MAKALAH

Quality Control Strain Bakteri The American Type Culture Collection (ATCC)
dan
National Collection of Type Cultures (NTCC)
(Cara Peremajaan dan Penyimpanan)

Disusun Oleh

KELOMPOK 3 :

1. Suriyani G1C221086
2. Haydir Fitra G1C221069
3. Rupana Dewi Saputri G1C221059
4. Nur Afni Astika G1C221065
5. Faris Fakhrurozzy Hasan G1C221066
6. Ayunda Nur Aripinawati G1C221075
7. Duniyah G1C221062
8. Dina Liline G1C221079
9. Intan Susana Rantung G1C221084
10. Elvina Oktavia Labina G1C221080

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG

D4 TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
2021/2022
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT yang hingga saat ini masih memberikan
kita nikmat iman dan kesehatan, sehingga kami diberikan kesempatan untuk
menyelesaikan tugas penulisan makalah tentang Quality Control Strain Bakteri :
The American Type Culture Collection (ATCC) dan National Collection of Type
Cultures (NTCC) Cara Peremajaan dan Penyimpanan. Shalawat serta salam tidak
lupa selalu kita hanturkan untuk junjungan Nabi Besar kita, yaitu Nabi
Muhammad SAW.
Kami menyampaikan rasa terima kasih yang sebanyak-banyaknya untuk
dosen mata kuliah QC dan Validasi, Bapak M. Evy Prastiyanto, M.Sc yang telah
menyerahkan kepercayaan kepada kami guna menyelesaikan makalah ini dengan
tepat waktu. Kami juga berharap dengan sungguh-sungguh agar makalah ini dapat
berguna dan bermanfaat dalam meningkatkan pengetahuan sekaligus wawasan
terkait dengan materi tentang QC Strain Bakteri.
Selain itu, kami juga sadar bahwa terdapat banyak sekali kekurangan dan
ketidaksempurnaan yang terdapat pada makalah kami ini. Oleh karena itu, kami
sangat menantikan kritik dan saran yang membangun untuk makalah ini. Kami
berharap makalah ini dapat dimengerti oleh semua pembaca. Kami pun memohon
maaf yang sebesar-besarnya apabila dalam makalah kami terdapat banyak
kesalahan.

Oktober 2021

Penyusun

i
 DAFTAR ISI

Halaman
KATA PENGANTAR .................................................................................... i
DAFTAR ISI................................................................................................... ii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 2
1.3 Tujuan................................................................................................... 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Quality Control..................................................................................... 3
2.2 ATCC (The American Type Culture Collection) ................................. 13
2.2.1 Kultur Bakteriologi ATCC......................................................... 15
2.2.2 Pertumbuhan dan perbanyakan Bakteri ..................................... 19
2.2.3 Penyimpanan Bakteri ................................................................. 34
2.3 NCTC (National Collection of Type Cultures) .................................... 51
2.3.1 Kultur Bakteriologi NCTC......................................................... 54
2.3.2 Jenis strain:................................................................................. 55
2.3.3 Strain tipe NCTC dalam studi evolusi: ...................................... 55
2.3.4 Strain referensi: .......................................................................... 56
2.4 Peremajaan Bakteri .............................................................................. 58
2.5 Penyimpan Bakteri NCTC ................................................................... 63
2.5.1 Penyimpanan kultur beku........................................................... 64
2.5.2 Penyimpanan dengan Metode Kering Beku atau Liofilisasi...... 66
2.5.3Penyimpanan dalam akuades steril
............................................................................................................ 69
2.5.4 Penyimpanan dalam Minyak Mineral ........................................ 69
2.5.5 Penyimpanan dalam Tanah Steril............................................... 70

ii
 2.5.6 Penyimpanan international...............................................................70
2.5.7 Penyimpanan Koleksi spesial, unik dan pribadi..............................70
2.5.8 Penyimpanan Rentang strain yang tersedia......................................70
BAB III PENUTUP
3.1 Kesimpulan.................................................................................................74
DAFTAR PUSTAKA...........................................................................................77

iii
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Laboratorium klinik merupakan sarana kesehatan yang dapat digunakan
untuk penentuan jenis penyakit, kondisi kesehatan atau faktor yang dapat
berpengaruh pada kesehatan masyarakat dengan melakukan pengukuran,
penetapan dan pengujian bahan-bahan dari manusia. Dengan demikian
laboratorium klinik dimana sebagai penunjang pelayanan medis di rumah sakit
terhadap klinisi maupun pasien mempunyai tanggung jawab yang cukup berat.
Hasil pemeriksaan yang diminta oleh pengguna, baik itu klinisi maupun pasien
dan pelaksanaannya oleh laboratorium diharapkan benar–benar terjamin mutunya
(Sukorini dkk, 2010).
Pemantapan mutu internal adalah kegiatan pencegahan dan pengawasan
yang dilaksanakan oleh laboratorium sendiri secara berkesinambungan untuk
memantau dan mengendalikan agar mengurangi kesalahan dan penyimpangan
sehingga akan diperoleh mutu hasil pemeriksaan yang baik (Depkes RI, 2012).
Laboratorium bakteriologi adalah bagian dari laboratorium klinik yang
dalam pelaksanaannya harus melakukan pemantapan mutu internal. Pemantapan
mutu internal Bakteriologi meliputi Kualitas Media, Kualitas Pewarna, Uji
Sensitivitas Antibiotik, Kultur Standar dan Kualitas Peralatan. Kultur standar
minimal yang harus dimiliki laboratorium bakteriologi Antara lain, Eschericia coli
(E.coli) ATCC 25922, Staphylococcus aureus (S.aureus) ATCC 25923 dan
Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa) ATCC 27853, dimana ketiga kultur
standar bakteri tersebut untuk pemeliharaannya dilakukan dengan metode
peremajaan secara berkala (Sukorini dkk, 2010).
Saat menyiapkan galur bakteri untuk distribusi, The American Type Culture
Collection (ATCC) melakukan berbagai pengujian kendali mutu (QC) untuk
menjamin bahwa produk memiliki standar tertinggi sebelum sampai ke konsumen.

1
Semua galur bakteri menjalani pemeriksaan fenotipik dan genotipik menyeluruh
untuk memastikan bahwa identifikasi galur akurat, biakan murni, dan semua hasil
biokimia konsisten. Untuk membantu menjaga standar ini, semua peralatan dan
uji biokimia yang diperlukan dalam proses QC dievaluasi secara serupa untuk
jaminan kualitas. Dijelaskan di bawah ini adalah beberapa tes yang biasa
dilakukan ATCC pada strain bakteri selama analisis QC. National Collection of
Type Cultures (NCTC) adalah penjaga strain bakteri yang mewakili pekerjaan dan
kolaborasi banyak ilmuwan selama hampir 150 tahun. Terdiri dari hampir 6.000
strain dari lebih dari 850 spesies bakteri, setiap strain memiliki sejarah uniknya
sendiri.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa pengertian Quality Control?
2. Apa yang dimaksud dengan ATCC dan NCTC?
3. Bagaimana cara peremajaan dan penyimpanan Bakteri?

1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui pengertian Quality Control
2. Untuk mengetahui pengertian ATCC dan NCTC
3. Untuk mengetahui bagaimana peremajaan dan penyimpanan bakteri.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Quality Control

Quality Control (QC) adalah salah satu komponen dalam proses kontrol dan
merupakan elemen utama dari sistem manajemen mutu. Memonitor proses yang
berhubungan dengan hasil tes serta dapat mendeteksi adanya error yang
bersumber dari alat, keadaan lingkungan atau operator. Memberikan keyakinan
bagi laboratorium bahwa hasil yang dikeluarkan adalah akurat & reliabel.
Laboratorium harus menyusun program QC.
Quality control adalah prosedur manajerial untuk menyesuaikan tahapan-
tahapan dari proses pemeriksaan laboratorium (analitik) untuk memenuhi
standar/spesifikasi tertentu yaitu akurasi dan presisi. Data hasil pemeriksaan
bahan kontrol dianalisis secara statistik dan dipantau untuk menilai keandalan
pemeriksaan. Setiap tes yg dikerjakan di laboratorium harus melakukan
pengerjaan bahan kontrol sehingga akurasi dan presisi setiap test dapat dipantau
dan dijamin validasinya.
Berdasarkan ISO 9000:2015, QC adalah bagian dari manajemen mutu yang
difokuskan pada pemenuhan persyaratan mutu. Dengan kata lain, QC adalah suatu
tahapan dalam metode pengujian yang dilakukan untuk mengevaluasi suatu aspek
teknis pengujian. Oleh sebab itu, QC merupakan pengendalian, pemantauan,
pemeriksaan yang dilakukan untuk memastikan bahwa sistem manajemen mutu
berjalan dengan baik dan benar. Laboratorium dapat menentukan jumlah, jenis,
dan frekuensi dalam pengerjaan kontrol. Jika kontrol tidak ada, laboratorium
harus mempunyai mekanisme alternatif untuk deteksi cepat kesalahan proses
analisis. Memantau proses pemeriksaan menggunakan teknik statistik (Statistical
Quality Control) untuk mendeteksi, meminimalisasi, mencegah, memperbaiki
penyimpangan yang terjadi selama proses analisis berlangsung.

3
 Statistical Quality Control (SQC) berguna untuk memantau perubahan yang
terjadi pada alat, reagen, kalibrator, dan prosedur kerja. Laboratorium melakukan
pemeriksaan yang merupakan kegiatan pelayanan kesehatan dan menjadi dasar
pelayanan di laboratorium kesehatan. Salah satu diantaranya adalah adanya hasil
pemeriksaan laboratorium yang nantinya digunakan untuk penetapan diagnosis,
pemberian pengobatan dan pemantauan hasil pengobatan serta penentuan
prognosis. Strain standar adalah strain bakteri yang digunakan salah satunya pada
uji sensitivitas untuk menguji kualitas cakram antibiotik. Strain bakteri ini harus
dipantau kualitasnya dengan Quality Control, dimana strain standar ini
menentukan keakuratan hasil uji sensitivitas antibiotik untuk menentukan dosis
obat yang diberikan pada pasien. Oleh karena itu Quality Control strain standar
bakteri sangat penting dilakukan secara berkala agar dapat memberikan hasil
seakurat mungkin.

Faktor – faktor yang mempengaruhi ketepatan dan ketelitian

hasil pemeriksaan laboratorium :

1. Personil
Kemampuan teknisi laboratorium berhubungan langsung dengan mutu Pendidikan
dan pelatihan, keahlian, pengalaman, kondisi kepegawaian.

2. Lingkungan
Ruang kerja harus cukup cahaya, cukup penerangan, sejuk, tenang, tidak bising
oleh suara suara kendaraan, AC, freezer dan sebagainya

3. Specimen
Pengambilan specimen, pengolahan specimen, penyimpanan specimen,
pengiriman specimen dan sebagainya, kadang-kadang kurang diperhatikan,
sehingga dapat berpengaruh terhadap hasil pemeriksaan

4
4. Bahan-bahan laboratorium
Mutu reagensia, bahan kimia, cat, media, binatang percobaan, berpengaruh
terhadap hasil pemeriksaan

5. Methode pemeriksaan
Methode pemeriksaan dipilih yang mudah, tepat dan menurut standard yang
diakui oleh DepKes, WHO atau lainnya yang bermutu

6. Peralatan laboratorium
Alat-alat laboratorium harus baik, berfungsi dengan baik, sesuai standard, dan
secara routine di cek fungsi dan ketepatannya.

7. Pembacaan dan pemeriksaan

Pembacaan tergesa-gesa (belum cukup waktu inkubasi), dan pemeriksaan tidak
tepat (jumlah lapangan pandang di microscope kurang), dapat menyebabkan
kesalahan

8. Laporan
Salinan yang salah, laporan tidak lengkap dapat menimbulkan masalah.

Jenis jenis jaminan mutu :

1. Internal quality assurance = internal quality control = Pemantapan

mutu kedalam
Ini berarti bahwa laboratorium itu mempunyai program pengawasan hasil
pemeriksaannya, secara terus menerus dan teratur

Laboratorium bertanggung jawab secara etis untuk memberikan hasil pemeriksaan

yang tepat dan bermanfaat bagi pasien.

Program pengawasan internal quality control dapat dilakukan terhadap :

a. Prosedur kerja laboratorium :

Meliputi :

- Kebersihan ruangan
- Kesehatan personilnya

5
 - Pemisahan ruang kerja dengan ruang makan, minum, merokok
- Kesehatan dan keselamatan kerja
- Penanganan dan penghancuran bahan-bahan terinfeksi
- Immunisasi karyawan
- Pemeliharaan alat
- Penanganan specimen : pengambilan, pengumpulan, pencatatan,
penyimpanan, pengolahan
- Pencatatan dan pelaporan hasil pemeriksaan
- Prosedur mudah, sesuai standard (WHO atau lainnya), tidak
ketinggalan jaman
b. Pemeliharaan alat

Pemeliharaan alat laboratorium yang baik dan benar serta terus menerus
akan menghasilkan kerja alat yang baik, ini akan mempengaruhi mutu hasil
pemeriksaan.

Tabel pemeliharaan dan pengawasan alat-alat laboratorium :

No. Nama alat-alat Pemeliharaan rutine Pengawasan rutine

lab.
1. Anaerobic jar - bersihkan bagian - gunakan strip
dalam setiap indicator setiap kali
minggu. pakai.
- aktifkan - catat perubahan
catalisator pada warna indicator
160°C 2 jam setiap minggu.
sehabis pakai.
- ganti catalisator
setiap 3 bulan.

2. Autoclave - bersihkan dan

ganti air setiap - periksa dan setel
batas air sebelum

6
 bulan. digunakan.
- catat waktu, suhu,
tekanan udara setiap
kali pakai.
- cek sterilitasnya
dengan spore strip
sekali seminggu.

3. Centrifuge - bersihkan dinding

bagian dalam - cek RPM nya setiap
dengan larutan 1-3 bulan.
antiseptic 1
minggu 1 kali,
atau kalau ada
tabung kaca yang
pecah.

4. Hot Air Oven - catat waktu dan suhu

- bersihkan dinding
setiap pemakaian.
bagian dalam 1
bulan 1 kali.

5. Incubator - catat suhunya pagi

hari saat mulai kerja
- bersihkan dinding
(35°C ± 2°C).
bagian dalam dan
raknya 1 bulan 1
kali

6. Refrigerator - catat suhunya pada

- bersihkan dan hari pertama setiap
cairkan 2 bulan 1 minggunya (2 -
kali atau setiap 8°C).
ada kematian
listrik.

7
7. Waterbath - bersihkan dinding - cek batas ketinggian
bagian dalam dan air setiap hari.
ganti airnya 1
- catat suhunya pada
bulan 1 kali.
hari pertama setiap
minggunya.

c. Mutu media (perbenihan) :

Media powder didalam botol lebih baik dari pada buatan sendiri dan lebih
ekonomis dari pada yang tinggal pakai.

Untuk mendapatkan media yang siap pakai dapat diikuti anjuran-anjuran

sebagai berikut :

1. Pemilihan media :
- Stock media dipilih sedemikian rupa sehingga terjadi efisiensi yang tinggi.
- Media isolasi yang dipilih/digunakan yang bersifat sangat selektif
dan kurang selektif.
- Juga sering digunakan media yang bersifat universal dan khusus.
2. Pemesanan dan penyimpanan:
- Jumlahnya cukup untuk 3 - 6 bulan dan ED nya tidak kurang dari 1 tahun,
kemudian.
- Tutup selalu kencang.
- Catat tanggal terima dan tanggal membuka pada label botol.
- Simpan didalam gelap, dingin, kering dan cukup aliran udaranya.
- Gunakan stock yang datang lebih dahulu.
- Buang media yang sudah rusak, lewat ED nya.

8
 - Catat selalu stock yang ada didalam buku stock.
3. Pembuatan media
- Ikuti petunjuk pabrik tanpa merubahnya.
- Buatlah secukupnya saja, jangan berlebihan.
4. Penyimpanan media jadi.

 Lindungi dari cahaya dan panas

 Media yang mengandung darah, ditambah bahan organic atau
antibiotic disimpan didalam lemari es.
 Batas waktu penyimpanan media jadi, bila disimpan didalam gelap
dan dingin yaitu :
- Media didalam tabung dengan tutup kapas/allumunium foil 1
minggu
- Media didalam tabung dengan tutup screw cap 3
bulan
- Media didalam petrie dishes : 1-2
minggu
5. Pengawetan mutu media jadi :

 Test pH :
- Media yang dibuat dari “dehydrated media” tidak perlu dicek
secara rutine
- Media yang dibuat dari formulasi, dicek sesudah dilarutkan didalam
air dan sesudah dingin.
- pH yang lebih/kurang 0,2 dari ketentuan, perlu distel dengan asam
atau alkali.
 Test sterilitas
- Media yang sudah selesai dibuat, diambil beberapa plate/tabung
dimasukkan kedalam incubator 35-37⁰ C selama 2 hari, ada pula yang
dimasukkan kedalam almari es.
Apabila ada pertumbuhan 2 koloni saja per plate/tabung atau ada
kekeruhan pada media cair, itu semua dianggap tidak steril.

 Test mutu
- Setiap media yang sudah jadi, dicoba ditanami dengan bakteri tertentu,
untuk mengetahui apakah media itu dapat ditumbuhi bakteri dan
berfungsi dengan baik atau tidak

9
 - Bakteri yang digunakan untuk mencoba, diperoleh dari specimen
yang diperiksa atau dari stock strain.
d. Mutu cat reagensia, antigen, antisen dan disc obat :

1. Cat dan reagensia :

- Pengawasan dilakukan setiap kali/hari apabila reagent atau cat itu

dibuat saat akan melakukan pemeriksaan, dengan menyertakan control
+ dan –
- Pegawasan dapat pula dilakukan setiap 1 minggu, 3 bulan, 6 bulan atau
setiap cat/reagen yang baru dibuka atau dibuat, terganutng dari sifat
cat/reagen itu apabila terpengaruh udara, cahaya dan sebagainya waktu
penyimpanan
- Cat/reagen boleh dibuang/tidak dipakai apabila ED nya telah
dilampaui atau apabila sudah ada perubahan warna, kekeruhan, ada
precipitasi dan sebagainya.
2. Antigen dan antisera :

Beberapa anjuran untuk mendapatkan hasil yang baik dari antigen dan
antisera :

- Selalu mengikuti petunjuk pabrik

- Simpan dalam suhu yang dianjurkan. Ada beberapa reagen yang
tidak baik bila disimpan didalam freezer
- Hindarkan pengulangan pembekuan dan pencairan
- Buang bila ED nya telah lewat
- Gunakan culture murni dan baru untuk mengetest antisera
- Selalu menyertakan serum control + dan – setiap
menggunakan antigen baru
e. Pemeliharaan dan penyimpanan cukture bacteri standard :

1. Stock culture :

Harus baik dan murni

Baik berarti harus cocok sifat sifat morphologinya, culturnya,

biokimianya, test kimiany, serologinya dan sebagainya

Murni berarti tidak kontaminasi dengan bakteri lain.

1
Stock culture yang harus dipunyai yaitu :

- Staphylococcus aureus ATCC 25923

- Staphylococcus epidermidis
- Streptococcus pyogenes
- Streptococcus agalactiae
- Streptococcus faecalis
- Streptococcus pneumonia
- Salmonella typhimurium
- Shigella flexneri
- Eschericia coli ATCC 25922
- Enterobacter cloacae
- Klebsiella pneumonia
- Citrobacter freundii
- Serratia marcescens
- Proteus mirabilis
- Yersinia enterocolitica
- Acinetobacter calcoaceticus
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 29853
- Vibrio cholera 01 (+non 01)
- Branhamella catarrhalis
- Neisseria gonorrhoeae
- Nesseria meningitides
- Haemophylus influenza
- Haemophylus para-influenza
- Bacteroides fragilis
- Clostridium perfringens
- Candida albicans
2. Penyimpanan/Pengawetan :

- Cara yang terbaik untuk menyimpan culture bacteri yaitu dengan

di lyophilize (kering dalam dingin) ataudiismpan pada suhu -70⁰ C
dengan deepfreezer atau nitrogen cair.
- Stock culture dapat disimpan dengan cara ditanam tusukan didalam
Tryptose Soy agar tubung tegak, setelah tumbuh mulut tabung
dilelehkan, dapat disimpan pada suhu kamar, ada yang tahan
sampai 10 tahun.
- Rutine culture dapat disimpan dengan culture goresan pada TSA
tabung, suhu kamar. Bakteri yang cepat tumbuh dan umrunya
panjang

1
 boleh dipindah tanamkan setiap 2 minggu 1 kali, sedangkan yang
lambat tumbuh dan umurnya oendek boleh dipindahtanamkan
setiap 2-3 hari 1X.
3. Pemeliharaan culture bacteri

Tujuan :

a. Untuk menjaga kelangsungan hidup bakteri yang disimpan.

Ini dilaksanakan dengan menanam kembali bakteri yang disimpan
pada media baru yang sejenis, dalam jangka waktu tertentu.
Pemeliharaan ini diperuntukkan bagi bakteri yang disimpan dengan
culture tusukan dan culture goresan .
Pelaksaan
Staf mikrobiologi
Sampel :
Strain bakteri : shigella sp ATCC, salmonella sp ATCC,pseudomona
aeruginosa ATCC, Neisseria sp ATCC, staphylococcus aurenus ATCC
Escherichia coli ATCC dan , staphylococcus sp ATCC
Alat dan bahan
1. Kultur bakteri (kwik -stik)
2. Cawan petri
3. Alkohol
4. Bunsen
5. Kawat Ose
6. Inkubator 35°C
7. Media pemupuk
8. Media agar darah, salmonella shigella agar dan mac conkey
agar Langkah kerja :
1. Stok kultur jangka panjang
 Disiapkan ruang steril (laminar flow/safety cabinet) dimasukan
medium lempeng agar sesuai dengan jenis kumannya,kawat ose, dan
busen kedalam ruang steril
 Dioleskan kultur bakteri (kwik-stik) ke dalam 5 lempeng agar.
 Diinkubasi ke dalam inkubator 35°C selama 24-48 jam.
 Koloni-koloni dari setiap 1 lempeng agar dimasukan kedalam 10
tabung berisi 1-2 ml TSB gliserin kemudian dihomogenkan
 Disimpan kedalam lemari pendingin (-70°C)
2. Stok kultur mingguan

1
  Didalam ruang steril, diambil satu ose dari satu tabung TSB gliserin
stok kultur jangka panjang kemudian diinokulasi ke dalam lempengan
agar yang baru.
 Diinkubasi ke dalam inkubator 35°C selama 24-48 jam.
 Disimpan ke dalam lemari pendingin (2-8°C)
Intruksi keselamatan kerja
- Menggunakan alat pelindung diri (APD) yang standar
- Melaksanakan prosedur keselamatan kerja dengan benar
- Melaksanakan prosedur pengelolahan limbuah infeksius dengan benar

2.2 ATCC (The American Type Culture Collection)

ATCC berkembang dari koleksi mikroorganisme menjadi pusat sumber
daya hayati global. Selama 95 tahun, ATCC telah didorong oleh misinya yang
mengakar untuk meningkatkan kesehatan masyarakat global melalui kemajuan
dalam sains. Pada awal berdirinya pada tahun 1920-an, ATCC dianggap hanya
sebagai kumpulan kultur mikroba, gudang mikroorganisme yang dapat diambil
oleh para ilmuwan untuk melakukan penelitian mereka untuk membuat penemuan
baru. Saat ini, ATCC memberi para ilmuwan terkemuka dunia koleksi bahan
biologis terbesar dan paling beragam, termasuk tidak hanya produk mikroba tetapi
juga produk sel , alat genomik molekuler, dan asam nukleat. Tahun 1925 ATCC
didirikan ketika sebuah komite ilmuwan mengakui perlunya kumpulan pusat
mikroorganisme yang dapat digunakan para ilmuwan di seluruh dunia untuk
melakukan penelitian mereka untuk memajukan ilmu mikrobiologi. Tahun 1927
Katalog ATCC pertama diterbitkan. Edisi kedua dua tahun kemudian
menunjukkan penekanan ATCC pada kontrol kualitas, mencatat 650 budaya baru
telah di tambahkan, dengan referensi silang yang luas untuk informasi yang lebih
lengkap. Selama belasan tahun pertama, ATCC tumbuh menjadi rumah lebih dari
2.000 strain meskipun kesulitan keuangan dari Depresi Besar. Yayasan
Rockefeller memberikan tambahan $10.000 pada tahun 1930, dan ATCC mulai
membebankan biaya untuk budaya untuk menutupi biaya. Pada tahun 2010 ATCC
menjadi pusat sumber daya hayati mandiri dan sumber daya vital bagi kemajuan

1
dalam ilmu biologi dan berhasil memperluas pemahaman tentang peran penting
standar dalam usaha ilmiah dan sampai sekarang mendukung respon global
COVId-19 hingga mengelola program reagen HIV.
ATCC menyediakan para ilmuwan dengan biomaterial, layanan, dan standar
yang memajukan penelitian, Serta Biomaterial dan layanan berkualitas tinggi
mempromosikan terobosan ilmiah, serta menawarkan komunitas ilmiah produk
biologis yang kredibel, sistem model canggih, dan solusi khusus yang mendukung
penelitian kompleks dalam berbagai aplikasi inovatif yang menghasilkan
pencapaian luar biasa dalam sains dasar, penemuan obat, kedokteran translasi, dan
kesehatan masyarakat.Untuk mendukung penelitian ilmu hayati ke masa depan,
kami memperluas pasar dengan kebutuhan yang terus meningkat, meluncurkan
produk dan layanan komprehensif untuk bahan biologis, terus bermitra dalam
memerangi penyakit global, dan memungkinkan penciptaan teknologi baru.
Koleksi ATCC dari bahan referensi sel dan mikroba tetap menjadi inti dari
terobosan luar biasa dalam eksplorasi ilmiah. Klaster merupakan kumpulan
spesies bakteri yang terdiri dari strain-strain berbeda yang saling berhubungan.
Dalam setiap klaster akan dipilih strain secara acak untuk menjadi sampel dari
spesies tersebut. Strain inilah yang disebut biotipe atau biovar dari spesies dan
sifatnya digunakan untuk menggambarkan spesies tersebut. Strain biotipe inilah
yang digunakan sebagai strain referensi yang tersedia dalam koleksi kultur seperti
"The American Type Culture Collection".
ATCC merupakan kumpulan spesies bakteri yang terdiri dari strain-strain
berbeda yang saling berhubungan oleh karena itu di perlukan penandaan
subspecies untuk menunjukkan sifat-sifat tertentu dari variasi strain, seperti
serotipe, patotipe, morfotipe atau tipe faga, ATCC menetapkan suatu mekanisme
untuk memastikan identitas, kelangsungan hidup dan kemurnian mikroba yang
terdapat dalam produk mikrobiologi komersil, ATCC berisi mikroorganissme
yang di uji oleh ATCC guna menjamin organisme tersebut hidup terus, murni dan
teridentifikasi secara akurat (Asia Net, 2006).

1
2.2.1 Kultur Bakteriologi ATCC
Strain bakteri ATCC dikirim dalam keadaan beku pada es kering dalam
botol plastik kriopreservasi, sebagai biakan terliofilisasi dalam ampul kaca atau
botol serum, atau sebagai biakan hidup pada agar miring atau dalam media
kaldu. Setelah menerima biakan beku, segera hidupkan kembali biakan dengan
mencairkan dan selanjutnya memindahkan biakan ke media pertumbuhan yang
sesuai. Jika hal ini tidak memungkinkan, simpan vial beku dalam uap nitrogen
cair (di bawah -130°C). Sebagai alternatif, bahan beku dapat disimpan antara -
70°C dan -80°C untuk waktu yang singkat (1-5 hari); namun, viabilitas akan
menurun pada suhu di atas -130°C. Kultur beku-kering dapat disimpan dengan
aman pada suhu 4°C atau lebih rendah. Setelah diterima, rehidrasi atau encerkan
biakan menggunakan media yang sesuai dan kondisi inkubasi yang ditentukan
pada lembar produk.
o Lembar produk
Strain bakteri ATCC dikirimkan dengan lembar produk yang berisi
informasi rinci tentang inisiasi dan perluasan bahan, serta kondisi
pertumbuhan dan propagasi yang ideal. Lembar produk ini, serta informasi
tambahan, dapat ditemukan di situs web ATCC atau dapat diminta dari
Departemen Layanan Teknis ATCC.
o Perubahan Nomenklatur
Perubahan taksonomi atau analisis lebih lanjut dari strain bakteri dapat
menyebabkan perubahan nomenklatur. Perubahan ini ditunjukkan pada
lembar produk dan dapat ditemukan secara online di halaman
produk. Informasi lebih lanjut mengenai perubahan nomenklatur bakteri
dapat dilihat pada Daftar Nama Prokariotik dengan Tata Nama Berdiri
(LPSN), yang dapat diakses secara online di www.bacterio.net/ .
o Persiapan Medium

1
 Sebelumnya, siapkan media yang sesuai dan reagen tambahan yang
diperlukan untuk kebangkitan dan pertumbuhan strain bakteri. Pastikan
kondisi inkubasi yang tepat sudah siap. Informasi untuk formulasi dan
penyiapan media dan kondisi inkubasi untuk produk ini tersedia di situs web
ATCC.
o Membuka Ampul Kaca
Semua kultur harus dianggap berpotensi berbahaya dan harus dibuka
oleh individu yang terlatih dalam teknik mikrobiologis yang bekerja di
fasilitas dengan persyaratan penahanan yang sesuai untuk tingkat keamanan
hayati kultur. ATCC merekomendasikan bahwa penanganan atau
pembukaan ampul kaca dilakukan dalam lemari pengaman biologis. Jika ini
tidak memungkinkan, kenakan pakaian pelindung, sarung tangan, pelindung
wajah atau kacamata pengaman, dan jauhkan botol dari tubuh
Anda. Pastikan bahwa semua botol kosong disterilkan sebelum dibuang.

A. Membuka Sediaan Botol Ganda

1. Panaskan ujung botol luar dalam nyala api.

1
 2. Tambahkan beberapa tetes air di ujung panas untuk memecahkan kaca.
3. Pukul ujung botol dengan kikir atau pensil untuk menghilangkan
ujungnya.
4. Lepaskan insulasi dan vial bagian dalam dengan forsep steril. Angkat
sumbat kapas dengan lembut.

B. Membuka Sediaan Vial Tunggal

1. Untuk memulihkan suspensi sel dari ampul kaca, buat skor di leher
ampul dengan kikir kecil yang steril.
2. Desinfeksi bagian luar am
3. pul dengan etanol 70% yang baru disiapkan atau celupkan ke dalam
gelas kimia etanol 70% yang baru disiapkan.
4. Bungkus ampul dalam beberapa lipatan handuk atau kain kasa steril
untuk mengeringkan sisa etanol.
5. Bekerja di tudung aliran laminar, pegang botol dengan tegak dan buka
botolnya. Pastikan kain kasa Anda tidak terlalu basah dengan etanol,
atau alkohol dapat terhisap ke dalam biakan saat vakum
rusak. Rehidrasi bahan segera.

C. Memulai Kultur Beku

1. Siapkan tabung reaksi steril yang berisi media yang direkomendasikan
untuk pertumbuhan bakteri seperti yang tercantum dalam lembar

1
 produk yang disediakan. Pastikan bahwa media mengandung semua
reagen yang diperlukan dan diseimbangkan untuk suhu dan pH.
2. Cairkan botol sampel melalui pengadukan lembut dalam penangas air
yang disetel ke suhu pertumbuhan normal galur itu. Pencairan akan
berlangsung cepat; kurang lebih 2 menit atau sampai semua kristal es
mencair.
3. Keluarkan vial dari penangas air dan dekontaminasi permukaan luar
menggunakan etanol 70%. Ikuti kondisi aseptik yang ketat dalam
tudung aliran laminar untuk semua manipulasi lebih lanjut.
4. Buka tutup botol dan pindahkan seluruh isinya ke tabung reaksi steril
yang berisi media pertumbuhan yang sesuai. Tabung reaksi tambahan
dapat diinokulasi dengan memindahkan 0,5 mL kultur primer ke
kultur sekunder tambahan.
5. Inkubasi biakan di bawah suhu dan kondisi atmosfer yang sesuai
seperti yang direkomendasikan pada lembar produk.
6. Periksa kultur setelah masa inkubasi yang direkomendasikan. Masa
inkubasi akan bervariasi antara strain dan tercantum pada lembar
produk.

D. Memulai Kultur Lyophilized

1. Dengan menggunakan pipet Pasteur, tambahkan 0,5 mL media
pertumbuhan yang direkomendasikan secara aseptik ke bahan kering-
beku. Campur dengan baik.
2. Pindahkan seluruh suspensi ke dalam tabung reaksi yang berisi 5
sampai 6 mL media yang direkomendasikan. Selain itu, pindahkan
beberapa tetes suspensi ke agar miring.
3. Inkubasi biakan di bawah suhu dan kondisi atmosfer yang sesuai
seperti yang direkomendasikan pada lembar produk. Tabung reaksi

1
 tambahan dapat diinokulasi dengan memindahkan 0,5 mL kultur
primer ke kultur sekunder tambahan.
4. Periksa kultur setelah masa inkubasi yang direkomendasikan. Masa
inkubasi akan bervariasi antara strain dan tercantum pada lembar
produk. Kebanyakan kultur beku-kering akan tumbuh dalam beberapa
hari.

CATATAN 1
E. Setelah pemulihan
Menangani Kulturdari kriopreservasi
Tabung Uji atau liofilisasi, beberapa strain
bakteri
1. mungkin
Inkubasi menunjukkan
biakan setelahfasediterima
jeda yangdi berkepanjangan.
bawah suhu yang Strain ini dan
sesuai
mungkinkondisi
memerlukan masa
atmosfer inkubasi
yang yang diperpanjang.
direkomendasikan pada lembar produk. Jangan
simpan kultur di lemari es.
2. Pindahkan biakan ke media segar seperti yang ditentukan pada lembar
produk. Saat mentransfer kultur kaldu, tarik secara aseptik sekitar 1,0
mL kultur dan pindahkan ke dalam 5 mL kaldu segar, atau pindahkan
beberapa tetes suspensi ke agar miring atau cawan. Saat memindahkan
biakan dari agar miring, secara aseptik pindahkan satu koloni ke 5 mL
kaldu segar atau agar miring.
3. Inkubasi biakan di bawah suhu yang sesuai dan kondisi atmosfer yang
direkomendasikan pada lembar produk.

2.2.2 Pertumbuhan dan perbanyakan Bakteri

A. Kondisi Pertumbuhan Bakteri

1
 o Suhu
Suhu pertumbuhan yang optimal dapat bervariasi secara signifikan antar
spesies. Secara umum, sebagian besar strain bakteri patogen atau
komensal tumbuh dengan baik pada suhu tubuh (37°C). Sebaliknya,
banyak strain lingkungan tumbuh subur pada suhu yang lebih rendah,
seringkali dalam kisaran 25°C hingga 30°C.
Spesies bakteri dapat dikategorikan berdasarkan suhu pertumbuhannya,
ini termasuk psikrofil (0°C hingga 20°C) mesofil (25°C hingga 40°C),
dan termofil (45°C hingga 122°C). Meskipun strain bakteri memerlukan
suhu optimal untuk pertumbuhan dan reproduksi, sebagian besar strain
dapat menahan penurunan suhu yang cukup besar dan bertahan beberapa
hari pada suhu 4°C. Pada suhu yang lebih rendah ini, pertumbuhan dan
metabolisme bakteri berkurang secara signifikan.

o Suasana2
CATATAN
Bakteri
Kalibrasi berbeda
sistem dalam
kontrol suhupenggunaan oksigen
inkubator secara untuk
teratur. respirasi.
Gunakan Organisme
sistem
alarmaerobik seperti spesiesuntuk
bila memungkinkan Bacillus, menggunakan
memperingatkan oksigen
terhadap sebagaisuhu
kenaikan akseptor
elektron
di atas terminal
pengaturan selama respirasi. Demikian pula mikroaerofil seperti
optimal.
Helicobacter pylori, juga membutuhkan penggunaan oksigen tetapi pada
tingkat yang lebih rendah daripada yang terjadi secara alami di
lingkungan. Sebaliknya, organisme anaerobik menggunakan akseptor
elektron seperti nitrat atau sulfat, di antara akseptor anorganik lainnya.
Senyawa anorganik bagaimanapun memiliki potensi reduksi yang lebih

2
 rendah daripada oksigen sehingga menghasilkan respirasi yang kurang
efisien.
Penggunaan oksigen dan senyawa anorganik oleh organisme anaerob
dapat sangat berbeda antar spesies. Anaerob obligat , seperti spesies
Clostridium, hanya dapat bertahan hidup dan berkembang biak tanpa
adanya oksigen; organisme ini sering terbunuh oleh adanya oksigen.
Demikian pula, anaerob aerotolerant, seperti spesies Lactobacillus, tidak
dapat menggunakan oksigen selama respirasi. Namun, tidak seperti
anaerob yang ketat, mikroorganisme ini dapat mentolerir oksigen untuk
waktu yang singkat. Terakhir, anaerob fakultatif, seperti Escherichia coli
dan Staphylococcus sp., mampu bertahan hidup baik dihadapan dan tidak
adanya oksigen. Jika diberi pilihan, organisme ini lebih memilih
penggunaan oksigen selama respirasi karena memiliki potensi reduksi
terbesar dibandingkan dengan akseptor elektron lainnya.
Kondisi anaerobik untuk transfer dapat diperoleh dengan salah satu dari
berikut ini:
1. Penggunaan kamar gas anaerobik.
2. Penempatan tabung reaksi di bawah sistem kanula gas yang
terhubung ke gas anaerob.
Selama inkubasi, kondisi anaerobik dapat dipertahankan oleh salah satu
dari berikut ini:
1. Tutup ulir longgar pada tabung reaksi dalam ruang anaerobik.
2. Tutup ulir longgar pada tabung reaksi dalam sistem Gas Pak
anaerobik yang diaktifkan.
3. Penggunaan sumbat karet butil steril pada tabung reaksi sehingga
ruang atas gas anaerobik dipertahankan.

B. Perbanyakan Bakteri
o Perbanyakan Strain Non-Fastidious

2
 1. Buka vial sesuai petunjuk terlampir.
2. Mulailah kultur lyophilized atau beku sesuai dengan instruksi yang
dijelaskan dalam bab sebelumnya, "Memulai dengan Strain Bakteri
ATCC." Pastikan untuk merehidrasi seluruh pelet untuk pemulihan
yang optimal.
3. Pindahkan alikuot ini secara aseptik ke dalam tabung kaldu. Campur
dengan baik.
4. Gunakan beberapa tetes suspensi untuk menginokulasi agar miring
dan/atau pelat yang direkomendasikan.
5. Inkubasi tabung dan pelat pada suhu dan kondisi atmosfer yang
direkomendasikan. Masa inkubasi akan bervariasi antar spesies.

o Perbanyakan Bakteriofag dan Strain ReweL

ATCC harus diperbanyak dalam strain inang bakteri masing-masing.
Untuk memulihkan fag dari botol nitrogen cair beku-kering atau
dicairkan:
1. Siapkan biakan kaldu yang tumbuh aktif dari strain inang yang
direkomendasikan sebelum membuka spesimen fag. Host harus
dalam fase log awal.
2. Tambahkan sekitar 0,25 mL kaldu inang yang direkomendasikan
ke fag beku-kering.
3. Piring pra-hangat dari media yang direkomendasikan dalam
inkubator. Lapisi permukaan dengan 2,5 mL agar 0,5% cair (media
yang sama) yang mengandung satu atau dua tetes inang yang baru
tumbuh. Agar-agar lunak harus dijaga pada suhu 43°C sampai
45°C sampai siap untuk dituang. Mungkin disarankan untuk
menggunakan penangas air. Biarkan overlay mengeras.
4. Fag yang dihidrasi ulang dapat diencerkan secara serial
menggunakan skema pengenceran 1:10 dengan melewatkan 0,25

2
 mL fag ke dalam tabung yang berisi 2,25 mL media kaldu untuk
vial beku-kering; 0,5 mL fag ke dalam tabung yang berisi 4,5 mL
media kaldu untuk vial beku. Ulangi untuk sebanyak mungkin
bagian yang diinginkan.
5. Satu tetes setiap pengenceran terlihat pada permukaan pelat yang
disiapkan. Biarkan ini mengering. Tiga sampai empat pengenceran
dapat ditempatkan pada setiap piring. Setelah inkubasi 24 jam, lisis
akan terlihat. Pada pengenceran yang lebih tinggi, plak individu
harus dapat dihitung.
6. Banyak strain juga dapat dititrasi tanpa lapisan agar yang lunak.
Pipet kira-kira 1,0 mL inang ke permukaan masing-masing pelat.
Setelah memiringkan pelat untuk memastikan seluruh permukaan
tertutup, kelebihan cairan disedot. Setelah permukaan mengering,
berbagai pengenceran fag dijatuhkan ke permukaan seperti
sebelumnya. (Lihat: CATATAN 3)

CATATAN 3
Menempatkan fag pada pelat membuat visualisasi lisis lebih mudah. Jika fag
ditambahkan langsung ke agar lunak sebelum menuangkan piring, plak kabur
atau kecil mungkin sulit dilihat. Bakteri inang yang resisten juga dapat
menutupi pembentukan plak.

Untuk menyebarkan fag:

1. Fag dapat diperbanyak dengan menyiapkan piring dengan lapisan
agar/inang yang lembut seperti di atas dan menutupi permukaan
dengan kira-kira 0,5 mL fag pekat. Atau, sebagai alternatif, Anda
dapat menambahkan fag langsung ke agar/inang yang telah
dilelehkan sebelum dituangkan ke atas piring. Untuk jumlah yang
lebih besar, labu T ukuran besar dapat disiapkan dengan agar-agar

2
 yang direkomendasikan, dan sekitar 12,0 mL agar-agar/inang cair
yang dilelehkan dituangkan di atas permukaan. Phage kemudian
dibiarkan berjalan di atas permukaan yang mengeras. Fag juga
dapat ditambahkan langsung ke agar-agar lunak yang dilelehkan
sebelum dituangkan seperti dijelaskan di atas.
2. Setelah inkubasi 24 jam, atau ketika lisis diamati, agar-agar lunak
dikerok dari permukaan pelat agar-agar. Sentrifugasi pada sekitar
1000 rpm selama 25 menit untuk mengendapkan puing-puing
seluler dan agar-agar. Simpan supernatannya.
3. Supernatan ini dilewatkan melalui filter Millipore .22 m dan
filtratnya disimpan pada suhu 4°C hingga 8°C. Lisat harus tetap
hidup di bawah pendinginan untuk waktu yang lama. Mereka juga
dapat dibekukan dengan atau tanpa krioprotektan. Jika tersedia,
penyimpanan nitrogen cair adalah metode terbaik untuk
penyimpanan jangka panjang. Kebanyakan fag juga dapat
dibekukan kering. ATCC menggunakan susu skim kekuatan ganda
yang dicampur setengah-setengah dengan filtrat. (Lihat:
CATATAN 4)

CATATAN 4
Metode perbanyakan kaldu juga dapat digunakan dengan sebagian besar fag.
Kecuali dinyatakan lain dalam lembar produk, ATCC menggunakan metode
pelapisan agar Adams seperti yang dijelaskan dalam Bakteriofag 2 MH Adams
untuk produksi fag rutin.

C. Bacteroidaceae, Anaerobik
Banyak spesies Bacteroidaceae membutuhkan kondisi anaerobik untuk
pertumbuhannya. ATCC merekomendasikan penggunaan media pra-
reduksi yang baru disiapkan atau disiapkan sebelumnya dan disimpan

2
 dalam kondisi anaerobik. Media dapat disiapkan dengan zat pereduksi dan
disimpan dalam lingkungan anaerobik seperti ruang anaerobik. Untuk
menyiapkan media pra-reduksi, tambahkan 0,1 mL zat pereduksi untuk
setiap 5-10 mL campuran dan diamkan selama minimal 30 menit. Salah
satu dari zat pereduksi berikut yang sesuai: 1,5% Na2S * 9H2O, 3% sistein,
atau 5% koenzim M. Media Pre-reduced Anaerobically Sterilized (PRAS)
juga tersedia secara komersial. Di bawah kondisi anaerobik, media direbus
bebas dari molekul oksigen, zat pereduksi ditambahkan, dan media
kemudian diautoklaf dan dikeluarkan.
1. Rehidrasi isi vial dalam kondisi anaerobik dengan 0,5 mL media kaldu
yang direkomendasikan.
2. Pindahkan alikuot ini secara aseptik ke dalam 5 mL kaldu yang sama.
Pada saat ini, Anda dapat menginokulasi agar miring dari media yang
sama dan piring agar darah, menggunakan 0,1 mL suspensi sel untuk
masing-masing.
3. Menginkubasi kaldu dan miring pada 37° C dalam kondisi anaerobik.
a. Kondisi anaerobik dapat diperoleh dengan metode yang dijelaskan
dalam bab sebelumnya, “Pertumbuhan dan Perbanyakan Bakteri.”
4. Inkubasi lempeng agar darah secara anaerobik untuk pembentukan
koloni atau secara aerobik untuk pemeriksaan kontaminasi aerobik.
5. Setelah masa inkubasi yang sesuai, yang bergantung pada strain,
pertumbuhan harus dibuktikan dengan kekeruhan dalam kaldu dan
koloni pada permukaan agar-agar anaerob. Pelat darah aerobik
seharusnya tidak menunjukkan pertumbuhan.

D. Bdellovibrio sp.
Anggota genus Bdellovibrio (misalnya, ATCC 27047) adalah predator
spesifik inang bakteri Gram-negatif. Oleh karena itu, perlu dilakukan
kultur pertumbuhan galur inang sebelum membuka vial pemangsa. Di

2
bawah ini, kami menjelaskan prosedur dasar tentang cara
membudidayakan Bdellovibrio .
1. Sebelumnya, kultur strain inang yang sesuai sesuai dengan kondisi
pertumbuhan yang direkomendasikan.
2. Rehidrasi pelet beku-kering Bdellovibrio sp. dengan 0,5 mL media
yang direkomendasikan dan pindahkan suspensi ke dalam tabung
reaksi steril.
3. Tambahkan kira-kira 0,5 mL galur inang yang sedang tumbuh.
4. Lelehkan agar-agar dalam tabung yang berisi 2,5 mL masing-masing
0,6% agar-agar semi-padat dan tempatkan tabung-tabung itu dalam
penangas air yang diatur pada suhu 45°C.
5. Tambahkan 0,2-0,3 mL suspensi inang/predator ke setiap tabung agar
yang meleleh dan tuangkan di atas permukaan pelat media agar yang
direkomendasikan yang telah dihangatkan sebelumnya.
6. Inkubasi cawan secara aerobik pada suhu 30°C selama 2-3 hari. Amati
setiap hari sampai plak atau kliring terlihat.
7. Gosok lapisan luar ke dalam tabung reaksi dan sentrifus dengan
kecepatan rendah untuk mengendapkan agar-agar dan puing-puing
seluler. The Bdellovibrio harus dalam supernatan. Periksa sel kecil
yang bergerak cepat di bawah dudukan basah.

2
E. Borrelia burgdorferi
B. burgdorferi adalah organisme yang rapuh dan sensitif yang harus
memiliki media dan kondisi yang sesuai untuk pertumbuhannya.
Suplementasi serum kelinci ke media Barbour-Stoenner-Kelly (BSK)
yang dibutuhkan sangat penting untuk pertumbuhan organisme ini. Selain
itu, media segar meningkatkan pertumbuhan, dan media yang lebih tua
dari satu bulan tidak boleh digunakan.
1. Lelehkan dan pindahkan secara aseptik seluruh isi vial nitrogen cair ke
dalam tabung yang berisi 5-6 mL media segar yang
direkomendasikan. Campur dengan baik.
2. Pindahkan sepersepuluh suspensi sel ke dua atau tiga tabung media
segar lainnya.
3. Inkubasi bakteri pada suhu 32°C hingga 37°C dalam kondisi
mikroaerofilik.
4. Pertumbuhan biasanya terjadi setelah 48 jam, meskipun beberapa
galur membutuhkan waktu beberapa hari untuk tumbuh. Pembentukan

2
 asam selama pertumbuhan akan mengubah media menjadi warna
oranye terang atau kekuningan. Kekeruhan tidak terlihat. Sel dapat
dipantau di bawah mikroskop medan gelap sebagai batang spiral
panjang dengan motilitas berkedut.
F. Leptospira sp.
Leptospira merupakan strain aerobik yang cukup sulit untuk dikultur.
ATCC merekomendasikan untuk membiakkan bakteri ini dalamMedium
Leptospira yang dilengkapi dengan agar (formulasi medium ATCC
1470). (Lihat: CATATAN 5)

CATATAN 5
Formulasi media yang digunakan oleh ATCC dapat ditemukan di situs web
ATCC. Harap dicatat bahwa sebagian besar media mikroba saat ini tidak
dijual di ATCC.

1. Tarik suspensi sel secara aseptik dari vial yang dicairkan dan
inokulasikan tabung 10 atau 12 mL media yang direkomendasikan,
masukkan pipet tepat di bawah permukaan media semi-padat. Aliquot
0,5 mL dari tabung ini dapat digunakan untuk menginokulasi tabung
tambahan jika diperlukan. Plate darah aerobik juga dapat digores
untuk menguji kemurniannya.
2. Inkubasi tabung reaksi dengan tutup ulir yang sedikit dikencangkan
dengan pelat darah secara aerobik pada suhu 30°C.
3. Pertumbuhan awal dapat berlangsung dari 6 hingga 20 hari tergantung
pada jenisnya. Amati pertumbuhan sebagai pita tipis yang terbentuk
tepat di bawah permukaan media. Pita menebal saat inkubasi
berlanjut. Morfologi seluler di bawah mikroskop medan gelap
menunjukkan sel spiral aktif dengan motilitas lentur. Plate darah
aerobik seharusnya tidak menunjukkan tanda-tanda pertumbuhan.

2
G. Campylobacter sp.
Spesies Campylobacter seringkali sulit untuk tumbuh dan dipelihara.
Banyak spesies Campylobacter, seperti C. concisus, C. mukosalis, dan C.
Showae, membutuhkan kaldu Brucella albimi atau media agar kedelai
trypticase yang telah dilengkapi dengan format dan fumarat.
1. Rehidrasi isi vial dengan 0,5 mL media yang direkomendasikan.
Pindahkan suspensi secara aseptik ke dalam 5,0 mL kaldu yang sama.
2. Inokulasi pelat agar yang sudah disiapkan, agar miring, atau tabung
kaldu dengan 0,1 mL alikuot suspensi. Tutup sekrup pada tabung
dengan longgar untuk memungkinkan pertukaran gas.
3. Inkubasi biakan pada 37°C di bawah kondisi mikroaerofilik
menggunakan tabung anaerob dan generator gas mikroaerofilik
Campylobacter dengan katalis aktif atau sistem lain yang sesuai yang
memberikan campuran atmosfer akhir 3-5% oksigen dan 10% karbon
dioksida.
4. Awalnya, inkubasi 3-7 hari mungkin diperlukan sebelum pertumbuhan
terlihat jelas. Subkultur selanjutnya hanya membutuhkan 2-3 hari.

H. Helicobacter sp.
SpesiesHelicobacter telah diisolasi dari berbagai hewan, termasuk
manusia. Mereka membutuhkan kondisi pertumbuhan mikroaerofilik dan
dapat ditumbuhkan pada trypticase soy agar yang dilengkapi dengan 5%
darah domba yang telah didefibrinasi. Di bawah ini, kami menjelaskan
metode bifasik darikebangkitan Helicobacter. Metode ini memberikan
pemulihan terbaik dan pertumbuhan paling cepat dibandingkan dengan
metode perbanyakan lainnya.
1. Tambahkan 0,5 mL media kaldu yang direkomendasikan ke dalam
vial.
2. Campur isi dengan ujung pipet sampai pelet rehidrasi.

2
 3. Tambahkan 0,4 mL suspensi ke agar miring segar dari media yang
direkomendasikan. Tambahkan sisa 0,1 mL ke piring agar-agar
segar.
4. Tempatkan cawan dan kultur miring tabung reaksi ke dalam stoples
anaerob dengan katalis aktif dan generator gas mikroaerofilik Gas
Pak atau di dalam inkubator yang dapat diatur untuk kondisi
mikroaerofilik (3-5% oksigen dan 10% karbon dioksida).
5. Inkubasi biakan pada suhu 37°C selama 72 jam.
6. Setelah 72 jam inkubasi, Anda harus mengamati koloni kecil pada
permukaan agar-agar dan miring. Harus ada pertumbuhan berat di
bagian cair dari kemiringan biphasic.

I. Legionella pneumophila
Strain L. pneumophila adalah nutrisi yang teliti dan sangat sensitif
terhadap kaliber media pertumbuhan yang direkomendasikan, media
ekstrak ragi arang (CYE) (dibuffer). ATCC merekomendasikan agar pH
media diperiksa saat suhu media dingin. Selain itu, media harus disimpan
dalam gelap karena paparan cahaya dapat mengakibatkan akumulasi
peroksida, yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

3
 1. Simpan vial pada suhu 4°C hingga siap digunakan.
2. Rehidrasi bahan beku-kering dengan 0,5 mL kaldu yang
direkomendasikan.
3. Setelah pelet larut, pindahkan isi vial ke dalam tabung reaksi yang
berisi 5-6 mL kaldu. Aliquot dari kaldu ini dapat dipindahkan ke
tabung kaldu tambahan, ke agar miring, atau ke piring agar untuk
pemeriksaan kemurnian dan viabilitas.
4. Inkubasi biakan pada 37°C di bawah kondisi atmosfer 5% karbon
dioksida. Strain harus menunjukkan pertumbuhan setelah 48 jam.

J. Mollicutes
Mollicutes adalah kelas bakteri yang dibedakan oleh tidak adanya
dinding sel. Sebaliknya, sebagian besar anggota kelas ini mengandung
sterol dalam membran sel mereka untuk meningkatkan kekakuan
membran. Beberapa genus yang termasuk dalam kategori ini antara lain
Mycoplasma, Spiroplasma, dan Ureaplasma. Bakteri di kelas ini
cenderung membutuhkan media pertumbuhan yang kaya dan sering
sensitif terhadap pertumbuhan berlebih.
1. Menggunakan media yang direkomendasikan, pipet 2,0 mL kaldu
ke dalam tabung steril. Siapkan tabung tambahan, masing-masing
berisi 4,5 mL kaldu.
2. Buka botol beku-kering seperti yang diarahkan. Larutkan pelet
dengan menggunakan kira-kira 0,5 mL kaldu dari tabung yang
berisi 2,0 mL ke dalam pelet beku-kering. Tarik suspensi dan
pindahkan kembali ke dalam tabung.
3. Lakukan pengenceran serial dengan memindahkan 0,5 mL dari
tabung pertama ke tabung dengan 4,5 mL, dan kemudian 0,5 mL
dari tabung kedua ke tabung ketiga, dst. Seri pengenceran ini
penting untuk tujuan titering serta untuk menjaga kultur dalam

3
 berbagai tahap pertumbuhan. Banyak strain mollicutes mati ketika
kultur menjadi basa.
4. Inkubasi tabung di bawah kondisi kultur yang direkomendasikan
dan suhu untuk setiap strain. Masa inkubasi akan berbeda antara
strain. Untuk galur yang membutuhkan kondisi anaerob, ATCC
merekomendasikan agar tabung anaerob atau prosedur lain yang
sesuai digunakan.

K. Bakteri Sulfur Hijau dan Ungu Bakteri belerang

Hijau dan ungu adalah kelompok strain bakteri anaerobik atau
mikroaerofilik yang mampu melakukan fotosintesis. Tidak seperti
ganggang, mereka tidak menggunakan air sebagai agen pereduksinya;
sebaliknya, mereka menggunakan hidrogen sulfida.
1. Pindahkan kultur yang sedang tumbuh ke media segar yang
direkomendasikan, isi setiap botol 125 mL dengan tutup ulir ke
atas.
2. Inkubasi biakan pada suhu kamar di bawah lampu pijar 2.000-
3.000 lux sampai unsur belerang (yaitu sifat susu) yang terbentuk
menghilang.
3. Beri makan kultur dengan 1,0-2,0 mL larutan sulfida netral steril.

o Titering Bakteri
Jumlah sel bakteri diperlukan untuk menetapkan atau memantau tingkat
pertumbuhan bakteri serta untuk menyiapkan kultur baru dengan jumlah
sel yang diketahui.4 Kultur bakteri dapat dititrasi melalui penentuan
jumlah unit pembentuk koloni per mililiter (CFU/mL) atau dengan
mengukur kerapatan optik pada panjang gelombang 600 nm (OD600).
Untuk menghitung CFU/mL dalam suspensi bakteri pada titik waktu
tertentu, keluarkan alikuot dari larutan yang tumbuh aktif dan lakukan
pengenceran serial dalam media kaldu yang sesuai (Lihat: CATATAN

3
 6). Tingkat pengenceran akan tergantung pada tingkat pertumbuhan dan
fase strain. Setiap pengenceran harus disebar ke beberapa piring yang
terdiri dari media berbasis agar-agar yang sesuai, kemudian ditumbuhkan
dalam kondisi optimal. Setelah periode pertumbuhan yang sesuai, hitung
jumlah koloni yang tumbuh pada setiap cawan. Untuk hasil terbaik,
hanya gunakan pelat yang menyimpan jumlah koloni antara kisaran 25-
250 koloni karena ini akan memberikan representasi yang akurat dari
titer bakteri. Untuk menentukan CFU/mL, hitung rata-rata jumlah koloni
dari satu seri pengenceran kemudian bagi dengan pengenceran akhir di
piring. Misalnya, jika Anda memiliki tiga hitungan 40, 37, dan 43 dari
satu set pelat pada pengenceran akhir 107, titer bakteri akan menjadi 4,0 x
108CFU/mL.

CATATAN 6
Untuk memastikan bahwa konsentrasi bakteri dari biakan asli tetap konstan
selama penentuan titer, pertumbuhan dapat dihentikan pada 4C. Perhatikan
bahwa pada 4°C, viabilitas kultur dapat terganggu, atau sebagai alternatif,
beberapa strain bakteri dapat terus tumbuh perlahan.

Sebuah spektrofotometer juga digunakan untuk titer suspensi bakteri

meskipun menentukan kerapatan optik, atau absorbansi, sampel.
Konsentrasi kultur bakteri diukur dengan memproyeksikan seberkas
cahaya, pada panjang gelombang tunggal 600 nm, melalui suspensi
dalam kuvet transparan. Ketika berkas cahaya melewati sampel, sebagian
cahaya diserap sementara cahaya yang tersisa diukur dengan fotometer.
Umumnya, semakin pekat suatu larutan, semakin banyak cahaya yang
diserap, dan semakin tinggi pengukuran OD. Untuk memastikan bahwa
pembacaan OD600 yang dihasilkan oleh spektrofotometer adalah OD

3
 suspensi bakteri dan bukan OD medium, kosongkan mesin sebelum
digunakan dengan kontrol medium saja.
Tingkat pertumbuhan dan persyaratan kultur bakteri dapat bervariasi
secara drastis antar spesies, sehingga sulit untuk mengukur titer
bakteri. Untuk informasi lebih lanjut tentang cara membiakkan galur
tertentu, lihat lembar produk untuk detailnya. Informasi tambahan juga
dapat ditemukan di Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd
Edition.1(Lihat:CATATAN 7)

CATATAN 7
Beberapa genera bakteri, seperti Borrelia dan Leptospira, biasanya tidak
dibiakkan pada media berbasis agar. Untuk strain ini, ATCC menggunakan
mikroskop cahaya untuk menetapkan titer.

2.2.3 Penyimpanan Bakteri

Kebanyakan strain bakteri dapat disimpan selama bertahun-tahun sebagai
kultur beku-kering (liofilisasi) atau pada suhu di bawah -130°C (kriopreservasi). 4
Ada banyak keuntungan pengawetan yang jauh lebih besar daripada investasi
yang dibutuhkan dalam peralatan dan reagen yang dibutuhkan untuk memelihara
budaya hidup. Keuntungan ini meliputi:
 Keamanan keseluruhan stok bakteri terhadap kerugian karena kegagalan
peralatan atau kontaminasi oleh organisme mikroba lainnya.
 Penghapusan waktu, energi, dan biaya material yang terkait dengan
pemeliharaan strain bakteri yang saat ini tidak digunakan.
 Asuransi terhadap penyimpangan fenotipik yang terkait dengan
perjalanan yang berkepanjangan, karena ketidakstabilan genetik dan/atau
tekanan selektif.
 Membuat stok kerja standar yang dapat digunakan untuk serangkaian
percobaan.

3
Kriopreservasi
Gambaran
Umumnya, pembekuan suspensi sel hidup dapat mengakibatkan penurunan
viabilitas. Saat suspensi sel bakteri didinginkan di bawah titik beku, kristal es
mulai terbentuk dan konsentrasi zat terlarut dalam suspensi meningkat.
Pembentukan kristal es intraseluler dapat mengakibatkan kerusakan struktur
seluler. Efek ini dapat diminimalkan jika air di dalam sel dibiarkan keluar melalui
osmosis selama proses pendinginan. Laju pendinginan yang lambat, umumnya -
1°C hingga -10°C per menit, memfasilitasi perkembangan ini. Namun, karena sel
kehilangan air, ukurannya menyusut dan akan cepat kehilangan viabilitasnya jika
melebihi volume ambang batas minimum. Penambahan agen krioprotektan,
seperti gliserol atau dimetilsulfoksida (DMSO), akan mengurangi efek ini. 18,19
Untuk pengawetan kultur bakteri, ATCC merekomendasikan penggunaan gliserol
sebagai krioprotektan.
Prosedur standar untuk kriopreservasi adalah membekukan sel secara
perlahan hingga mencapai suhu di bawah -70°C dalam media yang mengandung
krioprotektan. Botol kemudian dipindahkan ke freezer nitrogen cair untuk
mempertahankan kultur pada suhu di bawah -130°C.
Pemulihan sel kriopreservasi membutuhkan pencairan cepat suspensi
bakteri dalam penangas air 37°C. Seluruh isi vial kemudian dipindahkan ke media
pertumbuhan yang sesuai.
Ada banyak faktor yang dapat mempengaruhi kelangsungan hidup strain
bakteri pulih. Parameter penting ini dapat mencakup komposisi bahan beku, fase
pertumbuhan strain bakteri, atau konsentrasi sel bakteri dalam larutan. Untuk
mendapatkan viabilitas sel yang optimal setelah pemulihan, modifikasi prosedur
kriopreservasi untuk setiap strain bakteri, pastikan untuk memanen kultur selama
fase pertumbuhan logaritmik akhir.

3
 Hubungi ATCC untuk informasi lebih lanjut tentang kriopreservasi galur
bakteri. Strain bakteri ATCC yang dibekukan biasanya diawetkan dengan media
yang terdiri dari konsentrasi akhir 10% gliserol steril.

Bekukan Medium
Gliserol dan DMSO adalah agen krioprotektan yang paling umum. ATCC
terutama merekomendasikan penggunaan stok gliserol 20% pada konsentrasi
akhir 10%. Namun, jika strain bakteri sensitif terhadap gliserol, stok DMSO 50%
dapat digunakan pada konsentrasi akhir 5%. Sebaliknya, gliserol dapat disterilkan
melalui autoklavasi sedangkan DMSO harus disterilkan dengan filtrasi. Perawatan
harus digunakan saat menangani larutan DMSO apa pun karena akan dengan
cepat menembus kulit yang utuh dan dapat membawa kontaminan beracun
bersamanya.
Gunakan hanya DMSO atau gliserol tingkat reagen. Simpan keduanya
dalam alikuot yang terlindung dari cahaya. ATCC menawarkan DMSO (ATCC 4-
X) yang telah diuji secara menyeluruh untuk digunakan, serta TSB dengan 10%
gliserol (ATCC 20-2200) untuk kriopreservasi bakteri non-rewel. Secara
keseluruhan, formulasi optimum untuk strain bakteri individu harus ditentukan
secara empiris.

Peralatan
A. Botol kriopreservasi
Ada dua bahan yang dapat dipilih untuk botol kriopreservasi: kaca atau
plastik. Botol kaca lebih sulit untuk dikerjakan; mereka perlu disterilkan
sebelum digunakan, mereka harus disegel dengan api panas, dan mereka
bisa sulit dibuka. Namun, mereka lebih disukai untuk penyimpanan jangka
panjang (bertahun-tahun) dari budaya yang berharga dan dianggap aman
dari kegagalan setelah disegel dengan benar. Jika kriopreservasi dalam
ampul kaca tidak memungkinkan, botol plastik dapat digunakan. Botol
plastik tersedia dalam dua jenis: yang memiliki ulir internal dan paking

3
 silikon, dan yang memiliki ulir eksternal. Botol dengan ulir internal adalah
yang pertama tersedia secara komersial, tetapi memiliki beberapa
kelemahan dibandingkan versi ulir eksternal. Misalnya, sementara paking
silikon memberikan segel yang sangat baik, itu perlu dikencangkan dengan
benar; botol akan bocor jika segelnya terlalu kencang atau terlalu longgar.
Untuk penyimpanan stok cryopreserved, ATCC menggunakan vial plastik.
B. Ruang pembekuan laju terkendali
C. Ada beberapa cara untuk mencapai laju pendinginan -1°C per
menit. Metode terbaik melibatkan penggunaan unit pembekuan elektronik
yang dikendalikan komputer dan dapat diprogram (seperti Thermo
Scientific* CryoMed Freezers), yang secara ketat mempertahankan laju
pendinginan ini. Ini adalah metode yang digunakan secara eksklusif di
ATCC. Peralatan tersebut relatif mahal dan mutlak diperlukan hanya untuk
strain yang paling sensitif. Pendekatan yang lebih murah adalah dengan
menempatkan botol kriopreservasi ke dalam ruang berinsulasi dan
dinginkan selama 24 jam dalam freezer mekanis pada suhu -70 °C atau
lebih dingin. Ada beberapa ruang pembekuan yang tersedia secara
komersial yang mencapai laju pendinginan yang sangat mendekati ideal -
1°C per menit (CoolCell LX; ATCC ACS-6000). Sebagai alternatif, botol
dapat ditempatkan ke dalam kotak polistiren, dengan dinding tebal 15 mm
(3/4 inci) dan kapasitas 1L yang dikemas dengan kertas, kapas, atau
kacang busa untuk insulasi.

2.2.3.1 Penyimpanan Pembekuan Nitrogen Cair

Suhu sangat rendah (di bawah -130 °C) yang diperlukan untuk penyimpanan
jangka panjang dapat dipertahankan dengan freezer listrik khusus, atau lebih
umum, dengan freezer nitrogen cair. Ada dua tipe dasar sistem penyimpanan
nitrogen cair: merendam vial dalam cairan atau menahan vial dalam fase uap di
atas cairan. Sistem fase cair menampung lebih banyak nitrogen dan karenanya

3
membutuhkan lebih sedikit perawatan. Namun, selalu ada kemungkinan bahwa
beberapa cairan akan masuk ke dalam botol yang tidak disegel dengan benar, yang
kemudian dapat meledak saat diambil. Untuk alasan ini, ATCC sangat
merekomendasikan penyimpanan dalam fase uap.
Sistem penyimpanan fase uap menciptakan gradien suhu vertikal di dalam wadah
nitrogen cair. Suhu di bagian bawah wadah akan menjadi -196°C, sedangkan suhu
di bagian atas akan bervariasi tergantung pada jumlah nitrogen cair di bagian
bawah dan lama waktu wadah dibuka. Untuk memastikan penyimpanan sel yang
aman, pertahankan kadar nitrogen cair yang cukup dalam wadah sehingga suhu di
bagian atas adalah -130 °C atau lebih dingin. Semua sistem penyimpanan harus
dilengkapi dengan alarm suhu. Prosedur Kriopreservasi
Prosedur di bawah ini akan bekerja untuk sebagian besar jenis bakteri yang tidak
rewel dan harus dimodifikasi sesuai kebutuhan. Informasi tambahan tentang
pelestarian strain bakteri yang rewel dapat ditemukan di segmen terakhir dari bab
ini. Formulasi media beku untuk strain bakteri ATCC dapat ditemukan di situs
web ATCC.
1. Dalam persiapan untuk pembekuan, tumbuhkan strain bakteri di bawah
kondisi optimal dalam media yang sesuai untuk mempertahankan fitur
yang menonjol dari strain. Strain bakteri harus ditumbuhkan sampai fase
log akhir.
2. Saat membekukan bakteri, tambahkan 5 sampai 10% gliserol atau DMSO
dalam media kultur. Gliserol biasanya dibuat dalam larutan berair pada
dua kali lipat konsentrasi akhir yang diinginkan untuk
pembekuan. Kemudian dicampur dengan jumlah suspensi sel yang sama.
3. Label jumlah botol yang sesuai dengan nama strain bakteri dan
tanggal. Aliquot 1 hingga 1,8 mL suspensi bakteri ke setiap botol dan
segel. Tutup ampul plastik rapat-rapat dengan tutup ulir. Tutup ampul
kaca dengan obor gas-oksigen, tarik leher ampul saat diputar dalam nyala
api.

3
 4. Biarkan sel-sel untuk menyeimbangkan dalam media beku pada suhu
kamar selama minimal 15 menit tetapi tidak lebih dari 40menit. Setelah
40 menit, viabilitas sel dapat menurun jika DMSO digunakan sebagai
krioprotektan.
5. Tempatkan vial ke dalam ruang beku yang telah didinginkan sebelumnya
(4°C), dengan laju terkendali dan tempatkan ruang tersebut dalam freezer
mekanis pada suhu -70 °C (atau lebih dingin) setidaknya selama 24
jam. Sebagai alternatif, gunakan unit freezer terprogram (4°C) yang telah
didinginkan sebelumnya yang disetel untuk mendinginkan botol pada -
1°C per menit hingga tercapai suhu di bawah -40°C dan kemudian atur
suhu untuk tiba-tiba turun ke -10°C .
6. Pindahkan vial dengan cepat ke nitrogen cair atau freezer -130 °C.
7. Catat lokasi dan detail pembekuan.
8. Setelah 24 jam pada -130 ° C, keluarkan satu botol, kembalikan strain
bakteri dalam media kultur, dan tentukan viabilitas dan sterilitasnya.
Pemulihan Sel Cryopreserved
Solusi bakteri beku perlu dihangatkan secepat mungkin dan kemudian segera
dipindahkan ke media pertumbuhan yang sesuai. Beberapa jenis bakteri mungkin
membutuhkan waktu lebih lama dari biasanya untuk pulih sepenuhnya dari
kriopreservasi.
1. Siapkan wadah kultur yang berisi setidaknya 10 mL media pertumbuhan
yang sesuai yang diseimbangkan untuk suhu dan pH.
2. Keluarkan vial dari freezer nitrogen cair dan cairkan dengan pengadukan
non-Yahudi dalam penangas air 37°C (atau penangas yang disetel pada
suhu pertumbuhan normal untuk galur bakteri tersebut). Lelehkan saring
dengan cepat sampai semua kristal es mencair (kurang lebih 2 menit).
3. Keluarkan vial dari penangas air dan dekontaminasi dengan mencelupkan
atau menyemprotkan etanol 70%. Ikuti kondisi aseptik yang ketat dalam
tudung aliran laminar untuk semua manipulasi lebih lanjut.

3
 4. Buka tutup botol dan pindahkan seluruh isinya ke media pertumbuhan
yang sudah disiapkan.
5. Periksa budaya setelah jangka waktu yang tepat.

Liofilisasi
Gambaran
Pengeringan beku adalah proses di mana air dan pelarut lainnya dikeluarkan dari
produk beku melalui sublimasi. 20 Sublimasi terjadi ketika cairan beku langsung
ke keadaan gas tanpa memasuki fase cair. Proses pengeringan beku menghasilkan
produk yang stabil dan mudah direhidrasi. Proses ini terdiri dari tiga langkah: pra-
pembekuan produk untuk membentuk struktur beku, pengeringan primer untuk
menghilangkan sebagian besar air, dan pengeringan sekunder untuk
menghilangkan air terikat.
Selama proses pembekuan awal, kristal es mulai terbentuk dan konsentrasi zat
terlarut dalam suspensi meningkat. Metode yang digunakan selama pembekuan
dapat sangat mempengaruhi kemampuan untuk membekukan-kering
bahan. Disarankan untuk menggunakan laju pendinginan yang lambat karena hal
ini akan menghasilkan pembentukan struktur kristal es vertikal, sehingga
memungkinkan sublimasi air yang lebih efisien dari produk beku.
Produk beku-kering bersifat higroskopis dan harus dilindungi dari kelembaban
selama penyimpanan. Selain itu, produk ini sensitif terhadap faktor lain termasuk
oksigen dan suhu, yang secara signifikan dapat mengurangi umur simpan. Penting
untuk menyimpan bahan beku-kering dengan cara yang melindungi produk dari
paparan kelembaban dan oksigen, dan untuk menyimpan bahan pada suhu yang
didinginkan (4°C).
Hubungi ATCC untuk informasi lebih lanjut tentang liofilisasi strain
bakteri. Kebanyakan strain bakteri ATCC untuk distribusi disiapkan sebagai
kultur beku-kering.

4
Peralatan
A. Botol Liofilisasi
Untuk penyimpanan organisme beku-kering, ATCC menggunakan ampul kaca
botol ganda dan botol serum bersumbat. Ampul kaca botol ganda digunakan
untuk liofilisasi kultur batch melalui pengering beku komponen. Sampel yang
disiapkan di dalam vial ini pada awalnya dikeringkan dengan cara dibekukan
dalam vial bagian dalam yang disumbat kapas, yang kemudian disegel dalam
vial luar di bawah vakum. Botol luar dilengkapi dengan sejumlah kecil
pengering silika gel, yang mempertahankan keadaan kekeringan. Sampel yang
diawetkan dengan cara ini dapat disimpan tanpa batas waktu. Sebaliknya, botol
serum bersumbat digunakan untuk liofilisasi menggunakan metode
Preceptrol. Teknik khusus ini dikembangkan sebagai cara untuk menghasilkan
sejumlah besar botol dengan cara yang hemat biaya. Strain bakteri yang
diawetkan dengan cara ini adalah strain populer yang sering digunakan dalam
kontrol kualitas, pengajaran, dan pengujian. Dalam metode ini, bahan
dibekukan-kering dalam botol serum kaca kemudian ditutup dengan sumbat
karet dan tutup logam. Karena sampel ini biasanya didistribusikan dalam botol
serum yang ditutup dengan sumbat karet butil daripada ampul botol ganda,
mereka lebih murah untuk diproduksi dan memungkinkan ATCC untuk
mengurangi biaya yang biasa. Sampel yang disiapkan dengan metode
Preceptrol memiliki masa simpan sekitar 5 tahun.

B. Aparatus Liofilisasi
Ada beberapa metode yang tersedia untuk liofilisasi bakteri. Dua metode yang
digunakan oleh ATCC termasuk metode Preceptrol dan penggunaan
Component Freeze-dryer. Dalam kedua prosedur pengeringan beku, sampel
dicampur dengan pengawet yang sesuai, dimasukkan ke dalam ampul yang
sesuai, dan dibiarkan membeku perlahan menjadi massa padat. Setelah
dibekukan, sampel diliofilisasi dalam sistem pengeringan beku (VirTis Genesis

4
 Pilot Lyophilizer, Millrock Technology Max85 Freeze Dryer). Selama fase
pengeringan primer, air dikeluarkan dari produk beku melalui sublimasi. Hal
ini dicapai melalui penggunaan pompa vakum, yang memungkinkan molekul
air untuk bermigrasi dari produk beku dan mengembun pada perangkap
kelembaban yang disebut kondensor. Agar hal ini memungkinkan, suhu
kondensor harus lebih dingin dari suhu produk; perbedaan suhu tersebut akan
mempengaruhi laju sublimasi. Ketika pengeringan primer selesai, semua
kelembaban sisa dihilangkan dengan memanaskan produk secara
langsung. Selama fase pengeringan sekunder ini, air harus didesorbsi hingga
kadar air sisa 1% atau kurang. Proses ini membutuhkan tekanan rendah, sistem
suhu kondensor rendah. Setelah kering, ampul disegel dengan benar dan
disimpan pada suhu berpendingin (4°C).

2.2.3.2 Penyimpanan dan Viabilitas Strain Lyophilized

Untuk memaksimalkan pemulihan sel yang layak, kultur bakteri harus
dalam kondisi optimal sebelum proses liofilisasi. Umumnya, umur suatu kultur
dapat mempengaruhi kemampuannya untuk bertahan hidup dalam pengeringan
beku. Kultur bakteri yang dipanen dari fase log akhir atau fase stasioner awal
memiliki peluang terbesar untuk bertahan hidup selama tekanan suhu
rendah. Selain persiapan kultur bakteri yang tepat, pemulihan sel yang layak juga
dapat dipengaruhi oleh penggunaan kondisi pertumbuhan dan media yang sesuai
selama rekonstitusi. Nutrisi, media pertumbuhan non-selektif bantuan terbaik
dalam memaksimalkan pemulihan. Karena produk yang diliofilisasi bersifat
higroskopis, produk tersebut harus disimpan dalam kondisi bebas
kelembaban. Faktor eksogen seperti kandungan oksigen dan suhu penyimpanan
dapat mempengaruhi masa simpan galur beku-kering. Oksigen dapat bereaksi
negatif dengan produk, mempengaruhi kelangsungan hidup kultur, dan
berbanding lurus dengan suhu penyimpanan. Oleh karena itu, penyimpanan

4
jangka panjang produk terliofilisasi harus disimpan pada suhu berpendingin (4°C)
di bawah kondisi yang melindungi sampel dari paparan kelembaban atau oksigen.
Prosedur Liofilisasi
A. Pengering beku komponen
1. Cuci vial bagian dalam (Glass Vials, Inc., 11,5 x 35 mm) dan stopper
dengan sumbat kapas bebas minyak. Selanjutnya, beri label pada
setiap vial dan autoklaf.
2. Siapkan vial luar (Glass Vials, Inc., 14,25 x 85,0 mm) dengan
menempatkan sedikit butiran silika gel (Fisher Scientific, grade 42, 6-
16 mesh) di dalam vial untuk menutupi sekitar setengah bagian
bawah. Tambahkan gumpalan kapas kecil untuk melindungi botol
bagian dalam. Panaskan ini semalaman pada 100 ° C.
3. Siapkan strain bakteri dalam kondisi optimal dalam media yang sesuai
untuk mempertahankan fitur yang menonjol dari strain. Strain bakteri
harus ditumbuhkan sampai fase log akhir.
4. Suspend sel dalam Reagen 20 (formulasi medium ATCC 9520) dan
aduk rata. Tuangkan 0,2 mL suspensi ini ke dalam setiap vial bagian
dalam. Ganti sumbat kapas dan rapikan sehingga rata dengan tepi vial.
5. Selanjutnya, tempatkan botol bagian dalam ke dalam panci stainless
steel dan perlahan bekukan sampel.
6. Setelah dibekukan, liofilisasi sampel selama 18 jam dalam pengering
beku. Sebelum digunakan, kondensor harus didinginkan terlebih
dahulu dan sistem dievakuasi hingga di bawah 30 m Hg.
7. Ketika siklus liofilisasi selesai, keluarkan vial bagian dalam dari
pengering beku dan masukkan ke dalam vial luar yang telah
disiapkan. Tempelkan inci kertas serat di atas botol bagian dalam yang
disumbat kapas. Ini harus dilakukan di lemari kering.
8. Selanjutnya, panaskan vial luar menggunakan obor, putar vial sampai
kaca tepat di atas kertas serat mulai mengerut. Ini harus membuat

4
 tabung kapiler sempit. Setelah gelas mendingin, pasang vial ke port
manifold. Evakuasi sistem hingga kurang dari 50 m Hg.
9. Tutup botol di lokasi kapiler menggunakan obor. Simpan vial pada
suhu 4°C. Setelah 24 jam, kembalikan strain bakteri ke dalam media
kultur, dan tentukan viabilitas dan sterilitasnya.

B. Metode Preseptrol

1. Beri label pada botol serum 2 mL (Wheaton Scientific). Tempatkan

botol-botol ini ke dalam baki, tutup dengan filter berdiameter 6 inci
dan aluminium foil, dan panggang pada suhu 180 ° C selama empat
jam. Sementara itu, autoklaf sumbat karet butil berlubang (Barat).
2. Siapkan strain bakteri dalam kondisi optimal dalam media yang sesuai
untuk mempertahankan fitur yang menonjol dari strain. Strain bakteri
harus ditumbuhkan sampai fase log akhir.
3. Menangguhkan sel dalam Reagen 18:
A. 0,75 g Kaldu Kedelai Tripticase
B. 10,0 g Sukrosa
C. 5.0 g Fraksi Albumin Serum Bovine V
D. 100 mL air suling
E. Filter-sterilkan melalui filter 0,2 m.
4. Tuangkan 0,4 mL suspensi ke dalam setiap vial dan dengan hati-hati
letakkan sumbat steril pada setiap vial. Jangan mendorong sumbat
sepenuhnya karena uap harus dibiarkan keluar.
5. Selanjutnya, bekukan sampel secara perlahan dalam freezer mekanis.
6. Setelah sampel dibekukan, tutup botol dengan kapas steril, setebal
hingga 1 inci. Kemudian, liofilisasi sampel selama 18 jam dalam
sistem pengeringan beku. Sebelum digunakan, kondensor harus

4
 didinginkan terlebih dahulu dan sistem dievakuasi hingga di bawah
100 m Hg.
7. Ketika siklus liofilisasi selesai, keluarkan vial dari pengering beku dan
semprotkan secara menyeluruh dengan disinfektan seperti Amphyl
(Sterling Drug, Inc.). Tempatkan botol di bawah sinar ultraviolet
dalam lemari pengaman biologis selama setidaknya 30 menit.
8. Tutup vial dengan tutup aluminium (Wheaton) dan simpan pada suhu
4°C. Setelah 24 jam, kembalikan strain bakteri ke dalam media kultur,
dan tentukan viabilitas dan sterilitasnya.

Pemulihan Sel Terliofilisasi

1. Untuk merehidrasi galur beku-kering, tambahkan 0,3 hingga 0,4 mL
kaldu.
2. Aduk rata dan pindahkan ke tabung berisi 5 sampai 6 mL media
kaldu.
3. Beberapa tetes suspensi ini juga dapat ditambahkan ke miring atau
tempat agar. Media pertumbuhan harus dipilih untuk memaksimalkan
pemulihan sel. Media optimum terdaftar untuk setiap strain di Katalog
ATCC Bakteri dan Bakteriofag.
4. Inkubasi strain di bawah suhu yang sesuai dan kondisi atmosfer.

Pelestarian Bakteri Rewel

Sebagian besar galur bakteri dapat dikeringkan dengan cara dibekukan, dan
hampir semua galur dapat diawetkan dengan kriopreservasi dan dipertahankan
dalam uap nitrogen cair. Dalam persiapan untuk kriopreservasi atau liofilisasi,
strain bakteri harus ditumbuhkan dalam kondisi optimal. Ini dapat mencakup
pertumbuhan pada agar-agar, dalam kultur kaldu yang dikocok, atau dalam kultur
kaldu statis. Perhatian tambahan harus diberikan saat menyiapkan spesies bakteri
yang rewel untuk pengawetan.

Anaerob

4
Untuk mengawetkan bakteri anaerob dengan baik, kondisi anaerob harus
dipertahankan selama pertumbuhan, pemanenan, pengeluaran, dan
pembekuan. Krioprotektan dan media pensuspensi harus direduksi terlebih
dahulu, dan kondisi anaerobik harus dipertahankan dengan aliran gas bebas
oksigen menggunakan kanula steril.

Bakteriofag
Sebagian besar bakteriofag dapat berhasil dikeringkan dengan cara
dibekukan; pengecualian disimpan dalam nitrogen cair. 24 , 25
Sebelum
pengawetan, bakteriofag dapat diperbanyak dalam lapisan agar-agar lunak atau
dalam kaldu; titer dari 10 8
PFU / mL diinginkan. Bakteriofag dapat
dikriopreservasi tanpa adanya krioprotektan, yang dilakukan di bawah laju
pembekuan yang terkendali. Namun, bakteriofag yang membutuhkan
krioprotektan dapat dicampur dengan gliserol 20% dengan volume yang
sama. Untuk membekukan-kering, suspensi bakteriofag yang disaring harus
dicampur dengan 20% susu skim dan diliofilisasi sesuai dengan metode pengering
beku komponen.

Mollicutes
Sebelum kriopreservasi atau liofilisasi, mollicutes harus ditumbuhkan dalam
kaldu. Setelah pertumbuhan, suspensi sel harus disentrifugasi dan disuspensikan
kembali dalam jumlah kaldu yang sama dan gliserol 20%. Sebagai alternatif, sel
dapat disuspensikan kembali dalam jumlah kaldu yang sama dan sukrosa 24%
untuk liofilisasi dalam metode pengering beku komponen. 26

Neisseria, Haemophilus, Campylobacter , dan Helicobacter

Genus bakteri ini sangat sensitif terhadap kerusakan selama pengawetan. 27
Untuk
memaksimalkan viabilitas dan pemulihan sel, sel harus ditumbuhkan dalam
kondisi optimal dan dipanen pada titik yang tepat dalam kurva

4
pertumbuhan. Untuk menstabilkan galur ini selama liofilisasi, tambahkan media
pensuspensi dengan natrium askorbat 0,5% sebelum pembekuan.

Spirochetes
Spirochetes sangat sulit untuk diliofilisasi. Direkomendasikan agar spirochetes
diawetkan dengan gliserol 10% dan disimpan dalam uap nitrogen cair. 28

Bahaya Khusus
Perawatan harus dilakukan selama kriopreservasi atau liofilisasi strain
bakteri. Masalah seperti kontaminasi, pecahnya ampul kaca selama penanganan
dan penyimpanan, penyebaran bakteri beku-kering saat membuka ampul kaca, dan
penanganan nitrogen cair semuanya harus dipertimbangkan. Untuk mencegah
kontaminasi dan penyebaran bakteri, teknik aseptik harus diikuti. Ini dapat
mencakup dekontaminasi semua peralatan dan vial serta melakukan semua
persiapan dalam lemari pengaman biologis. Selain itu, pakaian pelindung harus
dipakai selama persiapan untuk mencegah kontaminasi serta untuk menjaga dari
bahaya akibat kontak dengan nitrogen cair.

Otentikasi Bakteri

Saat menyiapkan galur bakteri untuk distribusi, ATCC melakukan berbagai

pengujian kendali mutu (QC) untuk menjamin bahwa produk memiliki standar
tertinggi sebelum sampai ke konsumen. Semua galur bakteri menjalani
pemeriksaan fenotipik dan genotipik menyeluruh untuk memastikan bahwa
identifikasi galur akurat, biakan murni, dan semua hasil biokimia
konsisten. Untuk membantu menjaga standar ini, semua peralatan dan uji
biokimia yang diperlukan dalam proses QC dievaluasi secara serupa untuk
jaminan kualitas. Dijelaskan di bawah ini adalah beberapa tes yang biasa
dilakukan ATCC pada strain bakteri selama analisis QC.

4
Karakterisasi Fenotipik
Ketika strain bakteri awalnya diterima oleh ATCC, mereka dianalisis untuk
karakteristik koloni dan morfologi bakteri; ini diamati melalui pertumbuhan
koloni dan pewarnaan Gram, masing-masing. Selain itu, sampel diuji kemurnian
kultur pada pelat agar darah. Kehadiran lebih dari satu jenis koloni sering, tetapi
tidak selalu, menunjukkan budaya campuran.
Selain kemurnian dan morfologi, strain juga diperiksa konsistensinya dalam
metabolisme gula, kerentanan antibiotik, dan/atau reaktivitas biokimia spektrum
luas. Untuk mengonfirmasi identitas spesies bakteri berdasarkan sifat fenotipik
terkait ini, ATCC biasanya menggunakan tes strip API dan kartu Vitek yang
sesuai. Kedua teknik tersebut menggunakan lebih dari 20 tes biokimia yang
berbeda dalam sel reaksi untuk menilai pertumbuhan dan kelangsungan hidup
strain bakteri.30Tes strip API mencirikan identitas bakteri melalui metode mikro
manual yang menghasilkan kode tujuh digit berdasarkan reaksi uji biokimia
individu. Kode yang dihasilkan ini adalah nomor pengenal yang terkait dengan
spesies bakteri tertentu. Sebaliknya, sistem Vitek menyediakan metode
identifikasi spesies otomatis berbasis komputer melalui pengukuran redaman
cahaya yang terkait dengan setiap reaksi biokimia. 30 , 31
Untuk sistem yang
terakhir ini, ATCC membutuhkan 90% kemungkinan identifikasi organisme.

4
Karakterisasi Genotipe dan Proteotipe
ATCC secara genotip mengkonfirmasi spesies bakteri terutama melalui
sekuensing 16S ribosomal RNA (rRNA). Urutan ini biasanya digunakan untuk
menganalisis filogeni dan taksonomi bakteri karena sangat lestari dan universal di
antara spesies prokariotik. Secara umum, urutan gen 16S rRNA terdiri dari daerah
variabel dan daerah yang dilestarikan, perbandingan urutan ini dapat
memungkinkan untuk diferensiasi setidaknya ke tingkat genus. 32 , 33 Pendekatan
sekunder adalah ribotyping, yang melibatkan analisis komparatif fragmen genom
berukuran diskrit yang dihasilkan oleh pencernaan restriksi operon rRNA. 34 , 35
Metode lain dari identifikasi prokariotik adalah melalui matriks-dibantu laser
desorption/ionization time-of-flight spektrometri massa (MALDI-TOF MS), yang
merupakan metode proteotip yang mengidentifikasi protein menggunakan
pencocokan massa peptida. 36 Di sini, pola spektral massa sel prokariotik utuh
diperoleh melalui analisis komponen terionisasi, menciptakan spektrum unik yang
mewakili profil protein setiap sampel. Pola spektral ini kemudian dibandingkan
dengan database profil yang disimpan dari organisme yang diketahui,
memungkinkan identifikasi spesies yang cepat dan akurat.

Kontrol kualitas
Dalam produksi produk habis pakai, pengujian mikrobiologis yang efektif harus
dilakukan untuk memastikan tidak adanya kontaminasi. Keselamatan, reputasi,
dan kinerja bisnis dari semua perusahaan pemrosesan bergantung pada kontrol
kualitas yang efektif. Strain yang digunakan untuk kontrol kualitas harus memiliki
identitas, viabilitas, dan kemurnian yang dikonfirmasi yang didukung oleh
prosedur laboratorium yang cermat yang meminimalkan subkultur. Sejak 1925,
ATCC telah menjadi penyedia terkemuka strain bakteri QC dan telah menetapkan
standar untuk otentikasi dan distribusi bahan biologis untuk penelitian dan
pengujian produk. Semua galur bakteri yang diautentikasi dan disediakan oleh

4
ATCC telah melalui karakterisasi fenotipik dan genotipik yang ketat; prosedur ini
dijelaskan secara rinci dalam bab sebelumnya, “Otentikasi Bakteri .”

Komitmen Kualitas
Sistem dan sertifikasi manajemen mutu ATCC memastikan standar yang
tinggi Sertifikasi kualitas
ATCC berkomitmen untuk menyediakan produk dan layanan berkualitas kepada
komunitas ilmu kehidupan. Komitmen tersebut mencakup sertifikasi dan
akreditasi sebagai berikut:
1. Bersertifikat ISO 9001
2. Bersertifikat ISO 13485
3. Terakreditasi ISO/IEC 17025
4. Terakreditasi ISO 17034

Sistem manajemen mutu

Tim manajemen kualitas kami yang berpengalaman memastikan bahwa perolehan,
otentikasi, pelestarian, pengembangan, dan distribusi bahan biologis dilakukan di
bawah, dan sesuai dengan, sistem manajemen mutu yang terdokumentasi. Kami
mematuhi persyaratan peraturan melalui penggunaan pengujian kontrol kualitas
yang kuat, dokumentasi yang luar biasa dan praktik pencatatan, tindakan korektif
dan pencegahan, audit internal dan eksternal, dan tinjauan manajemen.

Akreditasi ISO
Berikut adalah bagaimana kepatuhan terhadap standar akreditasi ISO kami
mendukung penelitian Anda.

Manajemen Mutu ISO-9001 BSI

Standar ISO 9001 menguraikan persyaratan untuk sistem manajemen mutu kami,
termasuk dokumentasi proses dan prosedur internal kami untuk memastikan

5
bahwa kami secara konsisten menyediakan produk dan layanan berkualitas kepada
pelanggan dan mematuhi standar peraturan.

Manajemen Mutu Perangkat Medis ISO-13485 BSI

ISO 13485 menyatakan bahwa Sistem Manajemen Mutu ATCC menyediakan
perangkat medis dan layanan terkait yang secara konsisten memenuhi persyaratan
pelanggan dan peraturan. Produk perangkat medis ATCC ISO 13485 dapat
digunakan sebagai kontrol dalam penelitian diagnostik molekuler, termasuk
pengembangan dan validasi pengujian; diagnosis, evaluasi, dan penelitian status
penyakit; dan pengawasan agen infeksius yang mempengaruhi kesehatan
masyarakat.

ANAB - Laboratorium Penguji 17025

Akreditasi ISO/IEC 17025 menjamin kompetensi laboratorium pengujian dan
kalibrasi. Ini meyakinkan pelanggan bahwa protokol karakterisasi dan pengujian
kemurnian (pengujian QC) yang digunakan dalam pembuatan kultur mikroba dan
sel ATCC tepat, akurat dan memiliki pengulangan. Akreditasi ISO/IEC 17025
memberi Anda kepercayaan diri dalam kinerja produk kami dan dapat
menghilangkan kebutuhan akan audit pasokan yang memakan waktu dan mahal.

ANAB - Produsen Bahan Referensi 17034

ISO 17034 menetapkan persyaratan umum untuk kompetensi dan operasi yang
konsisten dari produsen bahan acuan, termasuk produksi bahan acuan
bersertifikat. Sertifikat analisis untuk setiap CRM mencakup nilai bersertifikat dan
pengukuran ketidakpastian, yang sesuai.

2.3 NCTC (National Collection of Type Cultures)

National Collection of Type Cultures (NCTC) adalah penjaga strain bakteri
yang mewakili pekerjaan dan kolaborasi banyak ilmuwan selama hampir 150
tahun. Terdiri dari hampir 6.000 strain dari lebih dari 850 spesies bakteri, setiap
strain memiliki sejarah uniknya sendiri.

5
 NCTC adalah salah satu koleksi mikroorganisme terpanjang di dunia.
Didirikan pada tahun 1920 untuk “menyediakan sumber bakteri otentik yang
dapat dipercaya untuk digunakan dalam studi ilmiah”, wewenang untuk NCTC
pada dasarnya tetap tidak berubah hari ini. Meskipun awalnya koleksi mikroba
umum, fokus berubah pada tahun 1947 untuk memungkinkan kurator NCTC
berkonsentrasi pada bakteri kepentingan medis dan veteriner. Strategi ini
dilakukan untuk memastikan bahwa koleksi tersebut akan dilestarikan oleh para
ahli di bidangnya; budaya non-medis dipindahkan ke lembaga lain dengan
keahlian yang berbeda.
Kultur NCTC mencerminkan sejarah infeksi bakteri klinis dari akhir abad
ke-19 hingga saat ini. Saat ini ada lebih dari 5000 jenis dan strain referensi yang
tersedia, mewakili lebih dari 1000 spesies bakteri yang berbeda, dan jumlah
tersebut terus meningkat. Kami menambahkan galur baru ke dalam koleksi secara
terus-menerus untuk memastikan kami memberikan sumber daya biologis vital
yang diperlukan bagi para peneliti yang mengumpulkan data baru tentang
keanekaragaman hayati mikroba, mempelajari persamaan dan perbedaan antara
galur historis dan modern dan memajukan pengetahuan global tentang
epidemiologi, virulensi, pencegahan dan pengobatan dari penyakit menular. Selain
strain bakteri untuk studi penelitian, NCTC menyediakan strain kontrol baru dan
mapan untuk digunakan dalam pengujian diagnostik klinis, penilaian mikrobiologi
makanan.
Kami menyediakan informasi tentang budaya NCTC yang tersedia di
katalog online kami di www.phe-culturecollections.org.uk/nctc. Selain budaya
yang dapat diakses melalui situs web, NCTC memiliki ratusan galur lain dalam
koleksi pribadi dan sejarah yang telah disumbangkan oleh ilmuwan individu,
lembaga akademis, dan Wellcome Trust. Strain bakteri NCTC diawetkan sebagai
kultur beku-kering (lyophilised) yang dikarakterisasi dan diautentikasi dalam
ampul kaca leburan dan disimpan dalam kondisi aman yang terkendali. Koleksi

5
duplikat disimpan di dua lokasi geografis terpisah sedapat mungkin untuk
memastikan sumber daya ini tersedia untuk generasi mendatang.
NCTC juga berfungsi sebagai United Nations Educational, Scientific and
Cultural Organization (UNESCO) Microbial Resource Center (MIRCEN). Pada
tahun 1982 NCTC diakui sebagai International Depository Authority (IDA) di
bawah Traktat Budapest yang berisi peraturan tentang pengakuan internasional
atas penyimpanan mikroorganisme untuk prosedur paten. Kantor kekayaan
intelektual memerlukan pengungkapan tertulis untuk penemuan mikroorganisme
baru yang dilengkapi dengan penyimpanan mikroorganisme tersebut dalam
koleksi kultur yang diakui seperti NCTC.
Kultur dan layanan NCTC digunakan oleh para ilmuwan di seluruh dunia.
Ada peraturan biosekuriti dan transportasi nasional dan internasional yang
ditetapkan untuk penyediaan mikroorganisme yang harus kita patuhi. Ini
memastikan bahwa orang yang menerima strain NCTC melakukannya dengan
aman dan memahami syarat dan ketentuan penggunaan.

5
 Antibiotika
Perlawanan
Riset Obat
Menul
ar Penemuan

Teknologi
Kemajuan
dalam Klinis
Proteomik dan Produk NCTC Diagnostik
dan dukungan Pengujian
genomik layanan perbaikan
dalam hasil
kesehatan
masyarakat
Mikroba
Taksonomi Air
Pengujian

Makanan Lingkungan
Pengujian Pengujian

Mayoritas koleksi NCTC terdiri dari jenis dan strain referensi yang relevan
secara klinis dan veteriner, seperti kontrol yang direkomendasikan oleh badan
internasional (Organisasi Kesehatan Dunia dan Komite Eropa untuk Pengujian
Kerentanan Antimikroba, EUCAST) untuk digunakan dalam uji diagnostik.
Namun, banyak dari strain NCTC melihat banyak kegunaan dan beberapa artefak
budaya yang mencerminkan dan mengontekstualisasikan sejarah manusia
sepanjang abad ke-20.
2.3.1 Kultur Bakteriologi NCTC
Sebagian besar kultur NCTC diawetkan dan didistribusikan sebagai kultur
beku-kering (lyophilised) dalam ampul kaca yang disegel dengan api di bawah
vakum. NCTC memperkenalkan pengeringan beku pada tahun 1930-an dan
prosesnya, pada dasarnya tidak berubah, masih dianggap sebagai metode yang

5
paling dapat diandalkan untuk pengarsipan dan penyimpanan bakteri jangka
panjang. Kultur beku-kering relatif mudah disimpan dan dikirim ke seluruh dunia.
Banyak strain tetap bertahan selama lebih dari 20 tahun, asalkan kultur awal
mengandung antara 106 dan 1010 unit pembentuk koloni per ml. Namun, waktu
kelangsungan hidup dapat bervariasi untuk spesies yang berbeda dalam genus dan
antara strain yang berbeda dari spesies yang sama. Laboratorium NCTC
melakukan pemeriksaan viabilitas tahunan pada semua batch untuk memastikan
bakteri tetap hidup dan akan menghasilkan batch baru jika tingkat mulai turun di
bawah ambang batas yang ditentukan.
NCTC menyediakan rentang galur terpilih sebagai cakram LENTICULE,
format sekali pakai yang dikembangkan untuk menyediakan galur kontrol untuk
laboratorium pengujian mikrobiologi makanan dan air.
Beberapa perusahaan komersial juga menyediakan produk yang
mengandung strain NCTC yang diproduksi di bawah lisensi dari NCTC.

2.3.2 Jenis strain:

Tidak semua galur NCTC adalah galur tipe. Strain tipe adalah strain yang menjadi
dasar deskripsi suatu spesies dan tidak selalu mewakili spesies yang paling khas.
Strain tipe berfungsi sebagai titik referensi tetap untuk penetapan nama bakteri.
Mereka dibiakkan dari isolat asli yang digunakan dalam deskripsi spesies dan
subspesies, seperti yang didefinisikan oleh Kode Bakteriologis Nomenklatur
Bakteri. Jenis galur wajib disimpan dalam koleksi kultur yang diakui seperti
NCTC.

2.3.3 Strain tipe NCTC dalam studi evolusi:

Pohon filogenetik adalah representasi grafis dari hubungan evolusioner spesies
dan mencerminkan kedekatan mereka. Secara tradisional, pohon filogenetik
dibangun atas dasar kesamaan fisik dan perbedaan antara mikroorganisme dan
jenis kultur memainkan peran penting dalam konstruksi mereka. Kemajuan
teknologi berarti bahwa seluruh sekuens genomik sekarang dapat digunakan untuk

5
membangun pohon filogenetik dan peran kultur tipe terus menjadi sangat penting.
Seluruh urutan genom tersedia untuk banyak kultur NCTC.

2.3.4 Strain referensi:

Semua galur NCTC, terlepas dari apakah itu galur tipe, diakui galur referensi.
Strain referensi didefinisikan sebagai mikroorganisme yang diperoleh dari koleksi
kultur yang diakui. Banyak strain referensi NCTC dikutip sebagai kontrol untuk
prosedur pengujian yang diakui secara internasional.
NCTC bekerja dengan kolaborator dan distributor internasional untuk
menyediakan produk bahan referensi (RM) yang dirancang khusus untuk
digunakan sebagai kontrol di laboratorium pengujian makanan dan air. RM,
ditawarkan dalam format disk LENTICULE dibuat dari satu subkultur dari galur
NCTC yang relevan. Mereka mudah digunakan dan menghemat waktu sehingga
bisa sangat hemat biaya, terutama di laboratorium yang sibuk. RMs memberikan
data yang konsisten, sehingga meningkatkan keyakinan bahwa hasil tes dapat
diandalkan.

Produk RM bermanfaat untuk:

 Menyediakan kontrol untuk mendeteksi patogen yang mungkin ada dalam
tingkat rendah, seperti: Salmonella sp. dan E. coli O157
 Inokulasi yang disengaja ('spiking') sampel makanan dan air untuk
menunjukkan kompetensi staf dalam menguji matriks makanan/air tertentu
yang diuji di laboratorium Anda
 Kontrol enumerasi untuk pengujian makanan dan air
 Bahan kontrol kualitas untuk menunjukkan kinerja media kultur
 Pelatihan staf – kebanyakan laboratorium melaporkan hasil negatif sehingga
staf mungkin tidak terbiasa dengan deteksi organisme patogen – RM dapat
digunakan untuk tujuan ini

5
Strain resisten multidrug dari NCTC
NCTC menawarkan banyak pilihan strain referensi resisten multidrug (MDR)
yang relevan secara klinis yang diisolasi dari berbagai sumber yang diperoleh di
rumah sakit dan masyarakat. Kultur ini berguna untuk mempelajari variasi genetik
antar strain,in vitro evaluasi desinfektan dan antimikroba baru, dan menetapkan
karakteristik kinerja tes berbasis molekuler. NCTC menyediakan strain dengan
karakteristik berikut:
• Penisilinase tanpa aktivitas -laktamase spektrum luas
• Spektrum luas -laktamase
• TEM, SHV, CTX-M, VEB dan AmpC -laktamase
• Karbapenemase kelas A, B dan D
• Resistensi fluorokuinolon yang diperantarai plasmid
• Resistensi vankomisin (enterokokus)
• Plasmid resistensi multiobat (E. coli)
• Resistensi methicillin (S. aureus - MRSA)

Perubahan nama organisme:/Nomenklatur

Strain bakteri dapat diklasifikasikan kembali ketika informasi baru tentang
mereka ditemukan atau teknik yang lebih baru diterapkan untuk mempelajari
sistematika mereka. Pengklasifikasian ulang ini sering disertai dengan perubahan
nomenklatur, misalnya, ketika genera dan/atau spesies baru dikenali atau ketika
spesies yang ada dipindahkan ke genera yang berbeda (dan terkadang baru).
Penting untuk dipahami bahwa perubahan ini adalah usulan sehingga organisme
yang sama dapat dikenal dengan beberapa nama yang berbeda, asalkan nama-
nama tersebut diajukan sesuai dengan Aturan Tata Nama (International Code of
Nomenclature of Bacteria). Semua nama yang diusulkan sesuai dengan Aturan
dapat dianggap 'benar'. Ada kesalahpahaman umum bahwa nama yang diusulkan
terakhir atau kombinasi baru adalah nama yang 'benar'. Namun, komunitas
ilmiahlah yang memutuskan penggunaannya, tergantung pada penerimaan atau

5
tidaknya proposal tersebut. Tidak semua nama atau kombinasi baru mendapatkan
penerimaan luas, meskipun sebagian besar melakukannya.

2.4 Peremajaan Bakteri

Peremajaan bakteri bertujuan agar bakteri memulai metabolisme kembali
setelah penyiapan. Peremajaan bakteri dilakukan dengan mengambil satu jarum
ose biakan murni kemudian digoreskan dalam biakan agar dengan permukaan
miring, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam, Setelah proses
peremajaan bakteri selesai, bakteri siap digunakan dengan proses inokulasi. Proses
inokulasi dilakukan dengan mengambil satu jarum ose suspensi bahan yang
mengandung bakteri dari medium agar miring dan mencelupkannya kedalam 10
ml medium cair, kemudian diinkubasi pada suhu kamar (25°C) selama 24 jam
sambil diaduk (Unnes, 2014).
Metode peremajaan yang dilakukan secara berkala yaitu dengan
memindahkan atau memperbarui biakan mikroba dari biakan lama ke medium
tumbuh yang baru pada agar nutrient dapat berisiko terkontaminasi, sehingga
untuk memperoleh kultur standar bakteri yang muni perlu dilakukan identifikasi.
Hal tersebut mengakibatkan penambahan biaya dan waktu pada pelaksanaan
pemantapan mutu internal Bakteriologi. Peremajaan berkala tidak dianjurkan
untuk penyimpanan jangka panjang sehingga dapat menggunakan teknik liofilisasi
(lyofilization) yang merupakan teknik penyimpanan kering beku (freeze drying)
menggunakan lioprotektan (lyoprotectant) (Machmud, 2001). Membandingkan
antara jumlah total bakteri sebelum dan setelah pengeringan beku dengan ALT
dapat digunakan untuk uji ketahanan bakteri (Etzel dan Fu, 1995).
Media yang digunakan dalam peremajaan bakteri adalah media NA
(Nutrient Agar), dimana media ini mengandung nutrisi yang dapat mendukung
pertumbuhan bakteri. Menurut Pelczar dan Chan (2008), semua organisme
termasuk bakteri membutuhkan nutrisi untuk memenuhi kehidupan yang
diperlukan dalam pertumbuhan organisme tersebut. Adapun komponen-komponen

5
nutrisi yang ada pada media NA adalah ekstrak daging sapi, pepton, dan agar.
Ekstrak daging sapi merupakan salah satu komponen yang mengandung
karbohidrat, nitrogen, vitamin, dan garam. Sedangkan pepton merupakan sumber
utama nitrogen. Sebagai bahan pemadat, dalam media NA digunakan agar, namun
agar disini tidak merupakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan bakteri (Pelczar dan
Chan, 2008). Proses inokulasi dilakukan dengan mengambil satu jarum ose
suspensi bahan yang mengandung bakteri dari medium agar miring dan
mencelupkannya kedalam 10 ml medium cair, kemudian diinkubasi pada suhu
kamar (25°C) selama 24 jam sambil diaduk.

1) Peremajaan Berkala
Peremajaan terpola yaitu dengan memindahkan atau memperbarui biakan
bakteri asal media lama ke media baru secara terpola dengan rentang waktu yang
singkat. Metode ini adalah cara paling tradisional yg dipergunakan untuk
penyimpanan serta pemeliharaan isolat bakteri di laboratorium. Peremajaan
berkala tidak dianjurkan untuk penyimpanan serta pemeliharaan jangka panjang
karena kemungkinan terjadinya kontaminasi sehingga harus melakukan
identifikasi untuk memperoleh kultur baku bakteri yang murni (Prastowo, 2019).

Ampul beku-kering

5
 Sebagian besar strain bakteri NCTC disajikan sebagai kultur murni beku-
kering dalam ampul kaca yang telah disegel api di bawah vakum. Ampul
mengandung sekitar 0,15g bakteri beku-kering
Setiap ampul dikemas secara individual dalam tabung plastik, dikirim pada
suhu sekitar dan memerlukan penyimpanan pada +4°C

Dimasukkan ke dalam produk lain (TCS Selectrol®, bioMérieux BioBall®,

Mikrobiologis KWIK-STIK™, skema uji profisiensi)
Membuka Ampul Kaca
Semua biakan bakteri NCTC harus dianggap berpotensi berbahaya dan
harus dibuka oleh orang yang terlatih dalam teknik mikrobiologi dan terbiasa
bekerja di fasilitas dengan persyaratan penahanan yang sesuai untuk tingkat
keamanan hayati biakan.
NCTC merekomendasikan agar ampul kaca dibuka di lemari pengaman
biologis yang dirancang untuk melindungi pekerja dari inhalasi aerosol (di
Inggris, ini berarti lemari Kelas I, Kelas II atau Kelas III). Jika tidak
memungkinkan, kenakan alat pelindung diri termasuk sarung tangan, kacamata
pengaman atau pelindung, dan pakaian pelindung, dan jauhkan ampul dari tubuh
Anda saat membukanya. Video proses berikut juga tersedia di:www.phe-
culturecollections.org.uk/how-to-open-nctc-ampoules

6
 1. Siapkan media yang sesuai yang diperlukan untuk menghidupkan kembali galur
dan periksa kondisi inkubasi yang diperlukan.

2. Identifikasi kultur dengan nomor NCTC pada 3.

kertas
Bersihkan
di dalam
bagian
atau luar
labelampul
pada ampul.
menggunakan tisu desinfektan at
70%.

4. Buat skor yang dalam di sekitar lingkar ampul, emotong berlian, pena berlian, atau kikir kaca di tengah
4. Buat skorkapas.
sumbat yang dalam
Anda di dapat
sekarang sekitar lingkar
membuka ampul,
ampul dengan menggunakan pemotong
'membungkus dan menjepit' sepertiberlian, pena berlian, atau kikir kaca d
yang ditunjukkan
dengan menggunakan teknik sumber panaskan.
pada

5. Bungkus ampul dengan tisu desinfektan atau 6.

tisu
Kemudian
yang dibasahi
bungkus
alkohol
dengan
70%.
handuk kertas, tisu atau kain kasa
yang tidak disengaja saat ampul dibuka.

6
 7. Jepret ampul sambil dibungkus di mana
tanda skor dibuat.

8. Buka ampul dengan hati-hati

karena
pecahan kaca mungkin ada di
jaringan. Buang tisu dan ujung
9. Begitu dibuka, udara akan masuk ke dalam ampul karena vakumnya sudah tidak
utuh lagi. Udara ini akan disaring oleh sumbat kapas yang mungkin telah bersentuhan
dengan
kultur bakteri kering sehingga harus dibuang dengan aman. Lepaskan sumbat dengan

10. Untuk menyusun kembali, pindahkan 11. Biarkan mikroorganisme mengalami

kira- kira 0,5 ml kaldu, bila perlu diperkaya rehidrasi selama 5-10 menit. Campur
dengan dengan
darah, ke ampul. sangat hati- hati untuk menghindari
terbentuknya aerosol atau menyebabkan

12. Subkultur ke media kultur yang sesuai, idealnya

13. Sebagian
termasukbesar
mediabakteri
padat untuk
beku-kering akan tumbuh dalam
memudahkan mendeteksi kontaminan yang mungkin beberapa
masuk
mungkin
saat ampul
memerlukan
dibuka. Buang
masa inkubasi
ampul bekas
yang ke
sedikit
temp

6
Menggunakan sumber panas: Sebagai alternatif untuk membungkus dan
menjentikkan langkah 5 – 8, panaskan batang kaca tipis atau kapiler pipet (dengan
diameter kurang dari 3mm) sampai ujungnya merah panas dan cair, lalu dengan
cepat dan kuat oleskan ujung yang dipanaskan ke tanda yang dicetak pada ampul
untuk memecahkannya di seluruh keliling. Jika upaya pertama tidak berhasil,
ulangi menggunakan sepotong kaca panas lainnya. Pastikan batang kaca/kapiler
yang digunakan dipanaskan dengan baik dan dioleskan dengan cepat (sebelum
mendingin) ke tanda skor pada ampul. Kemudian lanjutkan dari langkah 9.
2.5 Penyimpan Bakteri NCTC
Kultur bakteri murni yang digunakan setiap saat harus dalam kondisi yang
baik. Untuk menjaga kualitas kultur bakteri murni tetap dalam kondisi yang baik
harus dilakukan penyimpanan dan pemeliharaan terhadap kultur bakteri tersebut.
Penyimpanan atau koleksi meliputi jangka panjang maupun jangka pendek.
Penyimpanan jangka pendek merupakan penyimpanan yang dilakukan untuk
keperluan rutin penelitian yang di sesuaikan dengan kegiatan program tertentu.
Penyimpanan jangka panjang dilakukan apabila suatu saat di perlukan dapat
diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia sehingga harus mempertahankan
daya hidup bakteri. Hal ini dilakukan dalam rangka koleksi dan konservasi plasma
nutfah mikroba (Prastowo, 2019 : Setiaji, 2015).
Penyimpanan dilakukan dalam hal berkaitan dengan tujuan preservasi yaitu
mengurangi laju metabolisme mikroorganisme hingga sekecil mungkin.
Penyimpanan juga dilakukan agar dapat mempertahankan viabilitas (daya
hidupnya) dan memelihara sebaik mungkin biakan sehingga diperoleh angka
perolehan dan kehidupan yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum
(Setiaji, 2015).
Perlunya pemeliharaan yang baik bagi kultur murni agar dapat digunakan
setiap waktu dibutuhkan. Banyak cara yang dilakukan untuk pemeliharaan kultur
murni yang saat ini terus dikembangkan. Pemeliharaan dapat dilakukan dengan
cara meremajakan dalam jangka waktu tertentu atau sub kultur. Namun pada

6
metode tersebut masih terdapat kelemahan yaitu dalam waktu singkat harus
dipindahkan secara periodik ke medium baru sehingga dapat menyita waktu dan
tenaga. Metode penyimpanan yang lain adalah penyimpanan kering beku (freeze
drying) atau dengan metode penyimpanan dengan suhu ultra dingin (Rahman,
2011).
Beberapa teknik pengawetan dan penyimpanan mikroba sudah banyak
dilakukan dan dikembangkan. Namun untuk memilih suatu metode yang akan
digunakan untuk penyimpanan bakteri yang tepat perlu memperhatikan beberapa
faktor penting diantaranya yaitu jumlah kultur, nilai ekonomis kultur, frekuensi
penggunaan kultur, fasilitas yang dimiliki yang meliputi sumber daya manusia
dan peralatan yang ada serta biaya. Dari beberapa faktor tersebut, hal yang paling
penting adalah untuk menjaga agar mikroorganisme yang diawetkan dan disimpan
tidak mati, tidak terkontaminasi, tidak mengalami perubahan populasi dan tidak
mengalami perubahan genetik (Novelina, 2005). Beberapa teknik penyimpanan
dan pemeliharaan sebagai berikut:
2.5.1 Penyimpanan kultur beku

Banyak laboratorium mikrobiologi menggunakan kultur yang diautentikasi

NCTC untuk menghasilkan kultur stok mereka sendiri untuk penggunaan harian
atau mingguan. Ini bisa menjadi cara yang efektif biaya untuk mempertahankan
strain kontrol meskipun memerlukan manajemen yang hati- hati dan perhatian

6
yang baik terhadap detail, terutama dengan mencatat tanggal ketika strain
dikonfirmasi NCTC dilarutkan dan disubkultur, dan ketika kultur stok dibuat.
Salah satu metode yang paling umum digunakan untuk membuat kultur stok
adalah dengan mengawetkan strain bakteri sebagai kultur beku menggunakan
manik-manik yang tersedia secara komersial dalam kaldu kriopreservatif. Manik-
manik diperlakukan dengan bahan kimia yang meningkatkan adhesi bakteri dan
kaldu kriopreservatif yang berbeda tersedia tergantung pada organisme yang akan
disimpan.
Jika laboratorium menyimpan kultur stok mereka pada manik-manik,
penting untuk mempertimbangkan jenis organisme yang akan diawetkan. Ini
karena tidak semua bakteri berhasil disimpan pada manik-manik. Beberapa strain
sangat teliti dalam persyaratannya sehingga membutuhkan krioprotektan yang
diformulasikan secara khusus. Organisme dalam genus yang sama dapat
bervariasi dalam kesesuaiannya untuk penyimpanan pada manik-manik sehingga
laboratorium disarankan untuk mempertimbangkan laporan validasi pabrikan
untuk memeriksa bakteri mana yang digunakan untuk memvalidasi manik-manik.
Penting juga untuk memeriksa instruksi pabrik untuk menyiapkan stok – ini dapat
berbeda tergantung pada produknya.
Beberapa laboratorium menyiapkan biakan stok di lereng agar yang cocok
untuk stok kerja jangka pendek tetapi metode ini lebih menantang untuk
penyimpanan jangka panjang.
Catatan penting:
Bakteri subkultur (passaging) secara berurutan dapat menyebabkan variasi
genetik sehingga galur kontrol stok tidak boleh lebih dari empat subkultur dari
galur yang diautentikasi NCTC. Laboratorium disarankan untuk mencatat jumlah
subkultur. Memeriksa kemurnian kultur stok sangat penting, terlepas dari apakah
mereka disimpan di manik-manik atau lereng. Kultur yang terkontaminasi atau
yang tidak menunjukkan penampilan morfologi yang khas harus dibuang dan

6
ampul NCTC baru diminta. Tidak pernah disarankan untuk mencoba memulihkan
galur kontrol dari kultur campuran.

2.5.2 Penyimpanan dengan Metode Kering Beku atau Liofilisasi

Selain melestarikan, mengautentikasi, dan memasok strain bakteri, NCTC
menyediakan sejumlah layanan terkait kepada komunitas ilmiah. Layanan
pengeringan beku (liofilisasi) Peralatan dan keahlian khusus diperlukan agar strain
bakteri pengeringan beku berhasil sehingga NCTC menawarkan layanan
pengeringan beku kepada ilmuwan yang ingin melestarikan kultur bakteri atau
jamur mereka sendiri. Selain menyediakan kultur dalam ampul kaca standar yang
disegel api, NCTC juga dapat menyediakan kultur beku dalam botol tertutup yang
dievakuasi. Meskipun vial ini dianggap lebih mudah ditangani, kultur cenderung
bertahan untuk jangka waktu yang lebih singkat, tergantung pada jenisnya. Ahli
mikrobiologi NCTC akan dapat memberi tahu Anda tentang layanan ini.
Metode Liofilisasi atau disebut juga pengeringan beku (freeze drying)
merupakan salah satu penyimpanan kultur bakteri jangka panjang. Penyimpanan
jangka panjang harus tetap mempertahankan daya hidup bakteri. Metode liofilisasi
adalah metode penyimpanan kering beku dengan menambahkan lioprotektan
(lyoprotectant) sebagai bahan pelindung. Sebelum dilakukan liofilisasi, untuk
meminimalisir kerusakan sel bakteri dan mempertahankan daya hidup bakteri
dilakukan penambahan lioprotektan. Beberapa lioprotektan yang dapat digunakan
untuk bakteri yaitu susu skim, sukrosa, trehalosa dan gliserol. Lioprotektan yang
digunakan dapat berbahan dasar gula karena gula mempunyai kemampuan untuk
melindungi struktur protein dalam keadaan kering. Gula yang dapat berfungsi

6
sebagai lioprotektan untuk protein meliputi glukosa, laktosa, trehalosa,
maltodektrin dan mannitol. Penambahan gula berupa sakarida non pereduksi
seperti sukrosa merupakan stabilitor yang dapat melindungi protein secara efektif
(Puspawati dkk, 2010).
Metode liofilisasi merupakan metode kering beku, pada teknik ini produk
akan dibekukan kemudian air dalam bahan langsung diubah menjadi uap. Proses
pembekuan dilakukan dalam bejana tertutup rapat dengan tekanan vacum
menggunakan panas yang terjaga dan didehidrasi. Dan proses liofilisasi di
dapatkan hasil bahan yang kering, ringan dan hanya membutuhkan ruang yang
lebih ringkas (Dewi, 2009). Liofilisasi (lyophilization) adalah metode
penyimpanan kering beku untuk mengawetkan kultur jangka panjang
menggunakan bahan pelindung atau lioprotektan. Penambahan lioprotektan
dilakukan sebelum proses liofilisasi untuk meminimalisir kerusakan sel bakteri
(Puspawati dkk, 2010). Proses liofilisasi merupakan kombinasi antara dua metode
penyimpanan jangka panjang yang paling baik yaitu pembekuan dan pengeringan.
Proses liofilisasi dimulai dengan membekukan suspensi bakteri dan mengeluarkan
atau mengurangi kandungan airnya dengan cara sublimasi, yaitu penguapan
langsung merubah bentuk es menjadi gas atau uap (Sugiawan, 2000). Keuntungan
metode ini yaitu popular dan banyak digunakan untuk penyimpanan bakteri
jangka panjang (Machmud, 2001).
Produk kultur yang mengalami proses pengeringan beku memiliki beberapa
keuntungan yaitu produk kering beku antara lain: kering, stabil, menempati
volume yang kecil sehingga dapat menekan biaya penyimpanan dan pengiriman
(Machmud, 2001). Dalam metode pengeringan beku terdapat tiga tahapan yaitu :
1. Tahap Pembekuan adalah mendinginkan material di bawah titik
eutektiknya yaitu suhu terendah pada saat fase padat dan cair bahan dapat
berdampingan. Dalam hal ini, memastikan bahwa sangat cenderung
terjadi sublimasi daripada berubah menjadi fase cair. Fase pembekuan
merupakan yang paling penting dalam proses pengeringan beku ini

6
 karena suatu produk dapat diperlakukan supaya menghasilkan hasil akhir
yang baik (Shukla,2011).
2. Pengeringan Primer dilakukan dengan cara tekanan diturunkan (beberapa
milibar) dan diberikan panas yang cukup untuk sublimasi. Pada fase
pengeringan primer, pengendalian tekanan dilakukan melalui vacum
parsial dan sekitar 95% air disublimasikan, sehingga kemungkinan pada
fase ini terjadi secara lambat. Peran kondensor yang sudah diatur
suhunya biasanya dibawah 50˚C dalam fase ini adalah untuk mencegah
uap air mencapai pompa vacum sehingga dapat menurunkan kinerja
pompa. Molekul air yang tidak tercairkan selanjutnya akan dihilangkan
dengan fase pengeringan sekunder.
3. Pengeringan Sekunder
Pada proses freeze drying dalam fase ini diatur oleh isoterm adsorbsi
bahan. Suhu pada pengeringan sekunder dinaikkan lebih tinggi daripada
pengeringan primer, bahkan ada suhu yang diatas 0˚C. Selain suhu,
tekanan dalam fase ini diturunkan karena untuk mendorong desorpsi
yang biasanya dalam mikrobar atau fraksi pascal. Hasil akhirnya adalah
kandungan air akan mencapai hanya sebesar 1% sampai 4% saja
(Shukla,2011). Hal yang perlu diperhatikan adalah lioprotektan
(lyoprotectant) yang akan digunakan untuk pembuatan suspensi sel
supaya kerusakan sel hidup pada tahapan pembekuan dan pengeringan
dapat dicegah. Hal yang perlu diperhatikan adalah lioprotektan
(lyoprotectant) yang akan digunakan untuk pembuatan suspensi sel
supaya kerusakan sel hidup pada tahapan pembekuan dan pengeringan
dapat dicegah.
Lioprotektan merupakan zat kimia nonelektrolit yang memiliki peran dalam
mengurangi pengaruh mematikan baik berupa pengaruh larutan maupun adanya
pembentukan kristal es selama pembekuan sehingga dapat mempertahankan
viabilitas sel. Berdasarkan sifat fisikokimia dan daya permeabilitas membran,

6
maka lioprotektan dibagi menjadi dua kelompok, yang pertama yaitu lioprotektan
intraseluler merupakan lioprotektan yang memiliki bobot molekul kecil dan
bersifat permeabel sehingga dapat keluar masuk membran (contoh: gliserol, etilen
glikol, dan propanadiol). Kedua yaitu lioprotektan ekstraseluler merupakan
lioprotektan yang memiliki bobot molekul besar dan bersifat nonpermeatif
sehingga tidak dapat keluar masuk membran (contoh: protein, sukrosa, manosa,
rafinosa, kuning telur, dan susu) (Vishwanath& Shannon 2000).
Lioprotektan yang paling banyak digunakan adalah gliserol karena dapat
berdifusi ke dalam sel lebih cepat, mampu mengubah kristal es yang berukuran
besar dan tajam, dan melenturkan membran sel sehingga tidak mudah rapuh.
Selain itu, gliserol dapat menggantikan sebagian air yang bebas dan mendesak
keluar elektrolit sehingga menurunkan konsentrasi elektrolit intraseluler dan
mengurangi daya merusaknya suatu bahan.
2.5.3 Penyimpanan dalam akuades steril
Penyimpanan dalam akuades steril hanya dapat digunakan untuk beberapa
bakteri, terutama bakteri Gram negatif dan berbentuk batang, misalnya anggota
genus Pseudomonas. Metode ini masih kurang efektif karena bakteri yang
disimpan berpeluang kontaminasi, tetapi masih bisa digunakan sebagai alternatif
penyimpanan jangka sedang atau sebagai pendamping penyimpanan jangka
panjang (Prastowo, 2019).
2.5.4 Penyimpanan dalam Minyak Mineral
Metode penyimpanan dalam minyak mineral dilakukan dengan cara
menyimpan biakan bakteri dalam tabung dan menutupnya dengan minyak mineral
atau parafin cair. Bakteri ditumbuhkan pada tabung berisi medium agar miring
atau medium cair (broth) yang sesuai, lalu permukaan biakan ditutup dengan
minyak mineral steril setinggi 10-20 mm dari permukaan atas medium. Metode ini
memiliki kelemahan yaitu kurang praktis untuk ditransportasi dan keberadaan
minyak mineral mengakibatkan peremajaan menjadi kotor (Prastowo, 2019).

6
2.5.5 Penyimpanan dalam Tanah Steril
Metode penyimpanan dalam tanah steril terutama diaplikasikan untuk
bakteri yang membentuk spora seperti Bacillus sp dan Clostridium sp. Beberapa
keuntungan metode ini yaitu biaya murah, penyimpanan pada suhu ruang, dan
stabilitas genetik mikroba dapat dipertahankan (Prastowo, 2019).
2.5.6 Penyimpanan international
NCTC adalah penyimpanan paten International Depository Authority (IDA)
untuk strain bakteri dan plasmid yang diakui di bawah Perjanjian Budapest. Ini
adalah perjanjian internasional yang ditandatangani oleh 75 negara dan
berdasarkan perjanjian ini, koleksi budaya tertentu yang dinominasikan secara
formal, seperti NCTC, ditetapkan sebagai IDA. Hal ini karena strain bakteri yang
dipatenkan penting untuk disimpan dalam koleksi kultur untuk pengujian di masa
mendatang dan untuk memungkinkan pemeriksaan oleh pihak lain yang berhak
melakukannya. NCTC menangani strain bakteri yang disimpan untuk tujuan paten
dan metadata terkait secara rahasia menggunakan sistem yang independen dari
koleksi NCTC utama.
2.5.7 Penyimpanan Koleksi spesial, unik dan pribadi
NCTC menyediakan penyimpanan yang aman untuk koleksi pribadi kultur
bakteri atas nama pihak ketiga; layanan ini tersedia untuk budaya tunggal atau
seluruh koleksi
2.5.8 Penyimpanan Rentang strain yang tersedia
Dengan lebih dari 5000 kultur bakteri termasuk 1000 jenis galur untuk
dipilih, mungkin sulit untuk memutuskan dengan tepat apa yang Anda butuhkan.
Katalog online adalah sumber informasi pertama Anda – kunjungi www.phe-
culturecollections.org.uk/bacteria-search.
Ahli mikrobiologi NCTC siap sedia untuk memberikan saran dan dapat meminta
keahlian ilmuwan yang lebih luas di seluruh PHE jika mereka memerlukan
bantuan untuk menjawab pertanyaan Anda.

7
Diagram pohon filogenetik di bawah ini mewakili spesies bakteri NCTC yang
tersedia dan dihasilkan menggunakan alat web pohon kehidupan interaktif
(Letunic and Bork. Interactive Tree of Life v2: anotasi online dan tampilan pohon
filogenetik menjadi mudah. Res. Asam Nukleat 2011. 39 (suppl 2): W475-W478).
5000 strain bakteri
1000 jenis strain

7
Kontrol kualitas dan keaslian galur NCTC
Meskipun para ilmuwan cenderung berhati-hati ketika memilih instrumen, kit dan
reagen untuk penelitian atau prosedur pengujian mereka, mereka sering
mengabaikan pentingnya sumber dan pengelolaan galur kontrol dan bahan
biologis mereka. Beberapa perkiraan menunjukkan bahwa hingga 70% galur yang
digunakan dalam penelitian yang diterbitkan bukan dari koleksi budaya yang
diakui, yang berarti bahwa puluhan ribu ilmuwan mungkin menggunakan galur
untuk penelitian tanpa otentikasi dan asal yang tepat. Ada juga bukti yang
diterbitkan1 bahwa laboratorium pengujian diagnostik tidak selalu mengelola
strain kontrol mereka secara efektif. Ini mungkin karena ada persepsi bahwa
bahan biologis yang diautentikasi mahal atau sulit untuk ditangani dan disimpan.
Ada implikasi serius yang terkait dengan pelaporan hasil yang menyesatkan dan
mencapai kesimpulan yang tidak berdasar yang dapat timbul dari penggunaan
strain yang salah atau tidak diautentikasi.

Semua kultur yang diterima di laboratorium NCTC kami untuk dimasukkan

dalam koleksi disiapkan sebagai stok beku-kering yang dihasilkan sedemikian
rupa untuk memastikan bahwa jumlah subkultur (bagian) dijaga agar tetap
minimum. Ini mengurangi risiko terjadinya mutasi genetik. Deposan terlibat
dalam proses otentikasi awal untuk memastikan bahwa budaya mereka telah
mempertahankan karakteristik yang diharapkan setelah pelestarian. Tim NCTC
melakukan tes kontrol kualitas untuk batch awal dan setiap batch berikutnya, yang
meliputi:
1. Tes morfologi dan perilaku (fisiologi, kebutuhan nutrisi, tes enzim)
2. Tes protein (serologi, spektrometri massa (MALDI-TOF MS .)2))

7
 3. Tes genomik (sekuensing gen RNA ribosom 16S, sekuensing seluruh
genom)
NCTC menghasilkan sertifikat analisis untuk setiap batch yang memberikan
informasi tentang hasil uji kontrol kualitas yang dilakukan sehingga para ilmuwan
dapat yakin tentang keaslian galur mereka.
1 Cross, LJ, Russell, JE dan Desai, M. Meneliti variasi genetik mikroba
referensi kultur yang digunakan dalam laboratorium makanan dan
lingkungan menggunakan analisis polimorfisme panjang fragmen yang
diperkuat dengan fluoresen. Mikrobiol FEMS Lett. 2011, 1-7.
2 Desorpsi/ionisasi laser dengan bantuan matriks spektrometri massa waktu
penerbangan

7
 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Quality Control (QC) adalah salah satu komponen dalam proses kontrol dan
merupakan elemen utama dari sistem manajemen mutu. Statistical Quality
Control (SQC) berguna untuk memantau perubahan yang terjadi pada alat, reagen,
kalibrator, dan prosedur kerja. ATCC (The American Type Culture Collection)
merupakan kumpulan spesies bakteri yang terdiri dari strain-strain berbeda yang
saling berhubungan oleh karena itu di perlukan penandaan subspecies untuk
menunjukkan sifat-sifat tertentu dari variasi strain, seperti serotipe, patotipe,
morfotipe atau tipe faga. National Collection of Type Cultures (NCTC) adalah
penjaga strain bakteri yang mewakili pekerjaan dan kolaborasi banyak ilmuwan
selama hampir 150 tahun. Terdiri dari hampir 6.000 strain dari lebih dari 850
spesies bakteri, setiap strain memiliki sejarah uniknya sendiri.
Kultur bakteri murni yang digunakan setiap saat harus dalam kondisi yang
baik. Untuk menjaga kualitas kultur bakteri murni tetap dalam kondisi yang baik
harus dilakukan penyimpanan dan pemeliharaan terhadap kultur bakteri tersebut.
Penyimpanan atau koleksi meliputi jangka panjang maupun jangka pendek.
Peremajaan bakteri bertujuan agar bakteri memulai metabolisme kembali setelah
penyiapan.

7
 DAFTAR PUSTAKA

https://www.AsiaNet.com,ATCC, 9 March, 2006

https://pdfcoffee.com/qdownload/makalah-qc-strain-standar-pdf-free.html

http://journal.unnes.ac.id/nju/index.php/Biosaintifika, Semarang 2014

https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-
guide#bacterialauthentication

Dewi, I.K. 2009. Efektivitas Pemberian Bloteng Kering Terhadap Pertumbuhan

Jamur Tiram Putih ( Pleurotus ostreatus ) pada Media Serbuk Kayu. Skripsi.
Universitas Muhammadiyah Surakarta.

Etzel, Michael J. Walker, Bruce J. Stanton, William J. 1997. Marketing. Edisi ke

11. USA. McGraw-Hill, Inc.

Machmud, M. 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Buletin

AgroBio 4(1):24-32

National Collection of Type Cultures. 2015. National Collection of Type Culture,

Authenticated Bacterial Reference and Type Strain. Public Health England.
https://www.phe-culturecollection.org.uk/media/103033/ntcc-brochure-
4mb-final.pdf

Pelczar, Michael J dan Chan, E. C. S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid I.

Jakarta: UI Press

Prastowo, Ryan Farkhan. 2019. Pemeliharaan Kultur Murni Escherichia coli

Menggunakan Metode Paper Filter. Skripsi. Lampung: Fakultas Pertanian
UNILA

7
Prastowo, Ryan Farkhan. 2019. Pemeliharaan Kultur Murni Escherichia coli
Menggunakan Metode Paper Filter. Skripsi. Lampung: Fakultas Pertanian
UNILA

Puspawati, NN., dkk. 2010. Penggunaan berbagai jenis bahan pelindung untuk
mempertahankan viabilitas bakteri asam laktat yang diisolasi dari air susu
ibu pada proses pengeringan beku. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan,
vol. 21, no. 1, hal 59-72

Rofiani, R. 2020.Gambaran Angka Lempeng Total (Alt) Pada Bakteri

Pseudomonas Aeruginosa Atcc 27853 Sebelum Dan Sesudah Diliofilisasi
Dan Disimpan 30 Hari Pada Suhu 4°C (Doctoral dissertation, Poltekkes
Kemenkes Yogyakarta).

Septiyani, E. D. 2020.Gambaran Alt Pada Bakteri Staphylococcus Aureus Atcc

25923 Sebelum Dan Sesudah Diliofilisasi Dan Disimpan Selama 30 Hari
Pada Suhu 4˚C (Doctoral dissertation, Poltekkes Kemenkes Yogyakarta).

Setiaji, J., dkk. 2015. Pengaruh Gliserol pada Media Triptic Soy Broth (TSB)
terhadap Viabilitas Bakteri Aeromonas hydrophila. Jurnal Dinamika
Pertanian 1, vol. XXX no. 1.

Sukorini,dkk. 2010. Pemantapan Mutu Internal Laboratorium Klinik.Yogyakarta:

Alfa Media Yogyakarta