LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA DAN PEMULIABIAKAN BIOTA AIR

ANALISIS DNA PADA UDANG WINDU (Panaeus monodon)

OLEH NAMA STAMBUK KELOMPOK ASISTEN : ANDI MASRIAH : L22110902 : VIII (DELAPAN) : MUSYARRAFAH MANSYAH, S.Pi

PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN JURUSAN PERIKANAN FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2013

I. PENDAHULUAN

Latar Belakang Sumberdaya hayati perairan merupakan salah satu modal dasar pembangunan Nasional yang sangat penting. Kontribusi subsektor perikanan telah nyata terhadap penerimaan devisa negara dan di masa datang perlu lebih ditingkatkan. Sejalan dengan itu, Direktorat Jendral Perikanan telah

mencanangkan PROTEKAN (Program Peningkatan Ekspor Perikanan) 2003, dengan nilai US $ 7.6 milyar; dan sebesar US $ 6.78 milyar berasal dari budidaya udang windu (Prihatman, 2003). Sistem PCR yang memanfaatkan DNA dari organisme telah diaplikasikan dalam bidang perikanan. Terutama dalam pendeteksian jenis penyakit yang menyerang udang windu. Namun analisis DNA dengan sistem PCR tidak hanya dapat digunakan pada pendeteksian penyakit (virus) saja, tetapi juga dapat digunakan dalam identifikasi dan pembacaan sumber informasi pada level molekuler. Terdapat tiga jenis penanda genetik dalam menganalisis genom, yaitu penanda morfologi, penanda protein dan penanda DNA. Untuk menjadi penanda genetik, lokus dari penanda harus lokus yang secara eksperimen dapat mendeteksi variasi diantara individu di dalam pengujian populasi. Perbedaan jenis penanda bisa mengidentifikasi polimorfisme yang berbeda juga (Liu, 1998 dalam Kusumawaty, 2001). Analisis DNA bertujuan untuk mengarakterisasi DNA makhluk hidup untuk mengidentifikasi susunan DNA-nya. Barang bukti DNA dapat diambil dari barang bukti biologis, baik dalam keadaan utuh maupun tidak utuh lagi. Analisa DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik) yang dimiliki oleh

organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi DNA, PCR, dan elektroforesis (Nuraisyah, 2012). Sejak ditemukan penanda DNA, penanda ini menjadi populer digunakan dalam mempelajari filogenetik molekuler. Penanda DNA adalah sebagian kecil DNA yang dapat menunjukkan polimorfisme diantara individu yang berbeda. Ada dua macam pendekatan yang dilakukan pada analisis penanda DNA ini, diantaranya pendekatan dengan hibridisasi dan PCR (Kusumawaty, 2001).

Tujuan dan Kegunaan Tujuan dari Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Panneus monodon) adalah agar mahasiswa mampu untuk melakukan ekstraksi DNA secara sederhana dan mengamati presipitasi DNA pada Udang Windu (Panneus monodon). Kegunaan dari Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu ( Panneus monodon) adalah agar mahasiswa mampu untuk melakukan secara langsung ekstraksi DNA secara sederhana dan mengamati presipitasi DNA pada Udang Windu (Panneus monodon).

II. TINJAUAN PUSTAKA

Udang Windu (Penaeus monodon) A. Deskripsi dan Sistematika Udang Windu (Penaeus monodon) Udang windu digolongkan ke dalam keluarga Penaeid pada filum Arthropoda. Terdapat ribuan spesies dalam filum ini, namun yang mendominasi perairan berasal dari subfillum Crustacea. Berikut tata nama udang windu kompilasi dari Motoh (1981) dan Landau (1992) dalam Education, 2011: Kingdom : Animalia Subkingdom : Metazoa Fillum : Arthropoda Subfillum : Crustacea Kelas : Malacostraca Ordo : Decapoda Famili : Penaeidae Genus : Penaeus Spesies : Penaeus monodon

Gambar 1. Morfologi Udang Windu Udang merupakan jenis ikan konsumsi air payau, badan beruas berjumlah 13 (5 ruas kepala dan 8 ruas dada) dan seluruh tubuh ditutupi oleh

kerangka luar yang disebut eksosketelon. Umumnya udang yang terdapat di pasaran sebagian besar terdiri dari udang laut. Hanya sebagian kecil saja yang terdiri dari udang air tawar, terutama di daerah sekitar sungai besar dan rawa dekat pantai. Udang air tawar pada umumnya termasuk dalam keluarga Palaemonidae, sehingga para ahli sering menyebutnya sebagai kelompok udang palaemonid. Udang laut, terutama dari keluarga Penaeidae, yang bisa disebut udang penaeid oleh para ahli (Prihatman, 2003). Udang merupakan salah satu bahan makanan sumber protein hewani yang bermutu tinggi. Bagi Indonesia udang merupakan primadona ekspor non migas. Permintaan konsumen dunia terhadap udang rata-rata naik 11,5% per tahun. Walaupun masih banyak kendala, namun hingga saat ini negara produsen udang yang menjadi pesaing baru ekspor udang Indonesia terus bermunculan (Prihatman, 200).

B. Pengembangan Budidaya Udang Windu (Penaeus monodon) Pemuliaan Dalam Pengembangan Budidaya Tambak Sebagaimana halnya dengan kegiatan budidaya lainnya, pengembangan budi-daya udang windu menghadapi beberapa kendala diantaranya masalah penyakit. Ken-dala lainnya adalah masalah yang berkaitan dengan nutrisi dan kualitas air (Kurniawan, 2003). Penyakit infeksi merupakan penyakit yang sering dikaitkan dengan kegagalan produksi baik dipembenihan maupun ditambak-tambak pembesaran udang windu. Hingga kini, penyakit virus dan bakteri merupakan penyakit utama yang dihadapi para petambak dan sering menyebabkan kegagalan panen (Kurniawan, 2003). Pengendalian penyakit infeksi diantaranya dilakukan dengan

memproduksi benih yang rentan terhadap penyakit. Tindakan ini merupakan

tindakan internal terhadap biota yang dilaksanakan dengan cara konvensional dan dengan menggunakan teknologi maju. Upaya ini merupakan kegiatan pemuliaan udang windu yang diharapkan unggul dari aspek kesehatan terutama untuk memperoleh Specific Pathogen Free (SPF) (Wyban, 1992). Meskipun demikian aspek nutritif, pertumbuhan dan reproduktif juga harus dipertimbangkan dalam pemuliaan hewan (Kurniawan, 2003). Pemuliaan Dengan Teknologi Transgenik Alternatif lain untuk menghadapi kendala dalam budidaya adalah pemuliaan dengan teknologi transgenik. Devlin et al. (2001) mengungkapkan, bahwa teknologi transgenik dapat memacu pertumbuhan ikan Rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) liar. Hal ini dilakukan dengan konstruksi gen pertumbuhan (OnMTGHI) melalui mikroinjeksi telur. Atas dasar itu, teknologi transgenik mungkin dapat diterapkan pada pemuliaan udang windu untuk memperoleh udang unggulan. Udang transgenik adalah udang yang telah mengalami perubahan secara buatan pada gennya dengan cara mengubah susunan asli genom aslinya dengan tehnik rekombinan DNA (Kurniawan, 2003).

DNA (DEOXIRIBO NUCLEAT ACID) A. Gambaran Umum DNA Asam deoksiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA (bahasa Inggris: deoxyribonucleic acid), adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian

yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus) (Suparmuji, 2012). Rangka utama untai DNA terdiri dari gugus fosfat dan gula yang berselang-seling. Gula pada DNA adalah gula pentosa (berkarbon lima), yaitu 2deoksiribosa. Dua gugus gula terhubung dengan fosfat melalui ikatan fosfodiester antara atom karbon ketiga pada cincin satu gula dan atom karbon kelima pada gula lainnya. Salah satu perbedaan utama DNA dan RNA adalah gula penyusunnya; gula RNA adalah ribosa (Suparmuji, 2012).

B. Sturktur DNA DNA terdiri atas dua untai yang berpilin membentuk struktur heliks ganda. Pada struktur heliks ganda, orientasi rantai nukleotida pada satu untai berlawanan dengan orientasi nukleotida untai lainnya. Hal ini disebut sebagai antiparalel. Masing-masing untai terdiri dari rangka utama, sebagai struktur utama, dan basa nitrogen, yang berinteraksi dengan untai DNA satunya pada heliks. Kedua untai pada heliks ganda DNA disatukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang terdapat pada kedua untai tersebut. Empat basa yang ditemukan pada DNA adalah adenina (dilambangkan A), sitosina (C, dari cytosine), guanina (G), dan timina (T). Adenina berikatan hidrogen dengan timina, sedangkan guanina berikatan dengan sitosina. Segmen polipeptida dari DNA disebut gen, biasanya merupakan molekul RNA (Suparmuji, 2012).

Gambar 2. Ilustrasi Struktur Molekul DNA (Suparmuji, 2012)

Gambar 3. Struktur DNA C. Fungsi DNA DNA merupakan polimer yang amat penting dalam kehidupan suatu sel karena DNA inilah yang mengekspresikan sifat genetika, DNA merupakan pembawa informasi genetik yang hasil akhir ekspresinya berupa suatu protein atau RNA. Gen adalah bagian dari DNA yang berperan sebagai pembawa informasi genetika melalui pembentukan molekul protein secara tidak langsung. Jika terjadi mutasi pada DNA suatu gen maka hasil ekspresinya dapat mengalami perubahan susunan asam amino pada posisi tertentu sehingga dapat mengakibatkan perubahan sifat maupun aktivitas protein yang dihasilkan (Admin, 2011). DNA dari berbagai spesies mempunyai jumlah pasangan basa dan jumlah gen yang berbeda. Organisme tingkat tinggi mempunyai jumlah gen yang lebih banyak dibandingkan organisme tingkat rendah. DNA suatu spesies atau organisme tertentu mempunyai perbandingan dan urutan unit mononukleotida yang khas. Sel prokariotik yang hanya mengandung 1 kromosom mempunyai DNA yang merupakan suatu makromolekul tunggal sedangkan sel eukariotik

mempunyai beberapa atau banyak kromosom dengan berat molekul yang besar pula (Admin, 2011). PCR ( Polymerase Chain Reaction) PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasa Adenine), dCTP (nukleotida berbasa Cytosine) dan dTTP (nukleotida berbasa Thymine) (Muladno, 2002). PCR adalah suatu metode yang menggunakan komponenkomponen replikasi DNA untuk mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Metode ini dikembangkan untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Dua primer

oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan diamplifikasi. Primer menguatkan dan mencangkok target sequens, satu dari setiap strand dari double strand DNA molekul. Primer menetapkan limit daerah yang akan diamplifikasi dan DNA polymerase mereplikasi DNA diantara primer menggunakan empat deoksiribonukelotida (dGTP, dATP, dCTP, dTTP) yang disediakan di dalam tabung reaksi dengan penambahan dNTPs. Di dalam sebuah siklus amplifikasi (=replikasi), DNA template didenaturasi pada temperature tinggi, annealing primer dilakukan dengan menurunkan temperature

dan DNA polymerase memperpanjang DNA dari primer. Pengulangan siklus denaturasi, annealing primer, dan sintesis DNA menghasilkan DNA melalui amplifikasi secara eksponensial. Sekitar 25 sampai 40 siklus pada umumnya digunakan di dalam thermalcycler, yaitu sebuah instrumen yang secara otomatis mengontrol temperature dan waktu. Suatu DNA polymerase khusus Taq polymerase, yang diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus, yang hidup di hot spring yang stabil pada temperature tinggi digunakan untuk mendenaturasi DNA template. Produk yang dihasilkan dari PCR dianalisa menggunakan elektroforesis gel agarose (Barnum, 2005). Beberapa komponen yang penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah : DNA target, primer, enzim Taq DNA polymerase, deoksinukleoside triphosphat dan larutan penyangga (buffer). Molekul DNA yang targetnya akan dilipatgandakan jumlahnya dapat berupa untai tunggal atau untai ganda. Jumlah yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup. DAlam menentukan jumlah ini, dapat pula dilakukan ujicoba dengan berbagai ukuran, misalnya 10, 100, atau 1000 pikogram sehingga diperoleh kualitas PCR yang paling baik. Apabila target yang digunakan berupa total DNA genom, sebaiknya DNA tersebut dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu sehingga potongan DNA yang dihasilkan masih berukuran cukup besar, misalnya enzim Sal I atau Not I yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam total DNA genom. Primer atau oligonukleotida sebaiknya berukuran paling pendek 16 basa dan biasanya berkisar antara 18 24 basa (Muladno, 2002).

Gambar 4. Rangkaian Alat PCR

Elektroforesis DNA Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Pramono, 2012). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Pramono, 2012).

Gambar 5. Rangkaian Alat Elektroforesis DNA Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi (Anam, 2010).

Gel

elektroforesis

digunakan

untuk

memisahkan

fragmen

DNA

berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti

memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda) (Anam, 2010). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah

bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti, 2006 dalam Anam, 2010).

III. METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Penaeus monodon) dilaksanakan bertepatan pada hari Rabu 1 Mei 2013 pukul 08.00 WITA bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Perikanan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin, Makassar.

Alat dan Bahan Alat dan Bahan yang digunakan pada praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Penaeus monodon) adalah sebagai berikut: Tabel 1. Alat yang digunakan dalam Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Penaeus monodon) No. Alat Fungsi 1 Microwave Untuk memanaskan gel agarose. 2 Mikropipet beserta Untuk engambil sampel. tipnya 3 Vortex Untuk menghomogenkan bahan dalam ekstraksi DNA. 4 Seperangkat alat Pembuatan gel agarose. elektroforesis 5 UV transluminator Untuk mengamati pita DNA. 6 Freezer Untuk mengawetkan sampel. 7 PCR Untuk mengetahui deteksi DNA. 8 Mikrotube Untuk memisahkan supernatan dengan DNA. 9 Sisir/Comb Sebagai cetakan sumur/well elektroforesis. 10 Labu erlenmeyer Tempat larutan agarose. 11 Kertas parafilm Tempat pencampuran sampel ekstraksi DNA dengan loading dye sebelum dimasukkan pada sumur gel agarose.

Tabel 2. Bahan yang digunakan dalam Praktikum Analisis DNA pada Udang Windu (Penaeus monodon) No. Bahan Fungsi 1 Sampel DNA Sampel yang akan diamati pita DNAnya. 2 Nucleus lysis buffer 500 600 L Larutan untuk menambah densitas agar tedapat dalam sumur. 3 Proteinase K 4,3 L Enzim dalam ekstraksi DNA. 4 Larutan protein perification 200 Larutan dalam pembuatan ekstraksi L DNA.

5 6 7 8

Isopropanol 300L Ethanol 70%, 600 L Larutan TAE Loading dye

9 10 11 12 13

Marker DNA TNES Urea SDS 10% TE Buffer Gel red

Larutan untuk pemisahan superatan DNA. Larutan untuk mencuci. Bahan pembuatan gel agarose. Menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Sebagai pemberat agar sampel tidak mengapung pada gel agarose. Membersihkan ampas-ampas dna. Memisahkan DNA. Menjaga pH pada nilai tertentu. Pengganti etidium bromida, sebab etidium bromida bersifat karsinogenik.

Prosedur Kerja A. Isolasi DNA Udang Windu (Panaeus monodon) Penghancuran Sel (Cell Lysis) Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan ekstraksi DNA diautoclave. Sampel udang ditimbang sebanyak 10-20 mg, lalu dimasukkan ke dalam tabung evendorf (1,5 ml). 100-200 l Cell Lysis Solution ditambahkan ke dalam tabung yang diletakkan di atas es lalu jaringan digerus hingga homogen. Kemudian 200 l Cell Lysis Solution kembali ditambahkan ke dalam tabung dan dihomogenkan. 0,5 l Proteinase K ditambahkan ke dalam tabung dan diaduk dengan menggunakan pipet. Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 55 C selama 3-24 jam. Eliminasi RNA 10,5-1 l Rnase dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu diaduk dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 15-60 menit. Setelah inkubasi selesai, homogenat didinginkan pada suhu ruang.

Pengendapan Protein 30dalam larutan homogenat lalu

divortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik. Kemudian homogenat disentrifuse pada kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit hingga terbentuk endapan protein dan larutan yang mengandung DNA. Pengendapan DNA Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-hati ke dalam tabung baru yang telah berisi 20 Tabung yang

berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 50 kali hingga terlihat untaian pita DNA yang berwarna putih. Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit hingga terbentuk pelet DNA di dasar tabung. Larutan supernatan dibuang dan tabung dikeringkan di atas kertas tissue. 200 l Larutan Etanol 70 % dingin, kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi pelet DNA. Lalu tabung dibolak-balik beberapa kali untuk membilas sisa-sisa DNA yang berada di dinding tabung. Tabung disentrifuse pada kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati, lalu tabung dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara selama 15 menit. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan menambahkan 20 l akuades steril (SDW) ke dalam tabung. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer atau langsung digunakan untuk proses selanjutnya. Pengukuran Konsentrasi DNA dan RNA Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 10-20 kali (tergantung pada hasil ekstraksi). Alat Gene Quant dinyalakan, dan kuvet dikeluarkan dari tempat penyimpanan lalu dibilas dengan akuades. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur

tersebut ke dalam kuvet. Kemudian kuvet dimasukkan ke dalam alat, lalu tekan tombol set ref, hasil pembacaan akan menunjukkan nilai absorbansi 0,000. Dilanjutkan dengan pengukuran konsentrasi DNA atau RNA. Kuvet yang akan digunakan, dibilas terlebih dahulu dengan 20 l larutan DNA yang akan diukur. Setelah itu larutan asam nukleat yang akan diukur dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 70 l dan kuvet ditempatkan di dalam alat. Setelah tombol sample ditekan dan konsentrasi larutan sudah terbaca, kuvet dikeluarkan dan dibilas dengan akuades. B. Elektroforesis Gel Agarose Membuat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. Membuat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan e dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. Menyiapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (memastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki). Memasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki. Memeriksal suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 l jel red. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. Mengambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. Memasukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). Menyiapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki

elektroforesis.Memasukkan 10 l sampel DNA dan 2 l loading dye 6x ke dalam

sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. Membuat catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. Menghubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). Menyalakan sumber arus, aturlah volatse dan waktu running hingga diperoleh angka 80 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. Menjalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. Mengeluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). Menyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Gambar 6. Pita DNA pada Udang Windu (Panaeus monodon)

Pembahasan Hasil gambar di atas menunjukkan atau menejelaskan bahwa

hasilekstraksi DNA pada udang windu (Panaeus monodon) memiliki kemurnian karena tampak jelas pita DNAnya. Berdasarkan hasil uji PCR udang windu (Panaeus monodon) dengan menggunakan primer F. Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil pengamatan, larutan yang berisi strawberry dan buffer berwarna merah sesuai dengan warna buah strawberry. Penambahan buffer ekstraksi ini berfungsi untuk melisiskan membran sel. Dan penambahan SDS 20% bertujuan untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein sehingga DNA pada jaringan buah strawberry dapat diisolasi. Larutan dalam tabung tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vorteks. Dewasa ini, perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya dalam bidang bioteknologi dan biologi molekuler berlangsung sangat pesat. Berawal dari terungkapnya struktur dan fungsi DNA (Deoxyribonucleic acid) oleh Francis Crick

pada tahun 1958, kemudian disusul dengan ditemukannya enzim restriksi, pembuatan pustaka gen berdasarkan situs restriksi, cloning sekuen DNA pada organisme prokaryot, penggunaan berbagai macam penanda DNA (DNA marker) sampai akhirnya sintesis dan penggandaan DNA secara in vitro serta sekuen genom dan analisisnya (Kususwaty, 2007). Kajian keragaman genetik yang berdasarkan DNA mitokondria saat ini sangat berkembang karena DNA mitokondria mempunyai jumlah turunan yang tinggi (high copy number), mempunyai jumlah salinan sebesar 103-104 molekul DNA mitokondria/sel somatik. Ukuran DNA mitokondria kecil sehingga dapat dipelajari secara utuh. Genom DNA mitokondria mempunyai laju evolusi 5-10 kali lebih cepat dari DNA inti. Daerah D-loop DNA mitokondria adalah control region, yaitu daerah yang tidak mengkode protein. Dinamakan D-loop karena pada fragmen tersebut terdapat fragmen DNA dengan sruktur 3-rantai (membentuk hairpin), terbentuk akibat terciptanya rantai berat (H-strand) yang menggantikan rantai induk dan membentuk struktur tripleks D-loop (3-strand). Daerah yang membentuk hairpin/D-loop berdekatan dengan gen tRNAphe dan terdapat promotor (Heavy Strand Promotor/HSP dan Light Strand Promotor/ LSP) yang berfungsi sebagai transkripsi genom mitokondria, juga terdapat daerah OH (Origin of Replication) untuk rantai berat yang berfungsi awal replikasi (Clayton, 1992 dalam Sulandari dan Zein, 2008). Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekulmolekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju

perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk linear dan bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif secara seragam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet (Anonim, 2010). Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekulmolekul tersebut berukuran sama. Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Dalam Hasil pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai dan tidak terurai. Semakin sedikit DNA yang terurai, maka semakin baik hasil elektroforesis DNA nya (Anonim, 2010).

V. PENUTUP

Kesimpulan Dari hasil praktikum mengenai Analisis DNA pada Udang Windu (Panaeus monodon) dapat disimpulkan bahwa hasil ekstraksi DNA Udang windu (Panaeus monodon) adalah memilki kemurnian DNA karena tampak jelas pita pada gel agarose dalam pembacaan di UV transiluminator.

Saran Untuk pelaksanaan praktikum selanjutnya semoga dapat dilakukan proses ekstraksi DNA dan proses PCR secara langsung agar tidak lagi adanya kekurangan pengetahuan mengenai penggunaan teknologi.

DAFTAR PUSTAKA

Admin. 2011. Asam Nukleat. Online http://perikanan-hangtuah.blogspot.Com /2011/02/asam-nukleat.html. Pada hari kamis 2 mei 2013 pukul 23.46 di Universitas Hasanuddin. Anam, Khairul. 2010. Laporan I (Isolasi dan Pemetaan DNA Plasmid). Institut Pertanian Bogor. Anonim. 2010. Elektroforesis dan Isolasi DNA. Kurniawan, Dedy. 2003. Pengembangan Budidaya Tambak Udang Windu Berkelanjutan Dalam Perspektif Perundangan. Nuraisyah, Annisa. 2012. Analisis DNA. Online http://ichapiiz.blogspot.Com /2012/09/analisis-dna.html. Pada hari kamis 2 mei 2013 pukul 23.57 di Universitas Hasanuddin. Kusumawaty, Diah. 2001. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Program Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi UPI. Kusumawaty. 2007. Prinsip-Prinsip Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Aplikasinya. Kursus Singkat Isolasi dan amplifikasi DNA 20 Juni 2007. Pramono, Hendro. 2012. Elektroforesis Gel Agarosa Online http:// 02bios2unsoed.wordpress.com/tentang/acara-praktikum/3-elelektroforesis -dna/. Pada Hari Sabtu 4 mei 2013 di Universitas Hasanuddin. Prihatman, Kemal. 2000. Budidaya Udang Windu (Palaemonidae/ Penaeidae). Deputi Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi. Suparmuji. 2012. Insight Gen, DNA, dan Kromosom. Wahana Biologi. Sulandari, S dan M.S.A Zein. 2008. Analisis D-loop DNA Mitokondria untuk Memposisikan Ayam Hutan Merah dalam Domestikasi Ayam di Indonesia. Bidang Zoologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI.