCTCGCGG
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC Brown et al.
[95 °C 5 mnt; 40X (95°C30 detik, 60 °C ±500 pb
1996
30 detik, 72 °C 1 mnt); 72 °C 7 mnt, 4 °C~]
P. sorghi
PsUF CCAGCAACTCCAGTTATGGAA
PsUR CATGTACAATGGTRC TTGGAA Rustiani et al.
[94 °C 2 mnt; 30X (94 °C 30 detik, 56 °C ±154 pb
2015
1 mnt, 72 °C 1 mnt);72 °C5 mnt, 4 °C~]
Kontrol internal
RBCL-F535 CTTTCCAAGGCCCGCCTCA Nassuth et al.
RBCL-R705 CATCATCTTTGGTAAAATCAAGTCCA ±171 pb
2000
127
J Fitopatol Indones Syahputra et al
Tabel 2 Konsentrasi, kemurnian pada nilai absorbansi A260/280 dan jumlah total DNA hasil
isolasi pada tiga metode untuk Colletotrichum acutatum dari buah cabai sakit dan biakan murni
serta Peronosclerospora sorghi dari daun jagung sakit
128
J Fitopatol Indones Syahputra et al
Kontrol internal Rubisco L teramplifikasi optimum terpilih, yaitu untuk metode kit
PCR dengan produk ± 171 pb. PCR kedua komersial 1.0 µM, FTA standar 0.8 µM, FTA
menggunakan konsentrasi primer optimum modifikasi 0.8 µM dan konvensional 0.8 µM,
untuk masing-masing metode, yaitu kit sehingga diperoleh hasil positif pada semua
komersial 1.0 µM, FTA standar 0.8 µM, FTA contoh dengan ketebalan pita DNA yang baik
modifikasi 0.8 µM, dan konvensional 0.8 µM. (Gambar 2).
Semua hasil PCR menunjukkan pita DNA
positif dengan ketebalan yang baik dan merata Amplifikasi DNA P. sorghi Asal Daun
(Gambar 1). PCR pertama untuk P. sorghi dari daun
jagung menunjukkan hasil positif untuk
Amplifikasi DNA C. acutatum Asal Biakan semua contoh DNA dari ketiga metode isolasi
Murni dengan kualitas pita DNA amplikon berukuran
PCR pertama untuk C. acutatum asal ± 154 pb yang baik dan merata ketebalannya.
biakan murni menunjukkan hasil positif Walaupun PCR pertama sudah diperoleh hasil
berupa pita DNA amplikon berukuran yang optimum dan memuaskan, PCR kedua
± 500 pb pada semua contoh DNA hasil pada patogen tersebut tetap dilakukan dengan
isolasi keempat metode, namun kualitas pita menggunakan konsentrasi primer terpilih,
DNA yang dihasilkan beragam pada setiap yaitu untuk metode kit 0.8 µM, FTA standar
metode dan antar konsentrasi primer. Kontrol 0.4 µM, FTA modifikasi 0.6 µM dan
internal Rubisco L tidak teramplifikasi. konvensional 0.4 µM yang juga diperoleh hasil
PCR kedua untuk C. acutatum dari biakan positif untuk semua contoh dengan kualitas
murni diperbaiki dengan konsentrasi primer pita DNA yang baik dan merata (Gambar 3).
Ko1-0.8
Ko2-0.8
Ko3-0.8
Fs1-0.8
Fs2-0.8
Fs3-0.8
Fi1-0.8
Fi2-0.8
Fi3-0.8
Ko-0.4
Ko-0.6
Ko-0.8
Ko-1.0
K1-1.0
K2-1.0
K3-1.0
Fs-0.4
Fs-0.6
Fs-0.8
Fs-1.0
Fi-0.4
Fi-0.6
Fi-0.8
Fi-1.0
K-0.4
K-0.6
K-0.8
K-1.0
K[-]
M
500 pb
171 pb 171 pb
a b
Gambar 1 Amplifikasi DNA Colletotrichum acutatum hasil isolasi dari buah cabai menggunakan
CaInt2/ITS4 dengan target produk ± 500 pb. a, PCR pertama dengan konsentrasi primer variabel
0.4, 0.6, 0.8 dan 1.0 µM ; b, PCR kedua dengan konsentrasi primer optimum 0.8 atau 1.0 µM
dengan masing-masing ulangan 1, 2 dan 3; K, metode kit komersial; Fs, FTA-card standar; Fi,
modifikasi; Ko, konvensional;M, penanda 100 pb dan; (K[-]) kontrol negatif.
Ko1-0.8
Ko2-0.8
Ko3-0.8
Fs1-0.8
Fs2-0.8
Fs3-0.8
Fi1-0.8
Fi2-0.8
Fi3-0.8
Ko-0.4
Ko-0.6
Ko-0.8
Ko-1.0
K1-1.0
K2-1.0
K3-1.0
Fs-0.4
Fs-0.6
Fs-0.8
Fs-1.0
Fi-0.4
Fi-0.6
Fi-0.8
Fi-1.0
K-0.4
K-0.6
K-0.8
K-1.0
K[-]
M
500 pb
171 pb
a b
Gambar 2 Amplifikasi DNA Colletotrichum acutatum hasil isolasi dari biakan murni
menggunakan CaInt2/ITS4 dengan target produk ± 500 pb. a, PCR pertama dengan konsentrasi
primer variabel 0.4, 0.6, 0.8 dan 1.0 µM; b, PCR kedua dengan konsentrasi primer optimum
0.8 atau 1.0 µM dengan masing-masing ulangan 1, 2 dan 3; K, metode kit komersial; Fs, FTA-
card standar; Fi, modifikasi, Ko, konvensional; M, penanda 100 pb dan; (K[-]) kontrol negatif.
129
J Fitopatol Indones Syahputra et al
Ko1-0.4
Ko2-0.4
Ko3-0.4
Fs1-0.4
Fs2-0.4
Fs3-0.4
Fi1-0.6
Fi2-0.6
Fi3-0.6
Ko-0.4
Ko-0.6
Ko-0.8
Ko-1.0
K1-0.8
K2-0.8
K3-0.8
Fs-0.4
Fs-0.6
Fs-0.8
Fs-1.0
Fi-0.4
Fi-0.6
Fi-0.8
Fi-1.0
K-0.4
K-0.6
K-0.8
K-1.0
K[-]
M
M
154 pb
171pb
a b
Gambar 3 Amplifikasi DNA Peronosclerospora sorghi hasil isolasi dari daun jagung
menggunakan PsUF/PsUR dengan target produk ±154 pb. a, PCR pertama dengan konsentrasi
primer variabel 0.4, 0.6, 0.8 dan 1.0 µM; b, PCR kedua dengan konsentrasi primer optimum 0.8
atau 1.0 µM dengan masing-masing ulangan 1, 2 dan 3; K, metode kit komersial; Fs, FTA-card
standar ; Fi, modifikasi; Ko, konvensional; M, penanda 100 pb dan ; (K[-]) kontrol negatif.
130
J Fitopatol Indones Syahputra et al
templat DNA dalam PCR, yaitu berkisar al. 1999). Pita paling tebal diperoleh dengan
antara 10 pg dan 1 mg (Thermo Scientific). konsentrasi primer paling tinggi.
Keberhasilan PCR untuk deteksi patogen
tumbuhan salah satunya ditentukan oleh UCAPAN TERIMA KASIH
kualitas dan kuantitas templat DNA hasil
isolasi dan komponen-komponen PCR Ucapan terima kasih disampaikan kepada
lainnya termasuk konsentrasi primer. Menurut Badan Karantina Pertanian, Balai Uji Terap
Sambrook et al. (1989) keberhasilan pengujian Teknik dan Metode Karantina Pertanian dan
PCR tidak harus memiliki kemurnian DNA Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian
yang tinggi, tetapi dapat dipengaruhi oleh atas dukungan dana dan fasilitas penelitian.
EDTA dan kloroform. Sharma et al. (2013)
melaporkan bahwa perbedaan metode isolasi DAFTAR PUSTAKA
DNA pada patogen tanaman memberikan
hasil yang berbeda terhadap konsentrasi dan Abd-Elsalam KA, Ibrahim N A, Abdel-Satar
kemurnian DNA. MA, Khalil MS, Verreet JA. 2003. PCR
Konsentrasi primer optimum untuk uji identification of Fusarium genus based on
PCR terhadap DNA dari tiap metode isolasi nuclear ribosomal-DNA sequence data.
berbeda-beda. Hal ini disebabkan kualitas Afr J Biotech. 2(4):82–85. DOI: http://
pita DNA untuk menentukan primer optimum dx.doi.org/10.5897/AJB2003.000-1016.
dipengaruhi oleh konsentrasi primer itu sendiri [BKP] Badan Karantina Pertanian. 2007.
selain konsentrasi templat DNA. Menurut Pedoman Surveilensi Organisme
Hoelzel dan Green (1992) kespesifikan dan Pengganggu Tumbuhan Karantina. Jakarta
kualitas PCR bergantung pada konsentrasi (ID): BKP.
primer optimal, yaitu 0.1–2.0 µM. Brown AE, Sreenivasaprasad S, Timmer LW.
Duplex PCR menggunakan primer 1996. Molecular characterization of slow-
kontrol internal bertujuan memastikan proses growing orange and key lime anthracnose
pengujian PCR sudah benar, tidak terjadi strains of Colletotrichum from citrus as C.
kesalahan teknis preparasi/pengerjaan premix acutatum. Mol Plant Pathol. 86(5):523–527.
PCR. Kontrol internal menggunakan primer Burgoyne LA, penemu; Flinders Technologies
Rubisco L dapat mengamplifikasi dengan Pty. Ltd. 1999 Nov 16. Solid medium and
multiplex PCR Cassava mosaic Begomovirus method for DNA storage. Paten Amerika
pada singkong (Rajabu et al. 2013). Serikat US 5985327.
Konsentrasi DNA paling tinggi diperoleh Capote N, Pastrana AM, Aguado A, Torres
dari metode konvensional dan kemurnian PS. 2012. Molecular tools for detection
DNA paling baik diperoleh dari metode of plant pathogenic fungi and fungicide
kit dan konvensional. Templat DNA kedua resistance. Di dalam: Cumagun CJ, editor.
patogen yang diperoleh dari metode FTA- Plant Pathology. Slavka Krautzeka (HR):
card baik standar maupun modifikasi mampu In Tech Europe. hlm 151–202.
teramplifikasi dengan PCR atau sebanding Fitzgerald FK, Burden DW. 2014. Evaluation
dengan templat DNA yang diisolasi dari of the synergy rapid plant DNA isolation
metode kit dan konvensional. Metode isolasi Chemistry. Random Primers. 13:1–7.
ini dapat dimanfaatkan untuk koleksi dan Hoelzel AR, Green A. 1992. Analysis of
penyimpanan sampel DNA patogen dari population-level variation by sequencing
lapangan. Optimasi PCR terhadap konsentrasi PCR-amplified DNA. Di dalam: Hoelzel
primer dapat memberikan hasil terbaik serta AR, editor. Molecular Genetic Analysis
penambahan volume amplikon pada saat of Populations: A Practical Approach.
elektroforesis untuk meningkatkan kualitas Oxford (UK): IRL Pr. Hhlm 159–187.
pita. Terdapat perbedaan pita DNA hasil Loffert D, Karger S, Twieling G, Ulber V, Kang
PCR dari tiap konsentrasi primer (Loffert et J. 1999. Optimization of multiplex PCR.
131
J Fitopatol Indones Syahputra et al
132