BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Kerangka konsep

Variabel bebas Variabel terikat

Konsentrasi infusa Daya hambat pertumbuhan

daun alpukat bakteri Escherichia coli

3.2 Definisi operasional

- Konsentrasi daun alpukat adalah kandungan daun alpukat yang di peroleh dari

perendaman simplisia dengan larutan dalam penangas pada suhu 900 C selama 5 menit

dan dibuat dalam berbagai tingkatan konsentrasi (100% sampai 10%).

- Daya hambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli kemampuan infusa daun alpukat

sebagai inhibitor pertumbuhan bakteri Escherichia coli yang dilakukan dengan cara

difusi sumuran pada media MHA dan hasilnya dilaporkan dalam skala ordinal yaitu

menghambat atau tidak menghambat.

3.3 Metode penelitian

Jenis penelitian ini adalah menggunakan metode eksperimen laboratorium.

3.4 Sampel penelitian

 Dalam penelitian ini sampel yang digunakan adalah Infusa daun alpukat (Persea

americana Mill) dan strain bakteri Escherichia coli yang diperoleh dari laboratorium

Mikrobiologi Akademi Analis Kesehatan Provinsi Jambi.

3.5 Tekhnik pengumpulan data

Pengumpulan data dilakukan atas dasar hasil pengamatan terhadap kemampuan

bermacam-macam konsentrasi (100% - 10%) dari infusa daun alpukat dalam menghambat

pertumbuhan bakteri Escherichia coli.

3.6 Tempat dan waktu penelitian

3.6.1 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan dilaboratorium Mikrobiologi Akademi Analis Kesehatan

Provinsi Jambi.

3.6.2 Waktu penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada tanggal 16 Mei s/d 29 Juni 2013.

3.7 Instrumen penelitian

3.7.1 Peralatan yang digunakan

- Neraca analitik

- Erlenmeyer 500 ml

- Gelas ukur 100 ml

- Becker glass 250 ml

- Alumunium foil
- Kompor listrik

- Lampu spiritus

- Petridish

- Autoclave

- Lumpang

- Corong pisah

- Waterbath

- Tissue

- Spidol

- Kertas whatman no.2

- Alat pelubang kertas

- Oven

- Pelubang kertas

- Sendok

- Pipet ukur

- Hotplate

- Swab kapas steril

- Pinset

- Inkubator
 - Beacker plastik

- Kertas saring

3.7.2 Reagensia

- Aquadest steril

- Alkohol 70%

3.7.3 Bahan

- Infusa daun alpukat dengan pengenceran 10%-100%.

3.7.4 Spesimen

- Strain murni Escherichia coli, yang berumur 1 X 24 jam.

3.8 Prosedur pembuatan simplisia daun alpukat

3.8.1 Pengambilan sampel

a. Disiapkan kantong plastik putih jernih untuk wadah daun sirih merah.

b. Diambil bagian daun alpukat yang segar dan muda.

c. Daun alpukat merah dicuci bersih dengan air mengalir, setelah itu ditiriskan hingga

air pada daun kering kemudian dirajang.

3.8.2 Pembuatan infusa daun alpukat

a. Disiapkan alat dan bahan.

b. Diberi etiket pada erlenmeyer secara berurutan pada erlenmeyer pertama 100%

erlenmeyer kedua 90%, erlenmeyer ketiga 80%, erlenmeyer keempat 70%, dan

seterunya sampai konsentrasi 10%.

c. Erlenmeyer beretiket 100%, ditimbang sebanyak 100 gr daun alpukat lalu

ditambahkan 100 ml aquadest, kemudian ditutup rapat dengan menggunakan

alumunium foil.

d. Erlenmeyer beretiket 90%, ditimbang sebanyak 90 gr daun alpukat lalu ditambahkan

100 ml aquadest, kemudian ditutup rapat dengan menggunakan alumunium foil.

e. Erlenmeyer beretiket 80%, ditimbang sebanyak 80 gr daun alpukat lalu ditambahkan

100 ml aquadest, kemudian ditutup rapat dengan menggunakan alumunium foil.

f. Erlenmeyer beretiket 70%, ditimbang sebanyak 70 gr daun alpukat lalu ditambahkan

100 ml aquadest, kemudian ditutup rapat dengan menggunakan alumunium foil dan

seterusnya sampai pengeceran 10%.

g. Dipanaskan di atas waterbath selama 15 menit terhitung sejak suhu mencapai 90 0

Setelah 15 menit diangkat lalu saring dengan meggunakan kain flannel (Farmakope

Indonesia edisi V.,1995).

Konsentrasi infusa daun alpukat

No Infusa daun Volume aquadest Hasil pengenceran

alpukat ( gr ) ( ml ) ( v/v )

1 100 100 100%

2 90 100 90%

3 80 100 80%

4 70 100 70%

5 60 100 60%

6 50 100 50%

7 40 100 40%

8 30 100 30%
 9 20 100 20%

10 10 100 10%

3.8.3 Prosedur pembuatan suspensi bakteri Escherichia coli

1. Diambil tiga ose koloni bakteri dari media subkultur, lalu disuspensikan didalam

media BHIB.

2. Suspensi tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 2 jam hingga diperkirakan

bakteri telah mencapai fase log pertumbuhannya.

3. Kekeruhan dari suspensi selanjutnya dibandingkan sengan standar kekeruhan Mac-

Farland hingga diperoleh derajat kekeruhan yang sama.

4. Jika suspensinya lebih encer, koloni suspensi bakteri ditambahkan lagi dan diulang

inkubasinya, sedangkan jika lebih keruh dapat diencerkan dengan penambahan

BHIB.

3.8.4 Prosedur pemeriksaan daya hambat (metode difusi)

1. Dimasukkan suspensi bakteri Escherechia coli 100µl kedalam masing-masing

cawan petri.

2. Kemudian ditambahkan ±20 ml MHA, homogenkan dan didinginkan pada suhu

kamar hingga beku.

3. Setelah beku dibuat lubang (sumur) sebanyak empat lubang pada setiap cawan petri.

4. Diberi tanda konsentrasi pada setiap lubang.

5. Dipipet 100µl infusa daun alpukat ke dalam masing-masing lubang pada semua

cawan perti sesuai dengan konsentrasi infusa, kemudian diinkubasi selama 16-18

jam pada suhu 37ºC.

 6. Dua cawan petri digunakan sebagai kontrol,cawan petri pertama sebagai kontrol

positif yang berisi anti bakteri dan cawan yang kedua sebagai kontrol negatif yang

tidak berisi anti bakteri.

3.8.7 Cara pembuatan kontrol

1. Kontrol negatif : media Muller Hilton Agar (MHA) yang telah ditanam dengan

biakan bakteri Escherichia coli ditempelkan pada permukaan media dengan

aquadest steril.

2. Kontrol positif : media Muller Hilton Agar (MHA) yang telah ditanam dengan

biakan bakteri Escherichia coli ditempelkan pada permukaan media dish

antibiotik ampicilin, hasil dibandingkan terhadap media kontrol positif dan

kemudian diukur diameter zona hambat.

3.8 Interpretasi hasil

1. Tidak terdapat zona jernih disekitar sumur.

2. Ada terdapat zona jernih disekitar sumur.

3.9 Analisa data

Hasil penelitian dianalisis dengan melihat zona hambat pada media Mueller Hinton

Agar (MHA), untuk melihat daya hambat infusa daun alpukat terhadap bakteri Escherichia

coli dan ditampilkan dalam bentuk tabel.