BAB I

PENDAHULUAN

I.1 latar Belakang

Dewasa ini telah banyak dilakukan penelitian dengan metode genome editing,

Ide mengenai genom (gen) editing memang bukan konsep yang baru. Para ilmuan

telah berusaha untuk mencari teknik tersebut sejak tahun 80an. dalam menghasilkan

organisme rekombinan, Setidaknya ada tiga macam teknik yang telah ditemukan

yaitu enzim zinc finger nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector

Nucleases (TALENs) dan Clustered Regularly Interspaced Short Polindromic

Repeats (CRISPR). Namun metode zinc finger nucleases (ZFNs) dan Transcription

Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) membutuhkan biaya yang mahal dan

membutuhkan waktu yang lama dalam mempersiapkannya sehingga tidak efisien

untuk diterapkan secara luas. Sedang teknik Clustered Regularly Interspaced Short

Polindromic Repeats (CRISPR) biayanya lebih murah dan dapat diterapkan secara

lebih luas.

Pada dasarnya semua teknik genom editing memiliki konsep yang sama yaitu

memanfaatkan fungsi enzin nuklease untuk memotong DNA target. Namun teknik

CRISPR memiliki keunikan tersendiri. Teknik ini mengadopsi cara kerja sel prokariot

dalam mempertahankan diri dari serangan virus. Secara seluler, sel prokariot yang

terinveksi virus secara langsung akan mengaktifkan gen-gen khusus untuk

menghancurkan materi genetik virus. Terdapat dua molekul yang berperan pada

sistem imun prokariot yang saat ini dikembangkan dalam teknik CRISPR yaitu
gRNA (g: guide) dan enzim nuklease. Molekul gRNA merupakan RNA yang

ditranskripsikan dari sequence CRISPR dan berfungsi untuk memandu kerja

endonuklease. Enzim nuklease dikodekan dari gen yang dinamakan Cas. Kolaborasi

antara gRNA dan Cas menghasilkan pemotongan yang sangat spesifik karena kerja

enzin Cas akan dipandu oleh gRNA. Sander and Joung. 2014. CRISPR-Cas systems

for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol, 32: 347 – 355.

Teknologi CRISPR telah diterapkan pada sel eukariotik, termasuk sel

manusia, mencit, zebrafish, lalat buah, dan khamir, juga bakteri. Pada tahun 2013,

setidaknya ada delapan publikasi hasil penelitian yang membuktikan dapat

diterapkannya CRISPR pada DNA genom tanaman, baik dikotil maupun monokotil,

yaitu Arabidopsis, tembakau, padi, gandum, dan sorgum. Tim penelitian Jiang dkk.

(2013), sebagai contoh, menerapkan CRISPR pada protoplas padi. Sejak teknik ini

dipublikasikan pada tahun 2012, banyak laboratorium menggunakannya sebagai alat

untuk mengedit genom dalam sebuah penelitian. Umumnya penelitian bidang

biomedical yang sangat terbantu dengan hadirnya teknik tersebut. Peneliti MIT

menggunakan CRISPR pada tikus untuk memperbaiki mutasi yang berkaitan dengan

penyakit metabolisme manusia yang dikenal dengan tyrosinaemia. Bahkan CRISPR

telah digunakan dalam rekayasa genetik pada embrio manusia. Jiang, W., Zhou, H.,

Bi, H., Fromm, M., Yang, B., and Weeks, D.P. 2013. Demonstration of

CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco,

sorghum and rice. Nucleic Acids Research 41(20): e188.

Seperti penelitian dengan judul “Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas

system in medaka” pada tahun 2014 yang dilakukan oleh Satoshi Ansai and Masato
Kinoshita dengan memakai metode genome editing dengan teknik Clustered regularly

interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas9), menguji

kemampuan CRISPR untuk mengedit genom pada embrio ikan medaka Oryzias

latipes, hasilnya, menunjukkan mutasi terarah berhasil pada embrio ikan

medaka Oryzias latipes.

Embrio ikan medaka digunakan pada beberapa penelitian karena embrio ikan

medaka memiliki warna embrio yang transparan sehingga lebih memudahkan dalam

pengamatannya, selain itu embrio ikan medaka lebih resisten terhadap senyawa asing

yang masuk kedalamnya jika dibandingkan embrio vertebrata lain. MEDaka bukunya

inoshita dr umrah.

Oleh karena itu dalam penelitian ini, kami menggunakan sampel embrio ikan

medaka javanicus (Oryzias javanicus) untuk menguji efektivitas CRISPR/Cas9 dalam

mengubah genome embrio ikan medaka javanicus.

I.2 Tujuan Penelitian

1. Mengetahui metode genome editing dengan teknik CRISPS/Cas9 sebagai teknik

yang dapat mengubah genom organisme.

2. Mengetahui dan menguji efektivitas dari CRISP/Cas9 dalam mengubah genom

Ikan medaka Oryzias javanicus.

I.3 Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi dan memperkenalkan CRISPS/Cas9 sebagai cara yang

dapat mengubah genom organisme.

2. Memperoleh informasi mengenai efektivitas dari CRISPR/Cas9 dalam mengubah

genom Ikan Medaka Oryzias javanicus.

I.4 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Desember – Januari 2015. Sampel

didapatkan di Pusat Studi Medaka yang berlokasi di lt. 5 Gedung Pusat Kegiatan

penelitian Universitas Hasanuddin, Sedangkan Penelitian dan Pengamatan dilakukan

di Gedung Sains Building, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Universitas Hasanuddin, Makassar.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Deskripsi dan Klasifikasi Ikan Medaka Oryzias javanicus

Famili Adrianichthyidae adalah kelompok kecil ikan asli Asia, terdiri atas

empat genus (Rosen dan Parenti, 1981), namun pada tahun 2008 direvisi kembali

menjadi dua genus (Parenti, 2008), yaitu Oryzias dengan 33 species dan

Adryanichthys dengan empat species (Eschmeyer and Fong, 2015). Famili

Adrianichthyidae pada umumnya hidup di air tawar, seperti selokan, kolam, kanal,

sawah dan danau, tapi beberapa species ditemukan di air payau dan disepanjang

pesisir (Roberts, 1998).

Ikan medaka adalah ikan kecil asli tropis di Semenanjung Malaysia,

Singapura, Indonesia, Thailand dan Kalimantan Barat (Termvidechakorn, 2009). Ikan

medaka jawa (Oryzias javanicus) yang dikenal dengan nama lokal seperti ikan beras,

ikan menasi, ikan lampu, ikan seliding dan banyak lagi. Ikan Medaka adalah ikan air

tawar yang berukuran 3-4 cm, fertilisasi dan perkembangan telurnya terjadi secara

eksternal, telur dan embrionya transparan . secara umum ikan Medaka memiliki

toleransi dan pola adaptasi terhadap kisaran salinitas dan temperature tertentu, sangat

mudah untuk berkembang biak dan memiliki resistensi yang tinggi terhadap penyakit

yang biasa menyerang ikan (Withbrodt dkk, 2001).

Ikan Medaka jantan dan betina dapat dibedakan dengan adanya beberapa

perbedaan, yakni bentuk tubuh, sirip, dan urinogenital papilla (Iwamatsu et al, 1982).

Waktu pemijahan berkaitan erat dengan siklus cahaya, antara 30-50 telur dihasilkan
setiap waktu pemijahan, dan produksi telur dapat mencapai 3000 telur selama musim

kawin (Withbrodt dkk, 2001).

Ikan Oryzias atau ricefish adalah indikator potensial dan spesies model

eksperimen bila dibandingkan dengan spesies lainnya. Umumnya penelitian-

penelitian telah memberitahukan dengan detail tentang catatan spesies ikan medaka,

fisiologis, morfologis, distribusi dan informasi genom (Ismail and Yusof, 2011).

Umumnya informasi yang paling lengkap diantara genus Oryzias adalah

Oryzias latipes (medaka jepang) yang sudah menjadi hewan percobaan dalam

berbagai disiplin ilmu biologis seperti toksikologi, biokimia, fisiologi, serta filogeni

(Ismail and Yusof, 2011). Dibandingkan dengan Oryzias latipes, ikan medaka lainnya

terutama dari perairan Indonesia juga memiliki potensi yang sama dan mungkin

memiliki manfaat lebih sebagai ikan laboratorium.

Adapun klasifikasi Oryzias javanicus adalah sebagai berikut :

Kingdom : Animalia

Phylum : Chordata

Class : Actinopterygii

Ordo : Beloniformes

Family : Adrianichthyidae

Genus : Oryzias

Species : Oryzias javanicus Bleeker

(Sumber : Bleeker, 1854)

II.2 Genome editing dan Sejarah CRISPR Cas9

Genome editing is the process of editing an organisms DNA by altering, removing or

adding nucleotides to the genome. This process is accomplished through the use of engineered

nucleases that can make a double stranded “cut” or a single stranded “nick” in an organism’s

DNA. These sites are altered and then repaired by homologous recombination or non-homologous

end joining. This type of genetic engineering is useful for a number of applications, including

targeted gene mutations, chromosomal rearrangement, and the creation of transgenic

animals.Editing genom adalah proses mengedit DNA organisme dengan mengubah, menghapus

atau menambahkan nukleotida ke genom. Proses ini dilakukan melalui penggunaan Enzim

nuclease yang dapat memotong DNA (Double stranded) nucleases rekayasa yang dapat

membuat double stranded "cut" atau tunggal terdampar "nick" dalam DNA organisme. Situs-situs

tersebut diubah dan kemudian diperbaiki oleh rekombinasi homolog atau non-homolog end

bergabung. Jenis rekayasa genetika berguna untuk sejumlah aplikasi, termasuk mutasi gen yang

ditargetkan, kromosom penataan ulang, dan penciptaan hewan transgenik. Esvelt, KM.; Wang,

HH. (2013). "Genome-scale engineering for systems and synthetic biology.". Mol Syst Biol 9 (1):

641. doi:10.1038/msb.2012.66. PMC 3564264. PMID 23340847.

CRISPR sequences were first discovered in 1987 in Escherichia coli. They were observed in other
bacterial species and in archaea in 2002. It was first suggested that CRISPR sequences are part
of an immune system in 2005. This was due to the discovery of homology between spacer
sequences and viral and plasmid DNA. Much has been learned about the function of cas proteins
by disabling cas genes. For example, disabling the cas7 gene disrupts the cell’s ability to
incorporate new spacers. Disabling the csn1-like gene causes a loss of resistance against
phages, even if the relevant spacers are present. This shows that cas genes are necessary for
immunity in addition to CRISPR sequences (Horvath and Barrangou. 2010)Urutan CRISPR
pertama kali ditemukan pada tahun 1987 di Escherichia coli. Urutan tersebut diamati pada spesies
bakteri lain dan di kelompok archaea pada tahun 2002. Ini pertama kali menyarankan bahwa
urutan CRISPR merupakan bagian dari sistem kekebalan tubuh pada tahun 2005. Hal ini
disebabkan penemuan homologi antara urutan spacer dan DNA virus dan plasmid. Banyak yang
telah belajar tentang fungsi protein cas dengan menonaktifkan gen cas. Misalnya, menonaktifkan
gen cas7 mengganggu kemampuan sel untuk menggabungkan spacer baru. Menonaktifkan gen
csn1 seperti menyebabkan hilangnya perlawanan terhadap fag, bahkan jika spacer yang relevan
yang hadir. Hal ini menunjukkan bahwa gen cas diperlukan untuk kekebalan selain urutan
CRISPR (Horvath dan Barrangou. 2010)

CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) is a defense mechanism, present in

bacteria and archaea, which confers immunity against phages. All species of bacteria and archaea
are parasitized by viruses known as phages. Accordingly, prokaryotes have evolved many
different types of protection against infection by phages and other sources of foreign DNA. These
include prevention of absorption, blocking of injection, abortive infection, and the restriction-
modification system (Horvath and Barrangou. 2010). CRISPR DNA sequences and their
associated proteins are one such type of protection. The CRISPR system protects prokaryotic
cells by destroying viral DNA after it has entered the cell.
CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) adalah suatu mekanisme
pertahanan, yang terdapat dalam bakteri dan archaea, sehingga dapat resisten terhadap
fage. Semua spesies bakteri dan archaea yang terparasit oleh virus yang dikenal sebagai
fage. Dengan demikian, prokariota telah berevolusi oleh berbagai jenis perlindungan
terhadap infeksi oleh fage dan sumber DNA asing. Yang didalamnya termasuk pencegahan
penyerapan, memblokir injeksi, infeksi gagal, dan sistem pembatasan-modifikasi (Horvath
dan Barrangou. 2010). Urutan DNA CRISPR dan protein terkait adalah salah satu jenis
pertahanan. Sistem CRISPR melindungi sel prokariotik dengan menghancurkan DNA virus
setelah memasuki sel.

Saat ini, telah muncul teknologi genome engineering atau lebih dikenal

sebagai genome editing yang disinyalir merupakan pendekatan yang lebih baik dari
transgenesis klasik.Teknologi yang tergolong baru ini dipublikasikan secara resmi pada tahun
2005. Sesuai namanya, genome editing dilakukan dengan memasukkan modul pemotongan
DNA (DNA-cutting module) bersama dengan potongan DNA yang akan disisipkan. Ketika DNA
asli terpotong, sel akan menggantikannya dengan DNA donor. Saat ini dikenal tiga modul
pemotongan DNA seperti seperti Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like
Effector Nucleases (TALENs) dan sistem CRISPR/Cas [4-6]. Teknik ini diklaim berbeda dengan
modifikasi genetik tradisional, karena tidak melibatkan transplantasi gen dari spesies lain
(bakteri atau tanaman lain) namun mempercepat proses mutasi genetik yang secara normal
terjadi saat proses pemuliaan. Ini berarti bahwa, dalam banyak kasus, teknik tersebut meniru
proses alami sel dan tidak menyebabkan transformasi gen secara keseluruhan dimana hal
tersebut sering terkait dengan kasus sensitif Genetically Modified Organism (GMO).4. Puchta H,
Fauser F (2013) Gene targeting in plants: 25 years later. The International Journal of
Developmental Biology 57: 629-637.

5. Sprink T, Metje J, Hartung F (2015) Plant genome editing by novel tools: TALEN and other
sequence specific nucleases. Current Opinion in Biotechnology 32: 47-53.

6. Belhaj K, Chaparro-Garcia A, Kamoun S, Nekrasov V (2013) Plant genome editing made

easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant
Methods 9: 39.

II.4 mekanisme genome engeenering CRISPR Cas9

II.5 Metode Mikroinjeksi

Mikroinjeksi merupakan teknik transfer gen yang umum digunakan pada

transgenesis (Takagi et al., 1994; Volckaert et al., 1994; Hamada et al., 1998;

Alimuddin et al., 2003; Kato et al., 2007). Konstruksi DNA diintroduksikan ke dalam

sel embrio ikan dengan menggunakan jarum injeksi berukuran sangat kecil.

Introduksi dilakukan di bawah mikroskop dengan bantuan mikromanipulator yang

mengatur posisi jarum suntik. Untuk memastikan material genetik masuk ke

pronuklei, konsentrasi DNA yang tinggi (10 4 -10 7 copy) biasanya diinjeksikan ke

telur yang telah dibuahi. Meskipun injeksi dengan jumlah copy DNA yang tinggi

meningkatkan integrasi transgen (DNA yang ditranfer), tetapi hal itu meningkatkan

resiko kematian pada embrio. Integrasi transgen pada DNA inang umumnya tidak

terjadi pada fase satu sel, sehingga tidak semua sel ikan membawa transgen (mozaik)

(Zbikwoska 2003)

Keberhasilan prosedur mikroinjeksi telur bergantung kepada beberapa faktor

termasuk di dalamnya: kualitas benih dan telur, metode pelaksanaan manipulasi,

tipe penyangga injeksi yang digunakan, bentuk dari DNA, konsentrasi suntikan dan

ketrampilan teknisi. Faktor-faktor tersebut sangat mempengaruhi tingkat kegagalan

atau keberhasilan pasca injeksi misalnya laju kematian yang bervariasi dari satu telur

salmonid pasca injeksiyang berkisar antara 30-95% (Fletcher & Davids 1991). Pada

spesies lain, tingkat kelangsungan hidup dilaporkan oleh Dunhamet al. (1992) pada

channel catfish (Ictalurus punctatus) yang memperoleh tingkat kelangsungan hidup

sekitar 33%. Beberapa penelitian terdahulu telah menguji pengaruh waktu injeksi

terhadap tingkat kelangsungan hidup telur. Evaluasi data telah mengindikasikan

bahwa terdapat hubungan langsung antara waktu injeksi dengan tingkat kelangsungan

hidup telur.

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1 Alat Penelitian

Alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah mikromanipulator,

mikroinjektor, jarum mikroinjeksi, mikroskop, tip mikropipet, sarung tangan lateks,

cawan petri, needle holder. tabung eppendorf steril 1,5 ml, microwave, gelas

Erlenmeyer, jarum minyak mineral, cetakan marmer, pipet.

III. 2 Bahan Penelitian

sgRNA, Enzim Endonuklease, 30 ml gel agarosa 2%, 15 ml air keran, plester vinyl,

minyak mineral, akuades, etanol 70 %.

III.3 Prosedur Penelitian

III.3.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel Ikan Medaka Javanicus dilakukan di Sungai

Jene’berang, Makassar, Sulawesi Selatan

III.3.1 Pengadaan dan Pemeliharaan embrio ikan Medaka Javanicus

 Ikan Medaka Javanicus dipelihara dengan instruksi yang tepat hingga

melakukan proses pemijahan dan menghasilkan telur, pemeliharaan dilakukan gedung

Pusat Kegiatan Penelitian, Universitas Hasanuddin.

III.3.2 Pembuatan Cekungan Gel agarosa

Gel agarosa 2% dibuat dengan mencampurkan sebanyak 0,6 gr serbuk

agarosa ke dalam 30 ml di Erlenmeyer, dilarutkan dan ditutup dengan aluminium foil.

Selanjutnya dipanaskan pada oven hingga mendidih, Kemudian dengan kondisi yang

hangat, tuang larutan gel agarosa kedalam cawan petri secara merata dan hati-hati

agar tidak terbentuk gelembung. Setelah gel agarosa dalam kondisi semi padat

cetakan marmer diletakkan diatas permukan gel agarosa sehingga terbentuk

cekungan. Setelah nantinya digunakan, cekungan gel agarosa dibilas dengan etanol

70% dan akuades, kemudianditutup dengan plastik sebelum disimpan di dalamlemari

es. Cekungan gel agarosa ini dapat digunakan beberapa kali.

III.3.4 Pelaksanaan Metode Mikroinjeksi

Pelaksanaan metode mikroinjeksi dilakukan sesuai dengan prosedur

Alimuddin (2003), Sebanyak 10 μL larutan DNA diambil menggunakan mikropipet

dengan tip panjang (tip loading) dibagian ujungnya dan kemudian dimasukkan ke

dalam jarum mikroinjeksi, Ukuran bukaan mulut jarum mikroinjeksi adalah sekitar 5-

7 μm. Minyak mineral ditambahkan ke dalam jarum mikroinjeksi menggunakan

jarum minyak mineral yang telah dipasang pada needle holder. Jarum minyak mineral

dilepas dan jarum mikroinjeksi yang telah berisi larutan DNA dan minyak mineral

disambungkan ke needle holder pada seperangkat alat mikroinjektor

 Embrio ikan Medaka Javanicus fase 1 sel diletakkan dan diatur secara hati-

hati ke dalam cekungan gel agarosa menggunakan pipet. Posisi telur diatur

sedemikian rupa sehingga blastodisk mengarah ke jarum mikroinjeksi untuk

memudahkan proses injeksi. Mikroinjeksi dilakukan di bawah mikroskop. Jarum

mikroinjeksi digerakkan menggunakan micromanipulator. Perlakuan injeksi

dilakukan pada 50 sampel embrio dari induk yang berada di akuarium secara acak.

Telur-telur yang telah diinjeksi dipindahkan ke dalam akuarium inkubasi. Suhu air

akuarium inkubasi adalah 24 ± 10C. Setiap hari, telur yang tidak dibuahi atau

mengalami deformasi dibuang.

III.3.5 Analisis Data.

Parameter yang diamati yaitu perubahan warna pada embrio Ikan Medaka dan

larva yang mengalami mutagenesis serta yang tidak mengalami mutagenesis.