Laporan Praktikum Pewarnaan Gram

06.49 by rusma ariyaniNo comments

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA GIZI
PEWARNAAN GRAM

DISUSUN OLEH :
1. RUSMAH SUCI ARIYANI (J310120024)
2. FIQI DWI KARTIKA         (J310120023)

PROGRAM STUDI ILMU GIZI S1

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
2014

I.                   Judul : Pewarnaan Gram dan Pengamatan Morfologi Bakteri

II.                Tujuan
Mengetahui dan memehami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan bakteri
kedalam kelompok gram positif atau bakteri gram negativ serta menentukan morfologinya.

III.             Pendahuluan 
               Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya
mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak
melengkung.
            
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah. Hal ini bertujuan untuk memberikan
warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore
yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena
kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi
menjadi baik (Rudi, 2010).

     
         Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan
kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya
praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. Habitat
endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan
nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin,
difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers
seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada
siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan
pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna
endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006).
         
 

IV.             Tinjauan Pustaka

Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada
tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah
dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri
gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a.  Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.
b.  Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu
proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop,
sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida
(lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan
berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang
tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek
(Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negative (Manurung, 2010).
Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1- Kandungan lipid tinggi
4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
 Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies relatif Relatif sederhana
kompleks
Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami
sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu
berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup
walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres
situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan
panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set
kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein.
Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah
besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).

Klasifikasi Bacillus subtilis. (itis, 2008)

Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Order : Bacillales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus subtilis
Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif. Bakteri ini
tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam amino.
Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel membentuk
tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan
bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili
Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli
 hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia
dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan
patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik
uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air,
indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).
Klasifikasi E. Coli
Kingdom : Bakteria
Filum   : Proteobacteria
Kelas   : Gamma Proteobacteria
Order   : Enterobacteriales
Famili  : Enterobacteriaceae
Genus   : Escherichia
Spesies : E.  coli
Menurut literatur, E. coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk bakteri
gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam
usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri
patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E. coli merupakan patogen berbahaya yang
menyebabkan penyakit diare, sindrom diare lanjutan, muntaber, hemolitik uremic (hus), infeksi
usus, infeksi saluran urin, dan neonatal meningitis. Peranan yang mengguntungkan adalah dapat
dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen
pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. Disamping itu, E. coli banyak
digunakan dalam teknologi rekayasa genetika dan biasa digunakan sebagai vektor untuk
menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan karena bakteri ini memiliki
pertumbuhan yang sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Fajriana, 2008).

V.                Metode Praktikum

a.       Alat dan Bahan
Alat
1.      Mikroskop
2.      Objek glass
3.      Jarum inokulasi
4.      Busen
5.      Penjepit
6.      Pipet tetes

Bahan
Pewarnaan Gram
1.      Biakan bakteri murni (E. Coli) 6. Gram D (Safranin)
2.      Gram A (Carbol Getain Violet) 7. Kapas
3.      Gram B (Iodium) 8. Minyak Imersi
4.      Gram C (Alkohol) 9. Air

Morfologi Bakteri
1.      Preparat awetan
2.      Alcohol 70%
3.      Minyak imersi
4.      Kapas

b.      Cara kerja

1.      Pewarnaan Gram

Pengambilan objek glass dan fiksasi dengan meleidah apikan di atas busen sebanyak 2-3
kali secara cepat

Pengambilan 1 ose biakan murni (E. Coli) dan diletakan di atas objek g;lass

Perataan biakan murni dengan jarum ose

 Pemfiksasian dengan melidah apikan bagian yang tidak ada kumannya di atas busen 2-3
kali dengan cepat

Penuangan pewarnaan carbol getain violet, biakan selam 1 menit

 
Pembuangan sisa carbol getain
violet

Pencucian preparat dengan air mengalir

 
Pengeringan preparat dengan
membiarkan di udara terbuka/di hair drier

Penuangan pewarna iodium, biakan selam 2 menit

Pembuangan sisa iodium

Pencucian preparat dengan air mengalir

Pengeringan preparat di udara terbuka

 
Pemucatan dengan alcohol 70% dengan
cara menetesakan perlahan sampai warna
ungu hilang

 
Pembilasan dengan air mengalir

Penuangan pewarna safranin sebagai pewarna penutup/pembanding biarkan selam 30 detik

 Pembuangan kelebihan safranin

 
Pencucian preparat dengan air mengalir
 
Dikeringkan preparat denngan kertas
isap

 
Penambakan minyak imersi pada preparat dan pengamatan preparat di bawah mikroskop denga
pembesarna lemah kemudian dengan pembesaran kuat

2.      Morfologi Bakteri

Pengambilan preparat awetan dari berbagai bakteri
 
Pemasangan dibawah mikroskop
 
 
 
Pengamatan dengan pembesaran 10X sampai
didapatkan lapang pandang dan focus yang pas

Penambahan minyak imersi di atas preparat

 
Pengubahan perbesaran menjadi 100X

 
Penggambaran dan penggolongan bakteri yang sedang diamati

VI.             Hasil Praktikum

No Jenis Bakteri Gambar Keterangan
1. E. Coli Biakan murni yang diguanakan E.
 Coli namun dalam pengamatan
ternyata terlihat bakteri Basillus. Hal
ini terjadi mungkin karena adanya
kontaminasi sehingga dalam preparat
terdapat bakteri Basillus.
Pada pengamatan dengan
menggunakan mikroskop nampak
Bacillus subtilis berbentuk basil
(batang) dan merupakan bakteri
gram positif. Jenis ini memiliki
endospora yang letaknya di tengah.

VII.          Pembahasan
Pada praktikum kali ini kami melakukan pewarnaan gram dan pengamatan morfologi
bakteri. Biakan murni yang digunakan yaitu E. Coli. Namun pada pratikum ini setelah dilakukan
pengamatan ternyata yang terlihat pada mikroskop ternyata bakteri Basillus. Hali ini terjadi
mungkin karena sudah terjadi kontaminasi sehingga bakteri yang terdapat dalam pengamatan
adalah Basillus. Sehingga dalam pembahasan praktikum ini kami lebih banyak membahas
bakteri Basillus dari pada E. Coli. Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang
berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga
telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat
mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat
alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol. 
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah
awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di
dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan gram
menggunakan 4 macam zat pewarna yaitu meliputi Cibol Getian Violet sebagai pewarna primer,
Iodium sebagai pewarna sekunder, Alkohol sebagai larutan pemucat, Safranin sebagai pewarna
pembanding. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif
dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 
 Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap
setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Bakteri gram positif adalah
bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri
jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative
akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. 
Umumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena
sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena
tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras
mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat
sulit sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan mudah
diamati (Karmana 2007). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,
pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat pewarna penutup.
Pada praktikum kali ini dilakukan teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada bakteri.
Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Bacillus SP) dengan tujuan agar isolat bakteri dapat
merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan mikroorganisme di kaca
preparat. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk memperkuat warna pada bakteri.
Alkohol 96% berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir
yaitu pemberian safranin yang berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah
kehilangan warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol. Pada bakteri di preparat
menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di preparat merupakan bakteri
gram positif dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah
berikatan dengan kristal ungu. Jika berwarna merah muda menunjukan bakteri gram negatif
dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan
safranin.
 Hasil uji bakteri agar miring atau Bacillus sp dapat mempertahankan warna primernya
walaupun mengalami dekolorisasi(pencucian) ketika ditambahkan alkohol sehingga bakteri
Bacillus sp merupakan kelompok bakteri gram positif. Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan
permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjosapuro 2005).

VIII.       Kesimpulan
Setelah melakukan praktikum ini kami dapat mengetahui dan memahami prosedur
pewarnaan gram dan pengelompokan bakteri. Basillus merupakan bakteri gram positif,
dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan
dengan kristal ungu. Sehingga pada saat sampai pewarnaan terakhir bakteri berwarna biru atau
ungu.

IX.             Daftar pustaka

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. http : // mushoffaditya. blogspot.
com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 2 Juni 2014.
Dwidjoseputro.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta:PT Gramedia
Fajriana, Rizki. 2008. Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram. http //pewarnaan
bakteri\Mikroum…Pewarnaan Gram « RIZQI FAJRIANA BLOG’S.htm/. 11 November 2010.
Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).
http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif.
11 November 2010.
Karmana.2007.Biologi.Jakarta:PT Grafindo Media Pratama
Manurung, Pebrin. 2010. Pengamatan Bentuk Bakteri. http: //pebrinmanurung. blogspot.
com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri. html. 11 November 2010.
Pelezar chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta
Reyza, Muhammad. 2008. Metode Pewarnaan Gram. http: //qi206. wordpress. Com/
2008/10/17/ mikroba/pewarnaan/ 11 November 2010.
Rudi, 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya. http: // rudyregobiz. wordpress.com/ bakteri-
gram-dan-pewarnaannya-2/. 11 November 2010.
Suriawiria. 2005. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.