PERANAN DNA DALAM TEKNOLOGI

Pengertian DNA Asam deoksiribonukleat (DNA) adalah asam

nukleat yang mengandung instruksi genetik yang digunakan dalam

pengembangan dan fungsi dari semua organisme hidup dikenal dan

beberapa virus. Peran utama dari molekul DNA adalah penyimpanan jangka

panjang informasi.

DNA sering dibandingkan dengan satu set cetak biru atau resep,

atau kode, karena berisi instruksi yang dibutuhkan untuk membangun

komponen lain dari sel, seperti protein dan molekul RNA. Segmen DNA

yang membawa informasi genetik ini disebut gen, tetapi urutan DNA lain

yang memiliki tujuan struktural, atau terlibat dalam mengatur penggunaan

informasi genetik.

Kimia, DNA terdiri dari dua polimer panjang unit sederhana yang

disebut nukleotida, dengan tulang punggung yang terbuat dari gula dan

gugus fosfat bergabung dengan ikatan ester. Kedua untai berjalan dalam

arah yang berlawanan satu sama lain dan karena itu anti-paralel. Terlampir

gula masing-masing adalah salah satu dari empat jenis molekul yang disebut

basa. Ini adalah urutan dari empat basa sepanjang tulang punggung yang

mengkodekan informasi. Informasi ini dibaca dengan menggunakan kode

genetik, yang menentukan urutan asam amino dalam protein. Kode ini

dibaca oleh menyalin membentang dari DNA menjadi RNA asam nukleat

terkait, dalam proses yang disebut transkripsi.

 Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari

kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan

karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar.

Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat

diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui

isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi

protein tertentu atau pembentukan suatu produk.

1. Pengertian DNA Rekombinan

DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami perubahan

karena penyisipan suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya

tidak terdapat dalam molekul DNA yang sudah ada dengan cara

enzimatik atau kimiawi.

 Teknologi DNA Rekombinan meliputi: -

 Teknikuntukmengisolasi DNA.

 Teknikuntukmemotong DNA.

 Teknikuntukmenggabungataumenyambung DNA.

 Teknikuntukmemasukkan DNA kedalam sel hidup sehingga

DNA rekombinandapatbereplikasidandapatdiekspresikan.

Teknologi DNA Rekombinan berdasarkan mekanisme yang ada

pada bakteri:

Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan: bakteri

mempunyai mekanisme seksual:

 Menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari

dua sel yang berbeda.

  Merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel kesel lainnya.

Mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak

menghasilkan anak atau zuriat).

DNA dapat masuk kedalam sel bakteri melalui 3 cara:

1.Konjugasi

2.Transformasi

3.Transduksi

1.) Konjugasi: perpindahan DNA dari satu sel (seldonor) kedalam sel

bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedu asel.

2.) Transformasi: pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di

sekelilingnya.
3.) Transduksi: cara pemindahan DNA dari satu sel kedalam sel lainnya

melalui perantaraan fage.

DNA yang masuk kedalam sel bakteri：

a. dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga

terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan.

b. tidak dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan,

atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan

upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel

alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak

definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi

DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling

representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah

pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara

penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga

memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di

dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

Rekayasa genetika dapat memberikan hasil yang sangat

menguntungkan. Sebagai contoh pasien yang menderita diabetes tidak

mampu membentuk hormon insulin untuk mengatur kadar gula dalam

darah. Oleh karena itu, pasien membutuhkan suntikan insulin sebagai

tambbahan. Dengan teknik rekayasa genetika, para peneliti berhasil

memaksa mikroorganisme (bakteri) untuk membentuk insulin yang mirip

dengan insulin manusia (suryo, 2001).

Teknologi DNA rekombinan merupakan salah satu faktor yang

berkontribusi dalam perkembangan pengetahuan ekspresi gen. Teknologi

DNA rekombinan pertama kali dilakukan sekitar tahun 1970 – 1980-an.

Dasar dari teknologi DNA rekombinan adalah manipulasi molekul

DNA dalam tabung uji. Teknik DNA rekombinan ini melibatkan enzim –

enzim yang aktivitasnya dapat diketahui dan dikontrol. Enzim – enzim

tersebut terbagi dalam empat golongan besar, yaitu :

a. DNA polimerase

Enzim yang mensintesis polinukleotida baru yang komplemen dengan

DNA atau RNA template. Enzim ini digunakan dalam PCR,

sekuensing DNA, pelabelan DNA dan riset-riset biomol lain.

Ada 2 peran eksonuklese dari DNA polimerase yaitu :

a.) Eksonuklese 3’5’: berfungsi menghilangkan nukleotida dari

ujung 3’ pada untai. DNA yang baru disintesis aktivitasnya disebut

 proofreading karena eksonuklese ini membiarkan DNA polimerase

mengoreksi kesalahan insersi basa yang tidak pada tempatnya.

b.) Eksonuklease 5’3’: biasanya berfungsi pada replikasi DNA,

yaitu untuk menghilangkan sedikit bagian dari polinukleotida yang

sudah disisipkan ke untai template.

b. Nuklease

Enzim yang berfungsi untuk memutus ikatan fosfodiester yang

menghubungkan nukleotida yang satu dengan yang lain. Ada 3

macam nuklease :

a. Eksonuklease, menghilangkan nukleotida dari ujung molekul DNA

atau RNA.

b. Endonuklease, aktivitasnya memotong ikatan fosfodiester internal.

c. Restriksi endonuklease, mempunyai peran khusus dalam teknologi

DNA rekombinan, yaitu dapat mengikat DNA pada urutan tertentu

dan membuat untai ganda DNA terpotong dalam urutan tertentu.

c. Ligas

Enzim DNA ligase untuk menyambung DNA

Tahap penting dalam teknologi DNA rekombinan adalah

penyambungan molekul DNA asing ke DNA vektor. Proses ini disebut

proses ligasi dan dikatalisis oleh enzim ligase. Ligase adalah enzim

yang berperan dalam menyambung ikatan kovalen antara gula dan

fosfat. Contoh enzim ligase: enzim ligase dari E. coli dan faga T4.

Ligase lebih efisien menyambung ujung lengket (sticky end)

dibandingkan menyambung ujung tumpul sebab interaksi ikatan

hidrogen antara tonjolan ujung lengket (sticky) menambah stabilitas

kedua untai ketika proses katalisis berlangsung; interaksi seperti itu

tidak terjadi pada proses ligase ujung tumpul (blunt end) sehingga

proses ligasi menjadi tidak efisien. Hasil reaksi ligasi antara vektor

(plasmid) dan fragmen DNA setelah dipotong enzim restriksi

yang sama, sebagai berikut :

a. Vektor berhasil disisipi fragmen DNA asing bukan target

b. Vektor berhasil disispi fragmen DNA asing target

c. Vektor tidak berhasil disisipi dan menyambung kembali

(religasi)

d. Enzim modifikasi akhir

Contoh dari enzim modifikasi akhir yaitu:

 a. Terminal deoksinukleotidil transferase Berfungsi untuk

membentuk ujung DNA yang homopolimer

b. Alkaline fosfatase Berfungsi untuk menghilangkan fosfat dari

ujung 5’ pada molekul DNA yang mencegah molekul ini berligasi

c. Polinukleotida kinase

Kebalikan dari alkaline fosfatase yaitu menmbahkan fosfat pada

ujung 5’.

Menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase: Jackson, Simon

& Berg (1972) berhasil membuat DNA rekombinan.

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan,

atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini

melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang

bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning

gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian

teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin

paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan

 adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara

penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga

memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di

dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama,

dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan

diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya.

Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu

dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi

secara konvensional.

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang

diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa

tahapan tertentu (Gambar 9.1). Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi

DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul

DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA

vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan

molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan

molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari

sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

2. Perangkat Teknologi DNA Rekombinan

Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA

rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim

ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan

mengklonkan gen di dalam sel hidup, transposon sebagai alat untuk

melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda, pustaka

genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah

diklonkan, enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan

RNA, pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen

DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Vektor

yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan bakteriofag.

Enzim restriksi, digunakan untuk memotong DNA. Enzim restriksi

mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang

panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut dikenal

dengan nama enzim endonuklease restriksi.

1. Cellular Enzymes / Enzim seluler

Enzim yang dipakai dalam memanipulasi DNA diantaranya adalah

a.) enzim Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-batas

sekuen nukleotida spesifik dan berfungsi dalam proses restriction

atau pemotongan bahan-bahangenetik. Penggunaan enzim ini yang

paling umum antara lain pada sekuen palindromik. Enzim ini

dibentuk dari bakteri yang dibuat sedemikian rupa sehingga dapat

menahan penyusupan DNA, seperti genom bacteriophage.

b.) DNA polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-

copy DNA. Enzim ini mengsintesis DNA dari sel induknya dan

membentuk DNA yang sama persis ke sel induk barunya. Enzim

ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak

mengherankan, karena semua organisme pasti harus meng-copy

DNA mereka.

c.) RNA polimerisasi yaitu enzim yang berfungsi untuk ’membaca

sekuen DNA dan mengsintesis molekul RNA komplementer.

Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga banyak

ditemukan di banyak organisme karena semua organisme harus

’merekam’ gen mereka.

d.) DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk

menyambungkan suatu bahan genetik dengan bahan genetik yang

lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat bergabung

dengan DNA atau RNA dan membentuk ikatan phosphodiester

baru antara DNA atau RNA yang satu dengan lainnya.

 e. Reverse transcriptases adalah enzim yang berfungsi membentuk

blue-print dari molekul RNA membentuk cDNA (DNA

komplementer). Enzim ini dibuat dari virus RNA yang mengubah

genom RNA mereka menjadi DNA ketika mereka menginfeksi

inangnya. Enzim ini biasa dipakai ketika bertemu dengan gen

eukariotik yang biasanya terpisah-pisah menjadi potongan kecil

dan dipisahkan oleh introns dalam kromosom.

2. Natural Vectors / Vektor natural

Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel,

para ilmuwan dalam bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat

yang keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA yang

dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah memberikan solusi dari

masalah ini. Vektor disini bisa diartikan sebagai alat yang

membawa DNA ke dalam sel induk barunya.

Agar suatu metode dalam rekayasa genetika dianggap berhasil, di

dalam vektor, DNA hasil rekombinan seharusnya benar-benar

hanya dibawa setelah sebelumnya DNA rekombinan digabungkan

dengan DNA vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor,

DNA rekombinan tidak termutasi lagi membentuk DNA dengan

sifat baru. Contoh dari vektor natural dari alam adalah plasmid dan

virus atau bacteriophage.

3. Teknik Teknologi DNA Rekombinan

 Teknologi DNA rekombinan meliputi beberapa teknik, yaitu :

1. Teknik untuk mengisolasi DNA

2. Teknik untuk memotong DNA

3. Teknik untuk menggabungkan atau menyambungkan DNA

4. Teknik untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel hidup

sehingga DNA rekombinan tersebut dapat bereplikasi dan dapat

diekspresikan dalam sel bakteri lainnya atau sel resipien melalui

kontak fisik antara dua sel.

a) Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta

penghilangan dinding sel. Dalam proses ini dapat dilakukan secara

mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah perusakan sel telah

dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat

dilakukan dengan menggunakan buffer nonosmotik, serta deterjen

yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat

(SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang

dengan melakukan sentrifugasi sehingga bias dibedakan antara bagian

yang rusak serta organel target yang pada akhirnya didapatlkan DNA

yang nantinya dilakukan pemurnian dengan penambahan amonium

asetat dan alcohol.

b) Selanjutnya adalah pemotongan DNA dengan menggunakan

enzim restriksi endonuklease. Pemutusan ini dilakukan di dalam strain

tertentu yang bertujuan untuk mencegah agar tidak merusak DNA.

Selain itu strain tersebut juga mempunyai suatu system modifikasi

yang menyebabkan pemutusan basa pada urutan tertentu yang

merupakan recognition sites bagi enzim restriksi tersebut. Pemotongan

DNA genomik dan DNA vektor dengan menggunakan enzim restriksi

ini harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel dalam

arti setiap fragmen DNAnya harus dapat disambungkan dengan DNA

vektor yang sudah berbentuk linier.

c) Tahap penyambungan DNA terdapat beberapa cara, yaitu

penyambungan dengan menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri,

penyambungan dengan menggunakan DNA ligase dari sel E. coli yang

telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau sering disebut dengan

enzim T4 ligase. Serta dengan pemberian enzim deoksinukleotidil

transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.

Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket

buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

d) Tahap berikutnya adalah analisa terhadap hasil pemotongan

DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul

molekul DNA dengan menggunakan teknik elektroforesis. Hasil dari

penyambungan ini dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat

diperbanyak dengan cepat. Dalam hal ini pada campuran reaksi

tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah

fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu

sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel

inang ini dinamakan transformasi. Sehingga diharapkan sel inang

mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA

rekombinan.

e) Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi

rekombinan. Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang

bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi

untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA

rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang

membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk

mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen

sisipan atau gen yang diinginkan. Seleksi sel rekombinan yang

membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari

fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang

pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi

polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).

Rekombinasi memiliki tiga mekanisme dasar dalam menjalani

prosesnya yaitu:

1. Transformasi merupakan transfer DNA telanjang yang

umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang

berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau

lisis maka DNA sirkular akan terlepas ke lingkungan. Efisiensi

transformasi bergantung pada kompetensi sel.

2. Konjugasi merupakan pemindahan materi genetik berupa

plasmid secara langsung melalui kontak sel dengan membentuk

 struktur seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang

berdekatan. Umumnya terjadi pada bakteri gram negatif.

3. Transduksi merupakan transfer materi genetik dari satu bakteri

ke bakteri lainnya dengan menggunakan virus bakteri sebagai

vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar dari galur

donor yang menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan

utamanya dengan transfer DNA lainnya adalah DNA ditransfer

melalui perantaraan bakteriofag.

Bagaimana menyisipkan, memperbanyak dan mengekspresikan

informasi genetik dengan menggunakan teknologi DNA

rekombinan?
4. Manfaat Teknologi DNA Rekombinan

Pengembangbiakan gen-gen rekombinan dan ekspresinya dalam

bentuk produk-produk protein oleh Eschrechia coli atau sel khamir

yang dapat ditumbuhkan dalam jumlah yang tak terbatas memberikan

kemungkinan memproduksi protein-protein secara komersial yang

mempunyai kegunaan praktis. Kemungkinan ini mendorong timbulnya

bidang rekayasa genetika. Dalam permasalahan tersebut teknik DNA

rekombinan dan metode pengembangbiakan memainkan peranan yang

sangat penting ( Albert, 1982).

Berbagai riset DNA rekombinan banyak diaplikasikan secara praktis

dalam berbagai bidang, diantaranya :

1. Bidang Kesehatan

 Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan

bakteri E. Coli dan telah diperdagankan untuk mengobati

penyakit diabetes.

 Vaksin hepatitis B digunaka untuk mencegah infeksi virus

hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.

Cereviciae dalam skala industri.

 Hormon tubuh manusia (GH)diproduksi menggunaka E. Coli

dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (mis.

cebol)

 Terapi penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang

mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan

 untuk mengobati penyakit-penyakit keturunan (genetic

disorders) dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan

gen (misal: kanker)

Gen-gen bagi beberapa protein yang dibutuhkan dalam bidang

kedokteran yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran yaitu pembuatan

insulin manusia oleh bakteri Eschrechia coli untuk pengobatan penyakit

 diabetes.

Dahulu insulin didapatkan dari kelenjar pancreas sapid dan babi.

Untuk membuat hanya 0,45 kg insulin hewan itu, yang dibutuhkan oleh

750 pasien diabetes selama satu tahun, diperlukan 3.600 kg kelenjar

yang berasal dari 23.000 ekor hewan. Laporan dari Kementrian

Kesehatan Pendidikan dan Kesejahteraan (HEW = Health Education

and Welfare) Amerika Serikat, dalam tahun 1981 diperlukan 56 juta

hewan untuk memenuhi kebutuhan insulin Amerika serikat. Melalui

teknik DNA rekombinan (rekayasa genetika), para peneliti berhasil

memaksa bakteri untuk membentuk insulin yang mirip dengan insulin

manusia dan ini bahkan lebih baik dibandingkan insulin yang dihasilkan

sapi dan babi yang dapat diterima oleh tubuh manusia. Selain itu,

dengan cara yang sama teknologi DNA rekombinan mempunyai peran

dalam pembuatan vaksin (misalnya hepatitis B), produksi hormon

pertumbuhan dan lain sebagainya.

4. Isolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan

dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti

sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis

seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-

bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam

medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar

perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau
dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus

disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami

lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan

remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa

dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform

untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis

dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan

remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan

RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah

diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium

asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan

CsCl (lihat Bab II).

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk

DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk

memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi

dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya

berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan

mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA

kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai

nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan

DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila

dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi

kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA

kromosom.

Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium

bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di

sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium

bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA

kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan

menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA

kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga

keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.