LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13

PRAKTIKUM HBS Ag

PROBANDUS
Nama : Tn. Ferdian
Nama : DEA FATIKA NURHAYATI
Umur : 40Tahun
Jenis Kelamin : Laki - Laki Kelas : C-13 / NIM. 1193081

METODE : RDT dan ELISA

I. TUJUAN :
Untuk mengetahui ada tidaknya antigen dari virus hepatitis B dalam sampel yang
diperiksa.

II. PRINSIP :
 Metode RDT :
Terjadinya proses difusi kapiler pada sampel melalui membran nitroselulosa
sehingga terjadi ikatan antara sampel dengan konjugat Ab. Kompleks sample-
konjugat Ab akan bergeran menuju test line, kemudian berhenti dan terkonsentrasi
hingga menghasilkan sinyal berupa garis merah. Selanjutnya sisa konjugat
berlebih akan bergerak ke control line dan terjadi perubahan warna garis merah
sehingga menandakan bahwa hasil positif dan pengujian berjalan dengan baik.

 Metode ELISA :

Serum/plasma pasien dimasukkan ke dalam mikroplate bersama dengan

antibody yang disekatkan pada enzim dflorseratif peroksidase (HRP-conjugate)
dan ditujukan untuk menangkap epitop yang berbeda dari HBs Ag selama
inkubasi. Imunokompleks spesifik terbentuk dari HbsAg dalam sampel yang
ditangkap oleh fase padat. Setelah pencucian untuk menghilangkan protein pada
serum yang tidak diikat oleh HRP- conjugate chromogen yang berisitetramethyl
benzidine (TMB) dan urea peroksida ditambahkan ke dalam mikroplate dengan
adanya ikatan antibodi-antigen-atibodi (HRP) “Sandwich” imunocomplex
chromogen yang tidak berwarna dihidrolisa dengan ikatan HRP-conjugate
membentuk warna biru. Warna biru kemudian berubah menjadi warna kuning
ketika ditambah stop solution yaitu asam sulfat. Intensitas warna diukur sebanding
dengan jumlah antigen yang terperangkap dalam mikroplate. Mikroplate yang

| Laporan Imunoserologi 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13
tidak mengandung HbsAg tidak berwarna.

III. ALAT dan BAHAN :

1. Sampel serum
2. Strip test
3. Wellplate
4. Mikropipet
5. Tip
6. Reagen ELISA HbsAg
7. ELISA reader

IV. CARA KERJA :

A. METODE RDT
1. Menyiapkan tabung serologi dan meletakkan pada rak tabung serologi.
2. Mengambil dan memasukkan pada tabung, sampel serum atau plasma
dengan menggunakan mikropipet sebanyak 200 µL secara hati-hati.
3. Memasukkan stick dalam tabung secara perlahan-lahan.
4. Menunggu selama 10-15 menit supaya serum bereaksi secara sempurna

Interpretasi Hasil :

Adanya HBs Ag dalam serum akan membentuk 2 tanda garis merah pada
stick yang nampak jelas dalam waktu 10-15 menit.

B. METODE ELISA
1. Menambahkan 50 µl control (-) pada sumuran B1, 50 µl control (+) pada
sumuran C1, dan 50 µl sampe pada sumuran D1 dst, sumuran A1 digunakan
untuk prosedur blanko.
2. Menambahkan Reagen HRP conjugate sebanyak 50 µl pada amsing-masing
sumuran, inkubasi 60 menit pada 37°C.
3. Melakukan pencucian dengan alat ELISA washer sebanyak 3x, atur masing-
masing pencucian sebanyak 350 µl, keringkan.

| Laporan Imunoserologi 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13
4. Menambahkan pada masing-masing sumuran 50 µl chromogen A dan 50 µl
chromogen B
5. Menginkubasi pada ruang gelap selama 15 menit pada 37°C.
6. Menambahkan pada masing-masing sumuran 50 µl stop solution
7. Melakukan pembacaan hasil pada ELISA reader dengan ƛ450 nm.

INTERPRETASI HASIL :

Hasil positif dari pemeriksaan ELISA dilihat dari absorbance yang terbentuk dimana :

 Apabila abs >1 maka (+) Hepatitis B

 Apabila abs <1 (-) Hepatitis B

Hasil positif juga dapat dilihat dari nilai cut off nya, dimana :

 Cut Off < 1 maka hasil negative

 Cut Off ≥ 1 maka hasil positive

 Cut Off 0,9 – 1,0 maka re-testing / duplo

V. HASIL :
RDT : Positif (+) Terdapat garis merah pada control dan test line
ELISA : Positif (+) cut off 2.09

VI. KESIMPULAN :
RDT : Dalam sampel yang diperiksa positif terdapat virus hepatitis B
ELISA : Dalam sampel yang diperiksa positif terdapat antigen dari virus hepatitis B
dengan cut off 2.09

VII. PEMBAHASAN :

Hepatitis B adalah suatu sindroma klinis atau patologis yang ditandai

oleh berbagai tingkat peradangan dan nekrosis pada hepar, disebabkan oleh
Virus Hepatitis B (VHB), dimana infeksi dapat berlangsung akut atau
kronik, terus menerus tanpa penyembuhan paling sedikit enam bulan

HBsAg (Hepatitis B Surface Antigen) merupakan salah satu cara

| Laporan Imunoserologi 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13
pemeriksaan imunoserologi terhadap antibody Penyakit Hepatitis B ini
disebabkan oleh infeksi virus hepatitis B (VHB), yang merupakan virus
DNA berlapis ganda dengan diameter 42 nm. Virus ini berasal dari keluarga
Hepadnaviridae dengan struktur virus bagian terluar terdiri dari HBsAg dan
bagian dalam adalah nukleocapsid yang tersusun atas HBcAg.
Pajanan virus ini dapat menimbulkan dua manisfestasi klinis yaitu:
 Secara akut, yang kemudian sembuh secara spontan dan membentuk
kekebalan terhadap penyakit.
 Berkembang menjadi kronik, dengan definisi dari hepatitis B kronik
adalah adanya persistensi VHB lebih dari 6 bulan.
Pada infeksi primer, proses awal respon imun terhadap virus sebagian
besar belum dapat dijelaskan. Diduga, awal respon tersebut berhubungan
dengan imunitas innate pada liver mengingat respon imun ini dapat
terangsang dalam waktu pendek, yakni beberapa menit sampai beberapa jam.
Terjadi pengenalan sel hepatosit yang terinfeksi oleh natural killer cell (sel
NK) pada hepatosit maupun natural killer sel T (sel NK-T) yang kemudian
memicu teraktivasinya sel-sel tersebut dan menginduksi sitokin-sitokin
antivirus, termasuk diantaranya interferon (terutama IFN-α). Kenaikan kadar
IFN-α menyebabkan gejala panas badan dan malaise. Proses eliminasi innate
ini terjadi tanpa restriksi HLA, melainkan dengan memanfaatkan sel-sel NK
dan NK-T yang terangsang oleh adanya IFN-α (Soemoharjo, 2008).
Respon imun spesifik yaitu aktivasi sel limfosit T dan B. Aktivasi sel T
CD8+ terjadi setelah kontak reseptor sel T dengan kompleks peptida VHB-
MHC kelas I yang ada pada permukaan dinding sel hati dan pada permukaan
dinding Antigen Presenting Cell (APC) dengan dibantu rangsangan sel T
CD4+ yang sebelumnya sudah mengalami kontak dengan kompleks peptida
VHB-MHC kelas II pada dinding APC. Sel T CD8+ selanjutnya akan
mengeliminasi virus dalam sel hati yang terinfeksi. Proses eliminasi tersebut
bisa berupa nekrosis sel hati yang dapat meningkatkan kadar ALT. Respon
imun yang pertama terjadi sekitar 10 hari sebelum terjadi kerusakan sel hati.
Respon imun tersebut muncul terhadap antigen pre-S, disusul respon
terhadap HBcAg sekitar 10 hari kemudian. Respon yang terkuat adalah
respon terhadap antigen S yang terjadi 10 hari sebelum kerusakan sel hati
(Soemoharjo, 2008).

| Laporan Imunoserologi 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13
Pada hepatitis B akut, tubuh berusaha mengeliminasi VHB baik
dengan mekanisme innate maupun spesifik. Eliminasi virus melalui respon
spesifik akan menunculkan produksi antibodi seperti anti-HBs, anti-HBc, dan
anti-HBe. Fungsi anti-HBs adalah menetralkan partikel VHB bebas dan
mencegah masuknya virus ke dalam sel. Infeksi kronis VHB bukan
disebabkan gangguan produksi anti-HBs. Persistensi infeksi VHB
disebabkan oleh adanya respon imun yang tidak efisien terhadap jumlah
antigen yang menginfeksi.
A. Klasifikasi hepatitis B secara histopatologis dikenal ada tiga bagian,
yaitu
1. Hepatitis B Kronik Persisten
2. Hepatitis B Kronik Lobular
3. Hepatitis B Kronik Aktif.
Perbedaannya terletak pada sebukan selsel radang dan luas daerah
hepar yang terinfeksi.Semua kondisi tersebut dapat berkembang
menjadisirosis hepatis maupun karsinoma hati primer.
Pengidap hepatitis B dikatakan kronik apabilas eseorang mengidap
VHB lebih dari 6 bulan tanpamelihat ada atau tidaknya penyakit hepar.
Batasanwaktu 6 bulan ini karena pada hepatitis B akut 90-95%penderita
sudah negatif pemeriksaan Hepatitis BS urface antigen (HBsAg). Semakin
muda usia seseorang terserang HBV, semakin besar kemungkinannya untuk
menjadi pengidap kronik
Gambaran klinik dari hepatitis B bervariasi, mulai dari tingkatan yang
lebih ringan sampai yang terberat. Perjalanan hepatitis B dapat dibagi
atasbeberapa fase, diantaranya fase inkubasi, fase akut,fase confalescent
window, dan fase penyembuhan. Masing-masing fase mempunyai waktu
tertentu, dan gejala klinis yang berbeda untuk penderitanya, serta gambaran
serologi yang dapat dipakai untuk petunjuk menentukan dimana fase
seseorang berada.
Virus hepatitis B ditularkan melalui perkutaneus dan membran
mukosa yang terinfeksi oleh darah,semen, secret vagina dan saliva.
B. Patofisiologi hepatitis B dibagi atas 5 fase :
1. fase pertama adalah imun toleran, ditandai oleh sistemimun
menghambat replikasi VHB, dimana HBV DNA, HBeAg, dan

| Laporan Imunoserologi 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13
HBsAg dilepaskan dan dapat dideteksi dalam serum.
2. Fase Kedua adalah fase imun reaktif, pada fase ini HBeAg
positif, kadar alanine transferase (ALT) meningkat, Anti HBc IgM
mulai diproduksi, HBV DNA,HBeAg dan HBsAg semakin
banyak.
3. Fase ketiga adalah replikasi menurun, HBV DNA rendah, HbeAg
negatif, tetapi HBsAg masih ada, fase ini dikenals ebagai inactive
carier state, dimana berisiko (10-20%) untuk reaktivasi menjadi
aktif kembali
4. Fase keempat adalah HBeAg negatif, tetapi pada fase ini,virus
yang mengalami mutasi pada precore, regiopromoter core dari
genom tetap aktif melakukan replikasi, sehingga
komplikasi/kerusakan hepar terus berlanjut.
5. fase kelima adalah HBsAg negatif, replikasi virus berhenti, tetapi
VHB masih berisiko ditularkan, karena berada dalam reaktifase.
C. Pemeriksaan imunologi terhadap VHB sangat diperlukan, diantaranya
adalah:
1. Pemeriksaan Hepatitis B surface Antigen (HBsAg)
Pemeriksaan HbsAg bermanfaat untuk menetapkan hepatitis B akut,
timbul dalam darah enam minggu setelah infeksi dan menghilang
setelah tiga bulan. Bila persisten lebih dari enambulan, maka
didefinisikan sebagai pembawa(carier). HbsAg ditemukan pada
hepatitis B akut dini sebelum timbul gejala klinik atau pada akhir masa
tunas.
2. Pemeriksaan Antibodi Hepatitis B surface (Anti-HBs)
Anti Hbs merupakan antibodi terhadap HBsAg, jika positif/reaktif,
menunjukkan pada fase konvalensi Hepatitis B, pada penderita
hepatitis B (biasanya subklinis) yang sudah lama, atau sesudah
vaksinasi HBV. Jenis Hepatitis B subklinis dapat diketahui dengan Anti
HBs dengan atau tanpa Anti HBc pada orang yang menyangkal adanya
riwayat hepatitis akut. HBs Ag yang negatif tetapi anti HBspositif,
belum dapat dikatakan seseorang tersebut bebas dari HBV, sebab
adanya superinfeksi dengan HBV mutant, banyak studi yang sudah
meneliti, bahwa HBV DNA dilaporkan positif pada pemeriksaan

| Laporan Imunoserologi 2021 |

LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13
HBsAg yang negatif
3. Pemeriksaan Hepatitis B envelope Antigen (HBeAg)
HBeAg timbul bersama atau segera setelah timbulnya HBsAg dan akan
menetap lebih lama dibandingkan HBsAg, biasanya lebih dari
10minggu. Bila kemudian HBeAg menghilang dan terbentuk Anti HBe,
berpotensi mempunyai prognosis yang baik
4. Pemeriksaan antibodi Hepatitis B envelope (Anti-HBe)
Anti HBe terbentuk setelah HBeAg menghilang,biasanya terbentuknya
Anti HBe memberikan kontribusi bahwa hepatitis B membaik, infeksi
mereda dan tidak akan menjadi kronis
5. Pemeriksaan antibodi Hepatitis B core (Anti-HBc)
berupa IgM anti HBc HBV core tidak ditemukan dalam darah, tetapi
dapat dideteksi antibodi terhadap HBV core berupa IgM anti HBc,
yang muncul segera setelah HbsAg muncul, dan bertahan cukup lama.
Anti HBc yangpositif tetapi HBsAg negatif, masih menjadi pertanyaan
pada transfusi darah, dimana kondisi tersebut berada pada fase
windows period,sehingga beresiko untuk menularkan HBV kepada
penerima darah (Tas et al, 2012).
Anti HBc positif tanpa HBsAg atau anti HBs, dapat
diinterpretasikan sebagai berikut, pertama penderita hepatitis B sudal
lama sembuh, dimana sudah kehilangan reaktivasi dari anti HBs.
Kedua adalah penderita Hepatitis B baru sembuh dan masih dalam
masa jendela dimana anti HBs belum muncul, ketiga ada penderita low
level carier, dengan titer HBsAg terlalu rendah, sehingga kondisi ini
sangat berbahaya pada kasus transfusidarah, pemberian serum
immunoglobulin (gammaglobulin).
6. Hepatitis B Virus Desoxyribo Nucleic Acid (HBV-DNA)
Pengukuran kadar HBV DNA dapat dilakukan dengan menggunakan
PCR, pengukuran dapat dilakukan secara kualitatif maupun direk
kuntitatif, dapat juga menganalisis HBV DNA mutan.
Pengukuaran HBV DNA merupakan gold standard, tetapi
pemeriksaan ini memerlukan alat khusus, tenaga yang terampil dan
biayanya mahal sehingga banyak dilakukan pemeriksaan alternatif
untuk dapat menggantikan pemeriksaan HBV DNA ini,tetapi masih

| Laporan Imunoserologi 2021 |

 LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI C13
banyak ditemukan kelemahan dalam hasil uji pemeriksaan alternatif
tersebut. Hal tersebut dapat diakibatkan oleh HBV yang mengalami
mutasi pada gennya

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Soemoharjo, Soewignjo. 2008. Hepatitis Virus B. Edisi Kedua. Jakarta: ECG
Tas T, Kaya S, Onal S, Kucukbayrak A. The detection of HBV DNA with polymerase
chainreaction in blood donors with isolated hepatitis Bcore antibody.
Medicinski Glasnik. 2012;9;221-30

| Laporan Imunoserologi 2021 |